CN113621051A - 重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法。所述检查方法采用pH7.0无菌氯化钠‑蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液作为稀释剂,能够真实反映由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生的重组人源化胶原蛋白中的微生物生长情况,提高重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查准确度。
Description
技术领域
本发明属于非无菌产品微生物限度检查技术领域,涉及一种重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法。
背景技术
微生物限度检查中使用的稀释剂对于微生物的检出率、微生物的生长及适用性均有影响,主要包括0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水。
0.9%无菌氯化钠溶液作为稀释剂的特点是其渗透压和人体血液相当,待在此稀释剂中的微生物就相当于待在血液中,不会因为渗透压而吸水破裂。
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,其最主要特点是“缓冲”,也就是在缓冲作用下pH变化不会非常大,起调节渗透压的作用,适合于对pH值敏感的微生物,此外蛋白胨会给微生物提供氮源、氨基酸和碳源等营养物质。
pH7.2磷酸盐缓冲溶液,由磷酸一氢盐和磷酸二氢盐的混合溶液组成,其中磷酸一氢盐是呈碱性的,而磷酸二氢盐是酸性的,当微生物分泌酸性物质时会与磷酸一氢盐反应成磷酸二氢盐,当分泌碱性物质时则与磷酸二氢盐成磷酸一氢盐,这样就使整个体系维持在一个pH较稳定的范围。由于磷酸缓冲液接近中性,恰在生理性pH范围,且成本较低,成为生命科学领域应用最广、最普及的无机盐缓冲液,也是免疫学、细胞生物学和分子生物学实验室必备的常用缓冲液之一。
重组人源化胶原蛋白为水溶性产品,能够促进成纤维细胞生长,溶水后可渗透至真皮,基因序列与人源胶原100%相同,具有抗敏性,促进细胞生长形成保护屏障,属于化妆品级,需按《化妆品安全技术规范》做微生物限度相关的检查。文献1采用0.9%无菌氯化钠溶液作为稀释剂,建立了重组人胶原蛋白微生物限度检查方法(李晓颖,侯增淼,史瑾,等.重组人胶原蛋白微生物限度检查方法的建设及验证[J].科技创新与应用,2017(35):98-99.)。然而上述文献中针对的重组人胶原蛋白为其公司生产的,对于不同的重组人源化胶原蛋白而言,由于发酵菌和发酵条件完全不同,蛋白存在差异,因此稀释剂不具有普适性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法。
实现本发明目的的技术方案如下:
重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法,包括以下步骤:
(1)以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液为稀释剂,对待检测的重组人源化胶原蛋白进行稀释,充分振荡混匀,静置,取其上清液作为菌检液,所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生;
(2)将菌检液注入到灭菌平皿内,然后将融化并冷却至45℃~50℃的胰酪大豆胨琼脂培养基倾注到灭菌平皿内,随即转动平皿,使菌检液与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置于36℃±1℃培养箱内培养3~5天;另取不加菌检液的空灭菌平皿,加入与菌检液等体积的稀释剂,并加入胰酪大豆胨琼脂培养基,待琼脂凝固后,翻转平皿,置36℃±1℃培养箱内培养3~5天,作为阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长,如果有菌生长应进行偏差调查。
本发明步骤(1)中,稀释倍数根据待检测的重组人源化胶原蛋白的含菌量进行调节,含菌量越高,稀释倍数越大。稀释倍数可以为1:10~1:10000。
本发明步骤(2)中,胰酪大豆胨琼脂培养基为本领域常规使用的胰酪大豆胨琼脂培养基,按胰酪大豆胨琼脂与水的比例为4g:100mL进行配制。
本发明步骤(2)中,菌检液与胰酪大豆胨琼脂培养基的体积比为1:15。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明通过使用不同稀释剂对重组人源化胶原蛋白进行微生物限度检查,比较不同的稀释剂对重组人源化胶原蛋白中微生物的检出率、微生物的生长及适用性,确定了针对本申请的重组人源化胶原蛋白而言,pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液均适宜作为稀释剂,提高重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查准确度。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详述。
实施例1
1、稀释剂和培养基的配制:
0.9%氯化钠溶液:氯化钠0.9g加蒸馏水至1000mL,溶解后分装,121℃高压灭菌20min。
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:取磷酸氢二钾3.56g,磷酸氢二钠7.23g,氯化钠4.30g,蛋白胨1.0g加纯化水1000mL溶解,灭菌。
pH7.2磷酸盐缓冲溶液:取pH7.2磷酸盐缓冲溶液粉末41g蒸馏水加至1000mL,121℃高压灭菌15min。
灭菌蒸馏水:蒸馏水分装,121℃高压灭菌20min。
胰酪大豆胨琼脂培养基:取胰酪大豆胨琼脂12g溶于300mL水中,置121℃高压灭菌20min。
2、供试品的控制菌检查中所使用的培养基的适应性检查
(1)菌种,采用的菌株及培养基如表1所示,试验用菌株的传代次数不得超过5代。
表1
试验菌株 | 菌株用培养基 | 特性 | 对照培养基 |
金黄色葡萄球菌 | 胰酪大豆胨琼脂培养基 | 促生长能力 | 甘露醇氯化钠琼脂培养基 |
(2)适应性检查:分别用0.9%氯化钠水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水作菌悬液,制成1mL不少于100cfu的金黄色葡萄球菌液,各取1mL接种于两个平板上,倾入胰酪大豆胨琼脂培养基,同时作阴性对照。另取两个平板各取1mL不少于100cfu的金黄色葡萄球菌液于两个平板上,倾入甘露醇氯化钠琼脂培养基,同时作阴性对照。同置30~35℃培养18~24小时,阴性对照试验应无菌生长,如果有菌生长应进行偏差调查。
(3)结果判断:24小时后检查被检培养基上的菌落数,不小于对照培养基上菌落平均数的70%,菌落形态大小与对照培养基上菌落一致,由此判断,培养基的适用性符合规定。
3、供试品的需氧菌检测
(1)称取重组人源化胶原蛋白(由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生)1.0g,分别加到装有玻璃珠及0.9%氯化钠水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水的三角瓶中,充分振荡混匀,静置15min。用其上清液作为1:10的菌检液,用灭菌吸管吸取1:10稀释2mL的菌检液,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿1mL。另取1mL注入到9mL 0.9%氯化钠水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水试管中(注意勿使吸管接触液面),更换一支吸管,并充分混匀,制成1:100菌检液。吸取2mL,分别注入到两个灭菌平皿内,每皿1mL。如样品含菌量高,还可再稀释成1:1000、1:10000等,每个稀释度应换1支吸管。将融化并冷却的胰酪大豆胨琼脂培养基(45℃~50℃)倾注到平皿内,每皿约15mL,随即转动平皿,使样品与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置36℃±1℃培养箱内培养3~5天。另取4个不加样品的灭菌空平皿,分别加入1mL 0.9%氯化钠水溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷酸盐缓冲溶液、纯化水,加约15mL胰酪大豆胨琼脂培养基,待琼脂凝固后,翻转平皿,置36℃±1℃培养箱内培养3~5天,为阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长,如果有菌生长应进行偏差调查。
(2)需氧菌的测定结果:
表2 0.9%氯化钠溶液作为稀释剂组
表3 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂组
表4 pH7.2磷酸盐缓冲溶液作为稀释剂组
表5 灭菌蒸馏水作为稀释剂组
由上述结果可知,由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris发酵产生的重组人源化胶原蛋白用0.9%氯化钠水溶液作稀释剂液,需氧菌落大小、形态特征,显示细菌生长稀少缓慢,不符合由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生的重组人源化胶原蛋白中的微生物生长的实际情况;用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作稀释剂,细菌生长良好;用pH7.2磷酸盐缓冲溶液作稀释剂液,微生物吸收相应营养,细菌生长良好;用纯化水作为稀释剂效果最不理想,微生物生长微弱、缓慢,不符合由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生的重组人源化胶原蛋白中的微生物生长的实际情况。
综上所述,由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生的重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查时,采用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液和pH7.2磷酸盐缓冲溶液作稀释剂液均适宜,可真实反映出重组人源化胶原蛋白中的微生物生长情况。
Claims (4)
1.重组人源化胶原蛋白的微生物限度检查方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲溶液为稀释剂,对待检测的重组人源化胶原蛋白进行稀释,充分振荡混匀,静置,取其上清液作为菌检液,所述的重组人源化胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵产生;
(2)将菌检液注入到灭菌平皿内,然后将融化并冷却至45℃~50℃的胰酪大豆胨琼脂培养基倾注到灭菌平皿内,随即转动平皿,使菌检液与培养基充分混合均匀,待琼脂凝固后,翻转平皿,置于36℃±1℃培养箱内培养3~5天;另取不加菌检液的空灭菌平皿,加入与菌检液等体积的稀释剂,并加入胰酪大豆胨琼脂培养基,待琼脂凝固后,翻转平皿,置36℃±1℃培养箱内培养3~5天,作为阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长,如果有菌生长应进行偏差调查。
2.根据权利要求1所述的微生物限度检查方法,其特征在于,步骤(1)中,稀释倍数可以为1:10~1:10000。
3.根据权利要求1所述的微生物限度检查方法,其特征在于,步骤(2)中,胰酪大豆胨琼脂培养基按胰酪大豆胨琼脂与水的比例为4g:100mL进行配制。
4.根据权利要求1所述的微生物限度检查方法,其特征在于,步骤(2)中,菌检液与胰酪大豆胨琼脂培养基的体积比为1:15。
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105802252A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-07-27 | 苏州景卓生物技术有限公司 | 一种胶原蛋白改性方法及使用所述方法制得的改性胶原蛋白 |
CN108148888A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-06-12 | 金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂 | 霉菌和酵母菌微生物限度检测方法 |
CN111235213A (zh) * | 2018-11-29 | 2020-06-05 | 广州迈达康医药科技有限公司 | 一种盐酸雷尼替丁胶囊的需氧菌总数检查法 |
CN111363779A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-03 | 华熙生物科技股份有限公司 | 交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法 |
CN111690709A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-09-22 | 北京鸿测科技发展有限公司 | 黄连配方颗粒的微生物限度检查方法 |
CN113046410A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-06-29 | 费森尤斯卡比华瑞制药有限公司 | 乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法 |
-
2021
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Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105802252A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-07-27 | 苏州景卓生物技术有限公司 | 一种胶原蛋白改性方法及使用所述方法制得的改性胶原蛋白 |
CN108148888A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-06-12 | 金花企业(集团)股份有限公司西安金花制药厂 | 霉菌和酵母菌微生物限度检测方法 |
CN111235213A (zh) * | 2018-11-29 | 2020-06-05 | 广州迈达康医药科技有限公司 | 一种盐酸雷尼替丁胶囊的需氧菌总数检查法 |
CN111363779A (zh) * | 2020-03-31 | 2020-07-03 | 华熙生物科技股份有限公司 | 交联或高分子量透明质酸类物质的微生物限度检测方法 |
CN111690709A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-09-22 | 北京鸿测科技发展有限公司 | 黄连配方颗粒的微生物限度检查方法 |
CN113046410A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-06-29 | 费森尤斯卡比华瑞制药有限公司 | 乙二胺四乙酸二钠的微生物限度检查方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
中国食品药品检定研究院: "《中国药品检验标准操作规范》", 31 August 2019, 中国医药科技出版社, pages: 438 - 444 * |
李晓颖等: "重组人胶原蛋白微生物限度检查方法的建设及验证", 《科技创新与应用》 * |
李晓颖等: "重组人胶原蛋白微生物限度检查方法的建设及验证", 《科技创新与应用》, no. 35, 18 December 2017 (2017-12-18), pages 98 * |
李阳等: "重组胶原蛋白的绿色生物制造及其应用", 《化工进展》 * |
李阳等: "重组胶原蛋白的绿色生物制造及其应用", 《化工进展》, vol. 40, no. 03, 13 January 2021 (2021-01-13), pages 1262 - 1275 * |
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