CN110904085B - 一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法 - Google Patents

一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法，包括：(1)种子菌斜面培养；(2)摇瓶培养：将(1)中已长好的斜面菌种接入摇瓶内，振荡培养；(3)种子罐培养：将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在通气条件下搅拌培养；(4)发酵罐培养：将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5％‑10％，在通气状态下搅拌培养，然后离心，收集菌体，即得门冬酰胺酶(埃希)菌体；所述发酵罐培养基、种子罐培养基和摇瓶培养基的组分均为：玉米浆、蛋白胨、谷氨酸钠。本发明中门冬酰胺酶表达量大，效价高，并且培养基中没有TSE/BSE风险因子，使得门冬酰胺酶的应用性更好，更加符合法规要求，原料药的成本也可大大降低。

Description

一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及为一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法。
背景技术
门冬酰胺酶是目前适用于治疗黑色素瘤、急性淋巴细胞系性白血病，也可以用于治疗单核细胞类别的急性白血病、淋巴细胞类别的慢性白血病、非何杰金病淋巴瘤等。来源于微生物的门冬酰胺酶比较常见，包括细菌、真菌、古生等。其中大肠杆菌来源的门冬酰胺酶能提供更加稳定的抗癌效果，而且生产成本也比较低廉。近些年来，随着基因工程技术的高速稳定发展，利用构建的门冬酰胺酶基因工程菌的报道日益增多，但都只是处于实验室小试阶段，并没有实现标准工业化生产的实例。主要原因是：①发酵放大工艺的不稳定，单位效价不高；②发酵培养基成分中含有牛肉来源的物质，会有可能引入TSE/BSE致病因子。
因此，对该门冬酰胺酶的生产进行进一步研发或开发以解决这些不足尤为重要。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷提供了一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法，旨在克服现有技术中发酵放大工艺的不稳定和培养基中牛肉来源存在TSE/BSE潜在危险的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
本发明的一个发明点是提供一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法，包括种子菌斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养； (1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种接种在LB固体培养基(平板) 上培养，培养结束后进行菌种筛选，之后在LB固体斜面培养基上进行培养；所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的组分一致，均为：按蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉；(2)摇瓶培养：将 (1)中已长好的斜面菌种接入摇瓶内，振荡培养；(3)种子罐培养：将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在通气条件下搅拌培养；(4)发酵罐培养：将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5％-10％，在通气状态下搅拌培养，然后离心，收集菌体；摇瓶培养基(步骤(2)中所用的培养基)、种子罐培养基(步骤(3)中所用的培养基)和发酵罐培养基(步骤(4)中所用的培养基) 的组分均为：玉米浆、蛋白胨、谷氨酸钠。
进一步地，所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基中各种组分的质量比例为：蛋白胨5～20g/L、酵母粉5～10g/L、氯化钠5～10 g/L、琼脂粉10～25g/L。优选蛋白胨7～15g/L、酵母粉4～7g/L、氯化钠4～7g/L、琼脂粉10～25g/L；更优选为：蛋白胨10g/L、酵母粉 5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉15g/L。
进一步地，所述发酵罐培养基、种子罐培养基和摇瓶培养基中各种组分的量相同，且pH 7.5-7.8。
进一步地，所述发酵罐培养基、种子罐培养基和摇瓶培养基中各种组分的质量比例为：20％玉米浆30～90g/L、蛋白胨5～20g/L、谷氨酸钠5～15g/L，pH 7.5-7.8；优选20％玉米浆30～60g/L、蛋白胨7～15g/L、谷氨酸钠4～12g/L，pH 7.6-7.8，更优选为20％玉米浆40g/L、蛋白胨10g/L、谷氨酸钠10g/L，PH7.5-7.8。
进一步地，在步骤(3)中所述的种子罐培养中，所通气的通气量为(2％-20％)v/v/min，优选(2％-15％)v/v/min。
进一步地，在步骤(4)中所述的发酵罐培养中，所通气的通气量为：菌密度*(0.5％-5％)L/min，优选菌密度*(0.5％-3％)L/min。
进一步地，所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的制备方法为：按蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉15g/L 配制1L的LB培养基，121℃灭菌30min，冷却至40-50℃，加入抗生素溶液，凝固，待用。
进一步地，所述大肠杆菌菌种为组成型表达的大肠杆菌。
进一步地，所述门冬酰胺酶的具体制备过程为：(1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种(组成型表达的大肠杆菌)用接种在LB固体培养基平板上，在37℃下培养12-24小时，培养结束后挑选单菌落进行菌种筛选，并选择高产酶的单菌落在LB固体斜面培养基上进行划线培养12-24小时；(2)摇瓶培养：摇瓶培养使用500ml摇瓶，装液量200ml。121℃灭菌30min，冷却后接入一定量的抗生素溶液及 (1)中已长好的斜面上的菌种，在37±2℃，转速200-250转/分的恒温培养器中振荡培养6-12小时；(3)种子罐培养：种子罐采用200 升发酵罐，以装量100升计，将100升已经配好的培养基加入该200 升发酵罐中，灭菌，待温度下降至37℃时，将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在37±2℃，转速100-200转/分，在通气条件下总共培养时间4-12小时；(4)发酵罐培养：发酵采用3000升发酵罐，实际装量为2000升，减去种子罐菌种100升，实际配培养基量为2000-100＝1900升，将1900升已经配好的培养基装于该3000 升罐中，灭菌，冷却至37℃时，将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5％-10％，在通气状态下，在37±2℃，转速 100-200转/分，总共培养时间6-20小时，然后离心，收集菌体。
本发明提供了一种门冬酰胺酶的制备方法，其主要具有的有益效果为：
在本发明中，通气量、培养基的组分以及培养基中各种组分的比例等是比较敏感的，对于组成型表达的大肠杆菌的菌密度的生长和酶的表达量都极其重要，改变上述培养基组分或组分间的比例，会降低菌密度的数值和酶的表达量。
本发明中门冬酰胺酶表达量大，且产酶能力可以达到100单位效价/毫升，使得门冬酰胺酶(埃希)的应用性更好，原料药的成本也可大大降低，故无论对于研发者还是对于医药生产商而言均属于极其利好的改进。
更重要的是，本发明培养基中没有TSE/BSE风险因子，使得门冬酰胺酶的应用更加符合法规要求。
而且，本申请的工艺可以放大化处理，放大以后同样不影响其效果，工艺和结果均稳定，工业应用意义和价值大。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种发酵制备门冬酰胺酶的方法，包括种子菌斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，具体过程如以下所示：
(1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种(组成型表达的大肠杆菌) 接种在LB固体培养基平板上，在37℃下培养18小时，培养结束后挑选单菌落进行菌种筛选，并选择高产酶的单菌落在LB固体斜面培养基上进行划线培养18小时；
所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的组分一致，均为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉15g/L；制备时，将按蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉15g/L配制成 LB培养基，121℃灭菌30min，冷却至45℃，加入一定量抗生素溶液，倒平皿(如30ml/皿)，凝固，冷藏待用。
(2)摇瓶培养：摇瓶培养使用500ml摇瓶，装液量200ml。121℃灭菌30min，冷却后接入一定量的抗生素溶液及(1)中已长好的斜面上的菌种，在37℃，转速200转/分的恒温培养器中振荡培养8小时；抗生素按现有技术种类添加便可。
(3)种子罐培养：种子罐采用200升发酵罐，以装量100升计，将100升已经配好的培养基加入该200升发酵罐中，灭菌，待温度下降至37℃时，将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在 38℃，转速160转/分，在通气条件下总共培养时间7小时，通气量为3L/min。
(4)发酵罐培养：发酵采用3000升发酵罐，实际装量为2000 升，减去种子罐菌种100升，实际配培养基量为2000-100＝1900 升，将1900升已经配好的培养基装于该3000升罐中，灭菌，冷却至37℃时，将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为 8％，在通气状态下，在36℃，转速200转/分，总共培养时间15小时，然后离心，收集菌体，通气量＝菌密度*10L/min。
所述发酵罐培养基、种子罐培养基和摇瓶培养基的组分均为： 20％玉米浆30g/L、蛋白胨10g/L、谷氨酸钠5g/L，pH 7.6。
发酵效价为92单位/毫升。
实施例2
一种发酵制备门冬酰胺酶的方法，包括种子菌斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，具体过程如以下所示：
(1)种子菌斜面培养：接种组成型表达的大肠杆菌菌种；
所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的组分和比例为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉15g/L；
(2)摇瓶培养：将一定量的抗生素溶液及(1)中已长好的斜面上的菌种接种至摇瓶培养基中，在35℃，转速200转/分的恒温培养器中振荡培养6-12小时；
(3)种子罐培养：种子罐采用200升发酵罐，装100升种子罐培养基，将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐培养基中，在 35℃，转速100转/分，在通气量为6L/min条件下培养时间4小时；
(4)发酵罐培养：3000升发酵罐，装量为2000升，将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵培养基中，接种量为9％，在通气状态下，在37℃，转速150转/分，总共培养时间18小时，然后离心，收集菌体，通气量＝菌密度*20L/min。
所述摇瓶培养基、种子罐培养基和发酵培养基的组分均为： 20％玉米浆40g/L、蛋白胨10g/L、谷氨酸钠10g/L，pH7.8。
在本实施例中，凡是没有特别写明的，均与实施例一致。
在本实施例中，步骤(3)和(4)的通气量以及步骤(1)～(4)中培养基的组分以及组分的比例等对于菌密度和酶的表达量影响很大。
发酵效价为100单位/毫升。
实施例3
一种发酵制备门冬酰胺酶的方法，包括种子菌斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，具体过程如以下所示：
(1)种子菌斜面培养：接种组成型表达的大肠杆菌菌种；
所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的组分一致，均为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、琼脂粉15g/L。
(2)摇瓶培养：摇瓶培养使用500ml摇瓶，装液量200ml。121℃灭菌30min，冷却后接入一定量的抗生素溶液及(1)中已长好的斜面上的菌种，在38℃，转速200转/分的恒温培养器中振荡培养6小时；
(3)种子罐培养：种子罐采用200升发酵罐，以装量100升计，将100升已经配好的培养基加入该200升发酵罐中，灭菌，待温度下降至37℃时，将(2)中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在 37℃，转速100转/分，在通气条件下总共培养时间8小时，通气量为10L/min；
(4)发酵罐培养：发酵采用3000升发酵罐，实际装量为2000 升；将(3)中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5％，在通气状态下，在38℃，转速100转/分，总共培养时间20小时，然后离心，收集菌体。通气量＝菌密度*30L/min。
所述发酵罐培养基、种子罐培养基和发酵培养基的组分均为： 20％玉米浆50g/L、蛋白胨10g/L、谷氨酸钠12g/L，PH7.6。
发酵效价为80单位/毫升。
对比例1
将实施例2中所有培养基中的蛋白胨换成牛肉浸膏(或牛肉膏)，其他的均一致。
酶的表达量减少，发酵效价为80单位/毫升。
对比例2
将实施例2中步骤(3)的通风量变为1L/min，步骤(4)的通气量变为菌密度*5L/min。
酶的表达量减少，发酵效价为75单位/毫升。
对比例3
将实施例2中摇瓶培养基、种子罐培养基和发酵培养基的pH变为微酸性6(或6.5等)。
酶的表达量减少，发酵效价为60单位/毫升。
对比例4
将实施例2中所有培养基均变为常用的玉米浆30g/L、酵母粉 5g/L、氯化钠5g/L，pH 7.4。
酶的表达量减少，发酵效价为55单位/毫升。
对比例5
将实施例2中发酵罐培养基、种子罐培养基和摇瓶培养基的组分均为：10％玉米浆30g/L、蛋白胨5g/L、谷氨酸钠5g/L，pH 7.6。
酶的表达量减少，发酵效价为60单位/毫升。
由上可知，本申请采用组成型表达的大肠杆菌来表达门冬酰胺酶，制备过程中的一些参数、是否通气和通气量、培养基的组成和比例、pH等均有密切的关系。通过实施例1-3中的方法制备的门冬酰胺酶的表达量非常高，可达到100单位/毫升，该效价属于本领域很满意很意外的数据。而对比例1-5的效价和表达量相对于实施例 2，下降非常明显，由此也可进一步说明，通气量和培养基等对本申请结果的重要性，且通气量和本申请中特别设计的培养基相互配合，二者的通过起作用，使得酶的表达量大大提升，任何一者的改变都会影响较大，因此，通气量和本申请中培养基的配合也是本发明最为重要的一个发明点。
在本发明中，大肠杆菌为组成型表达的大肠杆菌，由于胞内酶的表达会抑制菌的生长，从而导致发酵的菌密度不会太高，这是和诱导型表达的菌的重要区别。因此，本申请能够达到100u/ml，该量显著高于现有技术，无论是对于研究还是生产应用都具有极其重要的意义。
最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明 的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明 进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明 各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种发酵法制备门冬酰胺酶的方法，包括种子菌斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐培养，其特征在于：
(1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种接种在LB固体培养基上培养，培养结束后进行菌种筛选，并在LB固体斜面培养基上进行培养；
所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基的组分一致，均为：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉；
(2)摇瓶培养：将（1）中已长好的斜面菌种接入摇瓶内，振荡培养；
(3)种子罐培养：将（2）中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在通气条件下搅拌培养；
(4)发酵罐培养：将（3）中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5%-10%，在通气状态下搅拌培养，然后离心，收集菌体；
上述(2)~(4)中的摇瓶培养基、种子罐培养基和发酵罐培养基中的各种组分的质量比例均为：20%玉米浆30~90g/L、蛋白胨5~20g/L、谷氨酸钠5~15 g/L，pH 7.5-7.8；
在步骤(3)中所述的种子罐培养中，所通气的通气量为（2%-20%）v/v/min；
在步骤(4)中所述的发酵罐培养中，所通气的通气量为菌密度*（0.5%-5%）v/v/min；
所述大肠杆菌菌种为组成型表达的大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基中各种组分的质量比例为：蛋白胨5~20 g/L、酵母粉5~10 g/L、氯化钠5~10 g/L、琼脂粉10~25 g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：步骤(3)中的通气量为（2%-15%）v/v/min；步骤(4)中的通气量为：菌密度*（0.5%-3%）v/v/min。
4.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：所述LB固体培养基和LB固体斜面培养基，121℃灭菌30min，冷却至40-50℃，加入一定量抗生素溶液，凝固，冷藏待用。
5.根据权利要求1所述的发酵法制备门冬酰胺酶的方法，其特征在于：所述门冬酰胺酶的具体制备过程为：
(1)种子菌斜面培养：将大肠杆菌菌种接种在LB固体培养基平板上，在37℃下培养12-24小时，培养结束后挑选单菌落进行菌种筛选，并选择高产酶的单菌落在LB固体斜面培养基上进行划线培养12-24小时；
(2)摇瓶培养：摇瓶培养使用500ml摇瓶，装液量200ml，121℃灭菌30min，冷却后接入一定量的抗生素溶液及（1）中已长好的斜面上的菌种，在37±2℃，转速200 -250转/分的恒温培养器中振荡培养6-12小时；
(3)种子罐培养：种子罐采用200升发酵罐，以装量100升计，将100升已经配好的培养基加入该200升发酵罐中，灭菌，待温度下降至37℃时，将（2）中已培养好的摇瓶菌种接入种子罐中，在37±2℃，转速100-200转/分，在通气条件下总共培养时间4-12小时；
(4)发酵罐培养：发酵采用3000升发酵罐，实际装量为2000升，减去种子罐菌种100升，实际配培养基量为2000-100=1900升，将1900升已经配好的培养基装于该3000升罐中，灭菌，冷却至37℃时，将（3）中培养好的种子罐菌种移入发酵罐，接种量为5%-10%，在通气状态下，在37±2℃，转速100-200转/分，总共培养时间6-20小时，然后离心，收集菌体。
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