CN106868079A - 发酵硫酸多粘菌素b用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素b的方法 - Google Patents

发酵硫酸多粘菌素b用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素b的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供发酵硫酸多粘菌素B用培养基，每100ml培养基含有以下组份：面粉6～12g、高温淀粉酶0.03～0.06g、棉籽饼粉0.4～2g、玉米浆0.3～1g、磷酸氢二钾0.01～0.05g、硫酸铵0.2～0.6g、碳酸钙0.2～0.6g和消泡剂0.02～0.08ml，余量的水。发酵生产硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步骤：将产硫酸多粘菌素B菌种种子液接种到所述培养基中；将所述发酵液在26～32℃条件下发酵培养，发酵初始pH值6.7～7.4，期间控制发酵液的pH值自然，发酵液的溶氧量体积浓度为10％～30％。所述培养基各组分协同配合，使杂质B2P控制到低于1.5％。

Description

发酵硫酸多粘菌素B用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素B的 方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及发酵硫酸多粘菌素B用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素B的方法。
背景技术
硫酸多粘菌素B(PolymyxinBsulfate)，又称硫酸粘杆菌素B，是一种由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的氨基酸和脂肪组成的碱性琐环状多肽抗生素，几乎对所有革兰氏阴性菌均有较强的抑制或杀菌作用,如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌及痢疾杆菌等,尤其对绿脓杆菌有显著作用。世界上许多国家己批准该药作为饲料添加剂使用。硫酸多粘菌素B还作为药品使用，临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。
硫酸多粘菌素B是一种多组份物质，其中B1、B2、B3及B1-1是其主要成份，最新的EP标准及CP标准中均对成品的含量及有关物质作了如下的要求：
多年来，我国硫酸多粘菌素B一直依赖进口，为了改变现状，很多学者不断对硫酸多粘菌素B的生产方法进行摸索，其中包括对培养基的配方和对发酵条件中控制参数的优化，例如，田东等人在2010年在硫酸多粘菌素B菌种选育与发酵工艺的研究中报道了硫酸多粘菌素B的产量显著提高的方法，该方法解决了硫酸多粘菌素B产量低的问题。而目前，工业上采用微生物发酵法生产硫酸多粘菌素B，在发酵过程中产生的有关物质(杂质)也较多，很多杂质是主要成份的结构类似物，这些杂质在后续的提取操作过程中很难去除。例如在采用如下发酵培养基(糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、硫酸铵0.3g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、消泡剂0.04ml/100ml)发酵生产硫酸多粘菌素B时，经常会出现成品单杂超标的情况，该单杂在进行高压液相检测过程中出峰紧跟在B2的后面，命名为B2P。经分析发现，若发酵液高压液相检测过程中B2P的峰面积比例超过1.5％，那么发酵液经提取精制后制得的成品B2P含量就很可能超过3％。
发明内容
本发明提供发酵硫酸多粘菌素B用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素B的方法，将发酵液中可能影响成品质量的单杂B2P控制到低于1.5％的水平，从而使经该发酵液提取获得的成品质量符合EP8.0及CP2015的标准。
本发明为解决上述技术问题提供以下技术方案：
本发明提供了发酵硫酸多粘菌素B用培养基，每100ml培养基含有以下组份：面粉6～12g、高温淀粉酶0.03～0.06g、棉籽饼粉0.4～2g、玉米浆0.3～1g、磷酸氢二钾0.01～0.05g、硫酸铵0.2～0.6g、碳酸钙0.2～0.6g和消泡剂0.02～0.08ml，余量的水；所述玉米浆的质量百分含量为40～50％；所述培养基的pH值为6.7～7.4。
优选的，每100ml培养基含有以下组份：面粉8～11g、高温淀粉酶0.035～0.5g、棉籽饼粉0.8～1.5g、玉米浆0.4～0.8g、磷酸氢二钾0.012～0.03g、硫酸铵0.3～0.5g、碳酸钙0.25～0.5g和消泡剂0.04～0.06ml，余量的水。
优选的，每100ml培养基含有以下组份：面粉10g、高温淀粉酶0.04g、棉籽饼粉1g、玉米浆0.5g、磷酸氢二钾0.015g、硫酸铵0.4g、碳酸钙0.3g和消泡剂0.05ml，余量的水。
本发明提供了一种发酵生产硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步骤：
1)将产硫酸多粘菌素B菌种种子液接种到所述培养基中，得到接种有产硫酸多粘菌素B菌种的发酵液；
2)将所述步骤1)中得到的发酵液在26～32℃条件下进行发酵培养，发酵培养的条件包括：发酵液初始pH6.7～7.4，发酵过程中pH值自然，发酵液的溶氧量体积浓度为10％～30％。
优选的，所述步骤2)中发酵培养的温度为28～30℃。
优选的，所述步骤2)中发酵液的溶氧量体积浓度为15～25％。
优选的，所述步骤2)中发酵培养的时间为40～48h。
优选的，所述步骤1)中硫酸多粘菌素B菌种为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。
优选的，所述步骤1)中硫酸多粘菌素B菌种种子液的菌体OD600达到40～70。
优选的，所述步骤1)中接种量为5～15％。
本发明提供了发酵硫酸多粘菌素B用培养基，每100ml培养基含有以下组份含量：面粉6～12g、高温淀粉酶0.03～0.06g、棉籽饼粉0.4～2g、玉米浆0.3～1g、磷酸氢二钾0.01～0.05g、硫酸铵0.2～0.6g、碳酸钙0.2～0.6g和消泡剂0.02～0.08ml，余量的水。本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基，面粉在高温淀粉酶的酶解作用下得到酶解产物为微生物发酵提供碳源；棉籽饼粉为微生物发酵提供氮源；玉米浆中营养丰富，为微生物同时提供碳源和氮源；磷酸氢二钾、硫酸铵和碳酸钙为微生物发酵提供无机盐。同时本发明提供的所述培养基，通过严格控制各组分用量，各组分协同配合作用，使微生物发酵得到的目的产物纯度高，杂质率低，特别是单杂B2P控制到低于1.5％的水平，从而使成品质量符合EP8.0及CP2015的标准。
本发明提供了一种发酵生产硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步骤：1)将产硫酸多粘菌素B菌种种子液接种到所述培养基中；2)将所述步骤1)中接种有产硫酸多粘菌素B菌种的培养基在26～32℃，初始pH值6.7～7.4，发酵过程中pH值自然条件下进行发酵培养；所述发酵培养过程培养基的溶氧量的体积浓度为10％～30％。本发明通过严格控制发酵过程中发酵培养的温度、pH值和发酵过程的溶氧量来同时配合发酵培养基，从而确保硫酸多粘菌素B的生物代谢途径顺利进行，有效调节杂质特别是单杂B2P的产生，有效降低硫酸多粘菌素B产品中杂质率。本发明从发酵源头上有效地解决了成品单杂超标的问题。
具体实施方式
本发明提供了发酵硫酸多粘菌素B用培养基，每100ml培养基含有以下组份：面粉6～12g、高温淀粉酶0.03～0.06g、棉籽饼粉0.4～2g、玉米浆0.3～1g、磷酸氢二钾0.01～0.05g、硫酸铵0.2～0.6g、碳酸钙0.2～0.6g和消泡剂0.02～0.08ml，余量的水；所述玉米浆的质量百分含量为40～50％；所述培养基的pH值为6.7～7.4。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括面粉。以100ml培养基计，所述面粉的质量为6～12g，优选为8～11g，更优选为10g。所述面粉的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的面粉来源即可。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括高温淀粉酶。以100ml培养基计，所述高温淀粉酶的质量为0.03～0.06g，优选为0.035～0.05g，更优选为0.04g。所述高温淀粉酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的高温淀粉酶来源即可。本发明实施例中，所述高温淀粉酶购自山东隆科特酶制剂有限公司。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括棉籽饼粉。以100ml培养基计，所述棉籽饼粉的质量为0.4～2g，优选为0.8～1.5g，更优选为1g。所述棉籽饼粉的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的棉籽饼粉来源即可。所述棉籽饼粉的粒度优选为60～100目，更优选为80目。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括玉米浆。以100ml培养基计，所述玉米浆的质量为0.3～1g，优选为0.4～0.8g，更优选为0.5g。所述玉米浆的质量百分含量为40～50％，优选为45％。所述玉米浆的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的玉米浆来源即可。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括磷酸氢二钾。以100ml培养基计，所述磷酸氢二钾的质量为0.01～0.05g，优选为0.012～0.03g，更优选为0.015g。所述磷酸氢二钾的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的磷酸氢二钾来源即可。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括硫酸铵。以100ml培养基计，所述硫酸铵的质量为0.2～0.6g，优选为0.3～0.5g，更优选为0.4g。所述硫酸铵的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的硫酸铵来源即可。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括碳酸钙。以100ml培养基计，所述碳酸钙的质量为0.2～0.6g，优选为0.25～0.5g，更优选为0.3g。所述碳酸钙的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的碳酸钙来源即可。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括消泡剂。以100ml培养基计，所述消泡剂的体积为0.02～0.08ml，优选为0.04～0.06ml，更优选为0.05ml。所述消泡剂的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的消泡剂来源即可。本发明实施例中，所述消泡剂的种类为聚醚类消泡剂。
本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基的组分包括余量的水。所述水优选为蒸馏水、双蒸水、纯净水或超纯水。所述水的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的水来源即可。
本发明中，所述发酵硫酸多粘菌素B用培养基的pH值优选为初始pH6.7～7.4，发酵过程中pH值自然，更优选初始pH7.0。
本发明中，所述发酵硫酸多粘菌素B用培养基的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的组合物混料的技术方案即可。所述培养基制备后，优选进行灭菌。所述灭菌的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的灭菌方法即可。
本发明提供了一种发酵生产硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步骤：
1)将产硫酸多粘菌素B菌种种子液接种到上述技术方案所述培养基中，得到接种有产硫酸多粘菌素B菌种的发酵液；
2)将所述步骤1)中得到的发酵液在26～32℃条件下进行发酵培养，发酵期间控制发酵液的pH值为初始pH值6.7～7.4，发酵过程中pH值自然，发酵液的溶氧量体积浓度为10％～30％。
本发明将产硫酸多粘菌素B菌种种子液接种到上述方案的培养基中，得到接种有产硫酸多粘菌素B菌种的发酵液。
本发明中，所述产硫酸多粘菌素B菌种优选为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的Paenibacillus polymyxa菌株即可。本发明实施例中，所述多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa的来源为本公司自保藏菌株。
本发明中，所述产硫酸多粘菌素B菌种种子液的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的制备方法即可。所述产硫酸多粘菌素B菌种种子液的培养阶段为对数期末期。所述硫酸多粘菌素B菌种种子液的活菌浓度优选为选取处于对数生长期末期的菌体移种，此时的OD600达到40～70。所述接种量优选为5～15％，更优选为10％。
本发明中，所述接种的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的接种方案即可。
得到接种有产硫酸多粘菌素B菌种的发酵液，本发明将所述发酵液在26～32℃条件下进行发酵培养，发酵期间控制发酵液的pH值为初始pH值6.7～7.4，发酵过程中pH值自然，发酵液的溶氧量体积浓度为10％～30％。
本发明中，所述发酵培养的温度优选为28～30℃，更优选为29℃。
本发明中，所述发酵培养的时间优选为40～48h，更优选为45h。
本发明中，所述发酵液的溶氧量体积浓度优选为15～25％，更优选为20％。
本发明中，所述接种后发酵培养控制溶氧量的方法优选采用搅拌、通气、压力参数进行控制。所述搅拌的速度优选为50～200rpm，更优选为100rpm。所述通气量优选为1：0.2-1：0.5VVM，更优选为1：0.3VVM。所述压力优选为0.04～0.06MPa，更优选为0.05MPa。
本发明中，所述发酵培养过程中溶氧会逐步下降，调整搅拌、通气、压力参数控制溶氧量。发酵培养进行8～12小时后，溶氧量会逐步下降至30％左右。本发明中，控制方法优选先调搅拌后调通气量最后调整罐压的顺序对参数进行调整。
本发明中，发酵培养结束后，从发酵液提取硫酸多粘菌素B成品进行检测。所述硫酸多粘菌素B成品的提取方法没有特殊要求采用本领域技术人员所熟知的硫酸多粘菌素B成品的提取方案即可。
本发明中，所述检测方法优选采用外标法分别进行高压液相检测。所述高压液相检测的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的检测方案即可。
下面结合实施例对本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基及发酵生产硫酸多粘菌素B的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
种子液培养方法：将硫酸多粘菌素B斜面培养物用接种铲挖取约1cm2大小，接入摇瓶种子培养基中，其中摇瓶采用500ml三角瓶，内装70～80ml种子培养基，摇床转速220rpm、29℃条件下培养14～18小时。种子培养基组成为：面粉8g/100ml、酵母浸出粉0.3g/100ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、硫酸铵0.45g/100ml。
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：面粉10g/100ml、高温淀粉酶4g/100ml、棉籽饼粉1g/100ml、玉米浆0.5ml/100ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、硫酸铵0.4g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、消泡剂0.05ml/100ml，接种量7％，温度29℃，溶氧控制20％，培养44小时后结束发酵。
多黏菌素B组分高效液相色谱法：
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以硫酸钠溶液(取4.46g无水硫酸钠溶解在900ml水中，用稀磷酸调节pH值至2.3后用水稀释至1000ml)-乙腈(80：20)为流动相；柱温为30℃；检测波长为215nm。多黏菌素B1峰的保留时间约为35分钟，多黏菌素B2峰和多黏菌素B3峰的分离度应不小于3.0。
测定法取本品50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水-乙腈(80：20)溶解并定量稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取多黏菌素B标准品50mg，置100ml量瓶中，加水-乙腈(80：20)溶解并定量稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(a)；精密量取对照溶液(a)1ml，置100ml量瓶中，用水-乙腈(80：20)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(b)。精密量取上述三种溶液各2μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图至最大组分多黏菌素B1峰保留时间的1.4倍。色谱图中多黏菌素B2、多黏菌素B3、多黏菌素B1-Ⅰ、多黏菌素B1的相对保留时间分别约为0.5、0.55.、0.8、1.0。按外标法以相应峰面积计算，按干燥品计，多黏菌素B3的含量不得过6.0％，多黏菌素B1-Ⅰ的含量不得过15.0％，多黏菌素B1，B2，B3和B1-Ⅰ的总含量不得少于80％。
发酵液用稀硫酸溶液调pH2～5后，离心取上清液，按上述方法进行检测。
将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表1所示。
表1 实施例1中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 1.32 9.78 0.43 14.95 34.46 59.62
成品 2.89 17.49 1.05 16.93 50.41 85.88
由表1的结果可知，成品主要杂质B2P含量低于3％，符合EP及CP质量标准，有效组份总比例也符合相关的EP及CP质量标准。
实施例2
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：面粉8g/100ml、高温淀粉酶5g/100ml、棉籽饼粉0.8g/100ml、玉米浆0.8ml/100ml、磷酸氢二钾0.012g/100ml、硫酸铵0.5g/100ml、碳酸钙0.25g/100ml、消泡剂0.06ml/100ml，接种量10％，温度30℃，培养46小时后结束发酵。
将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表2所示。
表2 实施例2中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 1.43 9.27 0.75 13.0 33.7 56.72
成品 2.96 15.38 0.66 19.61 51.24 86.89
由表2的结果可知，成品主要杂质B2P含量低于3％，符合EP及CP质量标准，有效组份总比例也符合相关的EP及CP质量标准。
实施例3
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：面粉11g/100ml、高温淀粉酶3.5g/100ml、棉籽饼粉1.5g/100ml、玉米浆0.4ml/100ml、磷酸氢二钾0.03g/100ml、硫酸铵0.3g/100ml、碳酸钙0.5g/100ml、消泡剂0.04ml/100ml，接种量15％，温度28℃，培养42小时后结束发酵。
将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表3所示。
表3 实施例3中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 1.35 8.78 0.87 8.04 31.37 49.06
成品 2.25 17.30 0.79 13.93 54.23 86.25
由表3的结果可知，成品主要杂质B2P含量低于3％，符合EP及CP质量标准，有效组份总比例也符合相关的EP及CP质量标准。
实施例4
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：面粉6g/100ml、高温淀粉酶6g/100ml、棉籽饼粉0.4g/100ml、玉米浆1ml/100ml、磷酸氢二钾0.01g/100ml、硫酸铵0.6g/100ml、碳酸钙0.2g/100ml、消泡剂0.08ml/100ml，接种量15％，温度28℃，培养42小时后结束发酵。
将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表4所示。
表4 实施例4中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 1.76 9.43 0.99 10.02 34.17 56.37
成品 2.88 19.54 1.29 11.12 52.78 87.61
由表4的结果可知，成品主要杂质B2P含量低于3％，符合EP及CP质量标准，有效组份总比例也符合相关的EP及CP质量标准。
实施例5
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：面粉12g/100ml、高温淀粉酶3g/100ml、棉籽饼粉2g/100ml、玉米浆0.3ml/100ml、磷酸氢二钾0.05g/100ml、硫酸铵0.2g/100ml、碳酸钙0.6g/100ml、消泡剂0.02ml/100ml，接种量15％，温度28℃，培养42小时后结束发酵。
将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表5所示。
表5 实施例5中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 1.69 9.78 1.47 10.09 36.11 59.14
成品 2.83 16.32 2.07 12.45 51.16 84.83
由表5的结果可知，成品主要杂质B2P含量低于3％，符合EP及CP质量标准，有效组份总比例也符合相关的EP及CP质量标准。
为了说明本发明的有益效果，采用与实施例相同的菌种及原有配方进行发酵培养的情况见对比例。
对比例1
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、硫酸铵0.3g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、消泡剂0.04ml/100ml，接种量7％，温度29℃，培养44小时后结束发酵，将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表6所示。
表6 对比例1中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 3.56 16.1 1.05 10.2 36.39 63.74
成品 5.05 15.60 1.63 14.12 51.78 83.13
由表的结果可知成品有效组份符合EP及CP质量标准，但主要杂质B2P超过3％的规定，不符合相关的EP及CP质量标准。
对比例2
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、硫酸铵0.3g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、消泡剂0.04ml/100ml，接种量10％，温度30℃，培养46小时后结束发酵，将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表6所示。
表6 对比例2中发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 3.79 11.1 1.45 9.78 33.51 55.84
成品 5.00 16.10 1.12 15.18 51.87 84.27
由上表的结果可知成品有效组份符合EP及CP质量标准，但主要杂质B2P超过3％的规定，不符合相关的EP及CP质量标准。
对比例3
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、硫酸铵0.3g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、消泡剂0.04ml/100ml，接种量15％，温度28℃，培养42小时后结束发酵，将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表7所示。
表7 对比例3发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 4.11 12.5 1.79 8.11 36.75 59.15
成品 5.41 17.54 2.11 11.53 50.30 81.48
由上表的结果可知成品有效组份不符合EP及CP质量标准，主要杂质B2P超过3％的规定，也不符合相关的EP及CP质量标准。
对比例4
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：葡萄糖10g/100ml、蔗糖4g/100ml、胰蛋白胨2g/ml、磷酸氢二钾0.015g/100ml、硫酸铵0.4g/100ml、碳酸钙0.3g/100ml、消泡剂0.05ml/100ml，接种量7％，温度29℃，溶氧控制20％，培养44小时后结束发酵。将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表8所示。
表8 对比例4发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 3.73 11.75 1.55 9.49 33.43 59.95
成品 4.91 13.86 2.44 13.01 48.28 82.50
由上表的结果可知成品有效组份不符合EP及CP质量标准，主要杂质B2P超过3％的规定，也不符合相关的EP及CP质量标准。
对比例5
将硫酸多粘菌素B产生菌Paenibacillus polymyxa的种子培养物接入含有如下成份的发酵培养基中：面粉10g/100ml、高温淀粉酶9g/100ml、棉籽饼粉4g/100ml、玉米浆0.1ml/100ml、磷酸氢二钾0.05g/100ml、硫酸铵0.2g/100ml、碳酸钙0.6g/100ml、消泡剂0.05ml/100ml，接种量7％，温度29℃，溶氧控制20％，培养44小时后结束发酵。将发酵液及提取后的成品用外标法分别进行高压液相检测，结果各组份及杂质的峰面积比例如下表9所示。
表9 对比例6发酵产物各组份及杂质的峰面积比例
检测情况 有效组份总比例％
发酵液 3.46 13.15 1.72 8.51 30.36 57.2
成品 4.83 15.83 2.67 12.74 45.90 81.97
由上表的结果可知成品有效组份不符合EP及CP质量标准，主要杂质B2P超过3％的规定，也不符合相关的EP及CP质量标准。
由实施例1～5的实验数据可以看出，本发明提供的发酵硫酸多粘菌素B用培养基能够有效发酵生产目的产物-发酵硫酸多粘菌素B，并且各组分的含量以及单一B2P没有超过3％的规定，符合相关的EP及CP质量标准。
由对比例1～3与实施例1～5相比，通过改变产硫酸多粘菌素B菌种发酵过程中碳源和氮源的种类，能够有效避免发酵过程中杂质B2P的产生，有利于提高产品的纯度，从而提高产品的品质。
由对比例4与实施例1相比，对比例4通过选择微生物发酵培养过程中常用的碳源和氮源组合，并且其他组分相同的情况下，发酵产物检测结果显示，对比例4的方案不能克服杂质B2P的产生问题。由此可见，本申请的技术方案中各组分并不是单独发挥碳源和氮源的作用，而是各组分协同配合，从而确保硫酸多粘菌素B的生物代谢途径顺利进行，同时有效抑制杂质B2P的产生。
由对比例5与实施例1～5相比，对比例5的技术方案中选择与本发明相同的原料组分，但是原料含量与实施例1～5的方案中各组分的用量具有较大差异，对比例5的方案不能克服杂质B2P的产生问题。由此可见，本申请的技术方案中各组分是在一定配比的条件下发挥协同配合作用，有效抑制杂质B2P的产生，实现硫酸多粘菌素B的生物代谢途径顺利进行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.发酵硫酸多粘菌素B用培养基，其特征在于，每100ml培养基含有以下组份：面粉6～12g、高温淀粉酶0.03～0.06g、棉籽饼粉0.4～2g、玉米浆0.3～1g、磷酸氢二钾0.01～0.05g、硫酸铵0.2～0.6g、碳酸钙0.2～0.6g和消泡剂0.02～0.08ml，余量的水；所述玉米浆的质量百分含量为40～50％；所述培养基的pH值为6.7～7.4。
2.根据权利要求1所述的发酵硫酸多粘菌素B用培养基，其特征在于，每100ml培养基含有以下组份：面粉8～11g、高温淀粉酶0.035～0.05g、棉籽饼粉0.8～1.5g、玉米浆0.4～0.8g、磷酸氢二钾0.012～0.03g、硫酸铵0.3～0.5g、碳酸钙0.25～0.5g和消泡剂0.04～0.06ml，余量的水。
3.根据权利要求1或2所述的发酵硫酸多粘菌素B用培养基，其特征在于，每100ml培养基含有以下组份：面粉10g、高温淀粉酶0.04g、棉籽饼粉1g、玉米浆0.5g、磷酸氢二钾0.015g、硫酸铵0.4g、碳酸钙0.3g和消泡剂0.05ml，余量的水。
4.一种发酵生产硫酸多粘菌素B的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将产硫酸多粘菌素B菌种的种子液接种到权利要求1～3任意一项所述培养基中，得到接种有产硫酸多粘菌素B菌种的发酵液；
2)将所述步骤1)中得到的发酵液在26～32℃条件下进行发酵培养，发酵培养的条件包括：发酵液的初始pH6.7～7.4，发酵过程中pH值自然，发酵液的溶氧量体积浓度为10％～30％。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中发酵培养的温度为28～30℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中发酵液溶氧量体积浓度为15～25％。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中发酵培养的时间为40～48h。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中产硫酸多粘菌素B菌种为多粘类芽孢杆菌Paenibacilluspolymyxa。
9.根据权利要求5～8任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中硫酸多粘菌素B菌种种子液的菌体OD600达到40～70。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中接种量为5～15％。
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