CN109468355A - 一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法。包括以下步骤：（1）将斜面保藏的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999菌株接入装有种子培养基的摇瓶中，摇床恒温培养，得到含有菌体的种子液；（2）将种子液接入装有在原有培养基成分基础上添加了六偏磷酸钠或谷氨酸钠或同时添加了六偏磷酸钠和谷氨酸钠的发酵基础培养基的发酵罐中，接种量为4‑5％v/v，培养温度36‑37℃，通气量1‑1.5 vvm，搅拌转速为600‑700 rpm，发酵周期22‑24小时，结果：透明质酸产量达到4.1g/L,分子量1.56×106Da。本发明打破了菌体合成高分子量透明质酸能量和氨基供给水平的限制，提高了透明质酸分子量，为透明质酸的生产提供了新方法。

Description

一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid, HA) 是由葡萄糖醛酸与N-乙酰氨基葡萄糖组成的双糖单位重复连接而成的生物多糖。分子量显著影响其理化性质和应用效果。高分子量透明质酸具备优异的保湿性、粘弹性以及润滑作用，被广泛应用于医药及化妆品领域。微生物发酵法是目前透明质酸的主要生产方法，但是在工业生产中如何实现分子量的可控性仍是一个难题，这导致附加值较高的高分子量透明质酸产品，占发酵总产量的比例并不高。因此，提高微生物菌体合成透明质酸的分子量是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法，通过强化透明质酸合成的关键营养因子，打破高分子量透明质酸生产的技术瓶颈。
具体的，本发明的方法包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999菌株接入装有100mL的种子培养基的摇瓶中，摇床恒温培养，培养条件为：摇床转速220-250rpm，设定培养温度为36-37℃，培养时间为12-14小时，得到含有菌体的种子液；
其中，种子培养基的组成为：葡萄糖30g/L、酵母浸膏15g/L、大豆蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁1 g/L，种子培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（2）将种子液接入装有发酵基础培养基的发酵罐中，接种量为4-5％v/v，培养温度36-37℃，通气量1-1.5 vvm，搅拌转速为600-700 rpm，发酵周期22-24小时，得到透明质酸，其产量达到4.1g/L, 分子量1.56×106Da；
其中，发酵基础培养基的组成是：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，六偏磷酸钠4g/L；
或者，发酵基础培养基的组成是：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，谷氨酸钠3g/L；
或者，发酵基础培养基的组成是：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，六偏磷酸钠4g/L，谷氨酸钠3g/L。
本发明中，所述菌株马链球菌兽疫亚种BNCC3369999为商业化菌株，购自中国北京北纳创联生物技术研究院。
本发明的原理：马链球菌兽疫亚种合成高分子量透明质酸是一个高耗能的过程，能量供给不足是限制菌体合成高分子量透明质酸的主要原因之一，而高能物质六偏磷酸钠的加入打破了这一限制，促进了高分子量透明质酸的合成；此外，透明质酸作为典型氨基多糖其结构中氨基的供给往往也是其高分子量结构形成的一个限制因素，而培养基中加入谷氨酸钠可以很好解除氨基供给不足对高分子量透明质酸合成的限制。
本发明取得以下有益效果：通过添加六偏磷酸钠酸钠和谷氨酸钠，打破了菌体合成高分子量透明质酸能量和氨基供给水平的限制，促使通明质酸分子量提升了38.5%-64.1%，为高分子量透明质酸生产提供了新的有效方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明。
实施例1
（1）种子培养基的配制
种子培养基组成：葡萄糖30g/L、酵母浸膏15g/L、大豆蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁1 g/L，种子培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（2）发酵基础培养基的配制
发酵基本培养基组成：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸
膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，六偏磷酸钠酸钠4g/L，发酵培养基培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（3）将斜面保藏的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999菌株接入装有100mL的种子培养基的摇瓶中，摇床恒温培养，培养条件为：摇床转速250rpm，设定培养温度为37℃，培养时间为12-14小时；得到含有菌体的种子液。将种子液接入装有3.5L发酵基础培养基的5 L发酵罐中，接种量为5％v/v，培养温度37℃，通气量1.5 vvm，搅拌转速为700 rpm，发酵周期22-24小时，得到透明质酸，其产量为4.6g/L, 分子量2.23×106Da。分子量较传统方法提高了42.9%。
实施例2
（1）种子培养基的配制
种子培养基组成：葡萄糖30g/L、酵母浸膏15g/L、大豆蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁1 g/L，种子培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（2）发酵基础培养基的配制
发酵基本培养基组成：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸
膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，谷氨酸钠3g/L，发酵培养基培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（3）将斜面保藏的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999菌株接入装有100mL的种子培养基的摇瓶中，摇床恒温培养，培养条件为：摇床转速250rpm，设定培养温度为37℃，培养时间为12-14小时；得到含有菌体的种子液。将种子液接入装有3.5L发酵基础培养基的5 L发酵罐中，接种量为5％v/v，培养温度37℃，通气量1.5 vvm，搅拌转速为700 rpm，发酵周期22-24小时。得到透明质酸，其产量为4.4g/L, 分子量2.16×106Da。分子量较传统方法提高了38.5%。
实施例3
（1）种子培养基的配制
种子培养基组成：葡萄糖30g/L、酵母浸膏15g/L、大豆蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁1 g/L，种子培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（2）发酵基础培养基的配制
所述发酵基本培养基组成：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸
膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，六偏磷酸钠4g/L，谷氨酸钠3g/L，发酵培养基培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（3）将斜面保藏的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999菌株接入装有100mL的种子培养基的摇瓶中，摇床恒温培养，培养条件为：摇床转速250rpm，设定培养温度为37℃，培养时间为12-14小时；得到含有菌体的种子液。将种子液接入装有3.5L发酵基础培养基的5 L发酵罐中，接种量为5％v/v，培养温度37℃，通气量1.5 vvm，搅拌转速为700 rpm，发酵周期22-24小时。得到透明质酸，其产量为4.6g/L, 分子量2.56×106Da。分子量较传统方法提高了64.1%。
上述实施例中，培养基组成中的各组分的含量表述g/L指的是质量/体积浓度。
以上全部实施例所用的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999，均购自中国北京北纳创联生物技术研究院。

Claims (1)

1.一种提高发酵生产透明质酸分子量的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将斜面保藏的马链球菌兽疫亚种BNCC3369999菌株接入装有100mL的种子培养基的摇瓶中，摇床恒温培养，培养条件为：摇床转速220-250rpm，设定培养温度为36-37℃，培养时间为12-14小时，得到含有菌体的种子液；
其中，种子培养基的组成为：葡萄糖30g/L、酵母浸膏15g/L、大豆蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁1 g/L，种子培养基pH值灭菌前调节至7.2；
（2）将种子液接入装有发酵基础培养基的发酵罐中，接种量为4-5％v/v，培养温度36-37℃，通气量1-1.5 vvm，搅拌转速为600-700 rpm，发酵周期22-24小时，得到透明质酸，其产量4.1g/L, 分子量1.56×106Da；
其中，发酵基础培养基的组成是：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，六偏磷酸钠酸钠4g/L；
或者，发酵基础培养基的组成是：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，谷氨酸钠3g/L；
或者，发酵基础培养基的组成是：大豆蛋白胨10 g/L，葡萄糖75g/L，酵母浸膏 15 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，无水硫酸镁 0.6 g/L，六偏磷酸钠4g/L，谷氨酸钠3g/L。
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