CN109536550A - 一种透明质酸钠及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种透明质酸钠的制备方法，包括如下步骤：(A)将菌种在平板培养基上培养活化12‑24h；(B)将活化后的菌种按照5‑15wt％的接种量接种在发酵培养基上，通气量控制在1‑2vvm之间，发酵培养24h以上，即可。本发明的制备方法制备得到的透明质酸钠本身纯度高，属于高分子量范围的产品，该产品的获得进一步扩大了透明质酸钠的应用范围，可以形成良好的经济效益。

Description

一种透明质酸钠及其制备方法
技术领域
本发明涉及透明质酸钠加工领域，具体而言，涉及一种透明质酸钠及其制备方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，具有高度的保水、润肤及抗菌入侵的保护作用而广泛用作化妆品的添加剂。HA作为一种生化药物，主要用于治疗关节炎、眼科粘性手术、软组织修复以及外科手术后的粘性抑制剂等。HA是由D-葡糖醛酸和乙酰氨基-D-葡萄糖按1:1的摩尔比组成的酸性粘多糖。在细胞质膜内壁，在HA合成酶作用下，HA由尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡糖(UDP-GlcNAc)和尿苷二磷酸-葡糖醛酸(UDP-GlcA)两前提物合成。HA无种属差异性，无论何种来源，其结构和组成都是一样的，仅存在相对分子质量的差别。
当前，HA的生产仍然主要是动物组织提取法和微生物发酵法。动物组织提取法的原料受限、产量低、分离纯化过程复杂(含硫酸软骨素、硫酸葡胺聚糖等多糖杂质)，生产成本高，所获得的HA分子量也较小，不能满足市场需求。而微生物发酵法具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。但是，由于细菌自身代谢与产物表达之间的不平衡，严重制约了透明质酸的产量以及分子量的改变。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种透明质酸钠的制备方法，该制备方法通过对发酵工艺的合理规划，以及对发酵培养基的优化配制后，提高了透明质酸钠的产量，并且实现了对透明质酸钠的分子量进行控制，得到拥有理想的分子量区间的透明质酸钠，扩大透明质酸钠的应用领域，以寻求发酵过程中微生物自身生长与产物表达之间的平衡，该方法中涉及的众多参数均是发明人经过了大量实践得到的，通过将各个参数均调整到适宜的范围内，能够生产出品质优异的透明质酸钠。
本发明的第二目的在于提供上述制备方法制备得到的透明质酸钠，该透明质酸钠本身纯度高，属于高分子量范围的产品，该产品的获得进一步扩大了透明质酸钠的应用范围，可以形成良好的经济效益。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种透明质酸钠的制备方法，包括如下步骤：
(A)将菌种在平板培养基上培养活化12-24h；
(B)将活化后的菌种按照5-15wt％接种量接种在发酵培养基上，通气量控制在1-2vvm之间，发酵培养24h以上，即可。
本发明所提供的透明质酸钠的制备方法，通过对发酵工艺的合理规划，以及对发酵培养基的优化配制后，提高了透明质酸钠的产量，并且实现了对透明质酸钠的分子量进行控制，得到拥有理想的分子量区间的透明质酸钠，扩大透明质酸钠的应用领域，以寻求发酵过程中微生物自身生长与产物表达之间的平衡，该方法中涉及的众多参数均是发明人经过了大量实践得到的，通过将各个参数均调整到适宜的范围内，能够生产出品质优异的透明质酸钠。
需要说明的是，vvm:air volume/culture volume/min(通气比)是：每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。发酵罐中的通气量一般以vvm计，其中的气体体积以标准状态计。
其实，早期透明质酸的生产主要是从公鸡鸡冠中提取，目前主要采用微生物发酵法生产，链球菌作为主要生产菌株已在工业生产中得到了广泛的应用，主要原因在于发酵法HA生产具有成本低，且因发酵中HA处于游离状态易于纯化这一点特点。在医药级玻璃酸钠的应用中，对玻璃酸钠原料药有着高分子量的需求，同时，出于工业化生产应用的需要，对高产量的也有着一定的要求。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，平板培养基的组成为：脑心浸粉30-40g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖0.5-2.0g/L，琼脂10-15g/L。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，平板培养基上的培养温度控制在37-39℃之间。
平板培养基培养活化菌种，并获得更加纯化的菌种，本发明所采用的菌种为常用的链球菌，在菌种的选择上并没有大的改进。
实际培养时按照如下方式进行培养：配制平板培养基(脑心浸粉：30-40g/L；酵母浸粉：5-15g/L；葡萄糖：0.5-2.0g/L；琼脂：10-15g/L)，灭菌后倒平板，将工作种子接种在平板上，于37±2℃恒温培养箱中培养12-24小时。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，所述发酵培养基每400L包含的组成为：葡萄糖13-16kg，酵母浸粉6-9kg，硫酸镁0.6-1.3kg，磷酸二氢钠1.0-1.3kg，硫酸钾0.3-0.6kg，L-精氨酸16-23g，微量元素溶液0.9-1.3L，消泡剂15-23ml。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(B)中，发酵培养基的pH控制在6-14之间，温度为37-39℃之间，转速在60rpm以上。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，所述发酵培养基中分阶段添加葡萄糖，葡萄糖每间隔4-5h添加4-5kg。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，所述发酵培养基中补充的氢氧化钠与葡萄糖的质量比为(1.8-2.2)：1；
优选地，氢氧化钠配成浓度为3-5mol/L的氢氧化钠溶液，更优地浓度为4mol/L。
上述补充的氢氧化钠的质量是与补充的葡萄糖之间的质量比，而不是与配制发酵培养基所用的葡萄糖的质量比。
发酵培养的过程决定了后续透明质酸钠的产量以及所获得的分子量区间，因此其培养基的配制以及补糖、补碱的方式均需要按照本发明的方案操作，其中补碱的过程是持续进行的，因为透明质酸本身是呈酸性的，会影响体系的pH，所以需要持续的补碱，在补充过程中防止碱性太强，一般配置成碱溶液，碱溶液的浓度一般控制在3-5mol/L之间，不宜过高，防止对菌种有一定的损害，影响其发酵繁殖。
补糖的过程是每间隔4-5h添加4-5kg，通过对能量进行分阶段持续的补充一方面避免营养的富集化，另一方面能够促进菌种的持续正常的生长，最优的操作是每隔4h补充4kg的葡萄糖，一般发酵培养在24h以上，那么可分别在4小时、8小时、12小时、16小时，20小时、24小时的时间点上加入4kg的葡萄糖。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)与所述步骤(B)之间，还包括扩大培养的步骤：将活化后的菌种在摇瓶中培养后，再在种子培养基上继续扩大培养。
优选地，作为进一步可实施的方案，所述步骤(A)中，摇瓶中的培养基每3.5L包含的组成为：葡萄糖55-70g，硫酸镁4.5-7.3g，酵母浸粉43-63g，磷酸二氢钾4.6-6.7g，碳酸氢钠0.20-0.31g，磷酸盐缓冲液115-123ml，微量元素溶液2.4-3.3ml，消泡剂0.7-1.4ml；
优选地，所述种子培养基每25L包含的组成为：葡萄糖434-477g，硫酸镁42-49g，酵母浸粉431-485g，磷酸二氢钾41-47g，碳酸氢钠2.0-2.9g，磷酸盐缓冲液910-930ml，微量元素溶液17-30ml，消泡剂0.8-1.2ml。
本发明扩大培养的方法是通过摇瓶培养以及种子培养的两级扩大培养的方式，之所以需要扩大培养，是因为接种量的需要以及与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有积极的帮助作用。
本发明还提供了采用上述制备方法制备得到的透明质酸钠，采用上述制备方法制备得到的透明质酸钠的产量为12g/L以上，分子量为100-120Mw之间。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的透明质酸钠的制备方法通过对发酵工艺的合理规划，以及对发酵培养基的优化配制后，提高了透明质酸钠的产量，并且实现了对透明质酸钠的分子量进行控制，得到拥有理想的分子量区间的透明质酸钠，扩大透明质酸钠的应用领域，以寻求发酵过程中微生物自身生长与产物表达之间的平衡，该方法中涉及的众多参数均是发明人经过了大量实践得到的，通过将各个参数均调整到适宜的范围内，能够生产出品质优异的透明质酸钠。
(2)本发明采用上述制备方法得到的透明质酸钠本身纯度高，属于高分子量范围的产品，该产品的获得进一步扩大了透明质酸钠的应用范围，可以形成良好的经济效益。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
透明质酸钠的发酵方法具体包括如下步骤：
1)平板培养：
配制平板培养基(脑心浸粉：30g/L；酵母浸粉：15g/L；葡萄糖：0.5g/L；琼脂：15g/L)，灭菌后倒平板，将工作种子接种在平板上，于39℃恒温培养箱中培养24小时。
2)摇瓶培养：
配制摇瓶培养基3.5L[葡萄糖：70g，硫酸镁(七水)：7.3g，酵母浸粉：43-63g，磷酸二氢钾：4.6-6.7g，碳酸氢钠：0.31g，磷酸盐缓冲液：115ml(0.1mol/L磷酸二氢钠(二水)和0.1mol/L十二水合磷酸氢二钠等体积混合)，微量元素溶液：3.3ml，消泡剂：0.7ml]，用NaOH调节pH至7.2，按350ml/瓶将培养基分装于10个三角烧瓶中，灭菌待冷后，分别从平板培养基上刮取菌种接入，置于恒温摇床，设置转速不低于100rpm，37℃培养至OD净增值≥1.0。
3)种子培养：
加入种子培养基25L[葡萄糖：434g，硫酸镁(七水)：49g，酵母浸粉：431g，磷酸二氢钾：47g，碳酸氢钠：2.0g，磷酸盐缓冲液：910ml，微量元素溶液：17ml，消泡剂：0.8ml]；灭菌后按5％接种量，接种至种子罐中，在转速不低于70rpm、温度：37℃、通气量：1.5vvm的条件培养6h。
4)发酵培养：
配制发酵培养基400L[葡萄糖：16kg，酵母浸粉：9kg，硫酸镁(七水)：0.6kg，磷酸二氢钠(二水)：1.0kg，硫酸钾：0.3kg，L-精氨酸：16g，微量元素溶液：0.9L，Polyalcoxyether(消泡剂)：15ml]，灭菌后移种，按15wt％接种量，控制转速不低于60rpm；温度：37℃；pH：6.0；通气量：2vvm；
在发酵培养的4h、8h、12h、16h，20h、24h分别加入5kg葡萄糖，控制3mol/L的氢氧化钠与葡萄糖重量比为1.8：1。
实施例2
透明质酸钠的发酵方法具体包括如下步骤：
1)平板培养：
配制平板培养基(脑心浸粉：40g/L；酵母浸粉：5g/L；葡萄糖：2.0g/L；琼脂：10g/L)，灭菌后倒平板，将工作种子接种在平板上，于37℃恒温培养箱中培养12小时。
2)摇瓶培养：
配制摇瓶培养基3.5L[葡萄糖：55g，硫酸镁(七水)：4.5g，酵母浸粉：63g，磷酸二氢钾：4.6g，碳酸氢钠：0.20g，磷酸盐缓冲液：123ml(0.1mol/L磷酸二氢钠(二水)和0.1mol/L十二水合磷酸氢二钠等体积混合)，微量元素溶液：2.4ml，消泡剂：1.4ml]，用NaOH调节pH至7.3，按350ml/瓶将培养基分装于10个三角烧瓶中，灭菌待冷后，分别从平板培养基上刮取菌种接入，置于恒温摇床，设置转速不低于100rpm，39℃培养至OD净增值≥1.0。
3)种子培养：
加入种子培养基25L[葡萄糖：477g，硫酸镁(七水)：42g，酵母浸粉：485g，磷酸二氢钾：41g，碳酸氢钠：2.9g，磷酸盐缓冲液：930ml，微量元素溶液：30ml，消泡剂：1.2ml]；灭菌后按15％接种量，接种至种子罐中，在转速不低于70rpm、温度：39℃、通气量：1vvm的条件培养3h。
4)发酵培养：
配制发酵培养基400L[葡萄糖：13kg，酵母浸粉：6kg，硫酸镁(七水)：1.3kg，磷酸二氢钠(二水)：1.3kg，硫酸钾：0.6kg，L-精氨酸：23g，微量元素溶液：1.3L，Polyalcoxyether(消泡剂)：23ml]，灭菌后移种，按5wt％接种量，控制转速不低于60rpm；温度：39℃；pH：14.0；通气量：1.5vvm；
在发酵培养的4h、8h、12h、16h，20h、24h分别加入4kg葡萄糖，控制5mol/L的氢氧化钠与葡萄糖重量比为2.2：1。
实施例3
透明质酸钠的发酵方法具体包括如下步骤：
1)平板培养：
配制平板培养基(脑心浸粉：35g/L；酵母浸粉：10g/L；葡萄糖：1.5g/L；琼脂：12g/L)，灭菌后倒平板，将工作种子接种在平板上，于38℃恒温培养箱中培养20小时。
2)摇瓶培养：
配制摇瓶培养基3.5L[葡萄糖：65g，硫酸镁(七水)：6g，酵母浸粉：50g，磷酸二氢钾：5g，碳酸氢钠：0.25g，磷酸盐缓冲液：120ml(0.1mol/L磷酸二氢钠(二水)和0.1mol/L十二水合磷酸氢二钠等体积混合)，微量元素溶液：3.0ml，消泡剂：1.0ml]，用NaOH调节pH至7.3，按350ml/瓶将培养基分装于10个三角烧瓶中，灭菌待冷后，分别从平板培养基上刮取菌种接入，置于恒温摇床，设置转速不低于100rpm，37℃培养至OD净增值≥1.0。
3)种子培养：
加入种子培养基25L[葡萄糖：450g，硫酸镁(七水)：45g，酵母浸粉：450g，磷酸二氢钾：43g，碳酸氢钠：2.1g，磷酸盐缓冲液：920ml，微量元素溶液：20ml，消泡剂：1.0ml]；灭菌后按5wt％接种量，接种至种子罐中，在转速不低于70rpm、温度：39℃、通气量：1vvm的条件培养3h。
4)发酵培养：
配制发酵培养基400L[葡萄糖：13kg，酵母浸粉：6kg，硫酸镁(七水)：1.3kg，磷酸二氢钠(二水)：1.3kg，硫酸钾：0.6kg，L-精氨酸：23g，微量元素溶液：1.3L，Polyalcoxyether(消泡剂)：23ml]，灭菌后移种，按10wt％接种量，控制转速不低于60rpm；温度：39℃；pH：14.0；通气量：1.5vvm；
在发酵培养的5h、10h、15h、20h，分别加入5kg葡萄糖，控制4mol/L的氢氧化钠与葡萄糖重量比为2.0：1。
比较例1
具体操作步骤与实施例3一致，只是并没有分阶段的补充葡萄糖，而是一次性补充了葡萄糖20kg。
比较例2
具体操作步骤与实施例3一致，只是发酵培养基400L[葡萄糖：30kg，酵母浸粉：4kg，硫酸镁(七水)：1.3kg，磷酸二氢钠(二水)：1.3kg，硫酸钾：0.6kg，L-精氨酸：23g，微量元素溶液：1.3L，Polyalcoxyether(消泡剂)：23ml]。
实验例1
将上述实施例1-3以及比较例1-2的制备方法制备得到的透明质酸钠的含量以及相对分子量进行测定，具体结果如下表：
表1测定结果
组别 产量(g/L) 重均分子量
实施例1 14 100-150Mw
实施例2 15 100-150Mw
实施例3 14 100-150Mw
比较例1 12 100-120Mw
比较例2 12 100-120Mw
从上表中可以看出采用本发明的发酵方法不仅透明质酸钠的产量高，而且可以做到分子量可控，将透明质酸钠的分子量调整到可控的范围之内，得到了如此高分子量范围内的透明质酸钠，进一步扩大了其应用。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(A)将菌种在平板培养基上培养活化12-24h；
(B)将活化后的菌种按照5-15wt％接种量接种在发酵培养基上，通气量控制在1-2vvm之间，发酵培养24h以上，即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，平板培养基的组成为：脑心浸粉30-40g/L，酵母浸粉5-15g/L，葡萄糖0.5-2.0g/L，琼脂10-15g/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，平板培养基上的培养温度控制在37-39℃之间。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(B)中，所述发酵培养基每400L包含的组成为：葡萄糖13-16kg，酵母浸粉6-9kg，硫酸镁0.6-1.3kg，磷酸二氢钠1.0-1.3kg，硫酸钾0.3-0.6kg，L-精氨酸16-23g，微量元素溶液0.9-1.3L，消泡剂15-23ml。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(B)中，发酵培养基的pH控制在6-14之间，温度为37-39℃之间，转速在60rpm以上。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，所述发酵培养基中分阶段添加葡萄糖，葡萄糖每间隔4-5h添加4-5kg。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，所述发酵培养基中补充的氢氧化钠与葡萄糖的质量比为(1.8-2.2)：1；
优选地，氢氧化钠配成浓度为3-5mol/L的氢氧化钠溶液，更优地浓度为4mol/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)与所述步骤(B)之间，还包括扩大培养的步骤：将活化后的菌种在摇瓶中培养后，再在种子培养基上继续扩大培养。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(A)中，摇瓶中的培养基每3.5L包含的组成为：葡萄糖55-70g，硫酸镁4.5-7.3g，酵母浸粉43-63g，磷酸二氢钾4.6-6.7g，碳酸氢钠0.20-0.31g，磷酸盐缓冲液115-123ml，微量元素溶液2.4-3.3ml，消泡剂0.7-1.4ml；
优选地，所述种子培养基每25L包含的组成为：葡萄糖434-477g，硫酸镁42-49g，酵母浸粉431-485g，磷酸二氢钾41-47g，碳酸氢钠2.0-2.9g，磷酸盐缓冲液910-930ml，微量元素溶液17-30ml，消泡剂0.8-1.2ml。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的透明质酸钠；
优选地，所述透明质酸钠的产量为12g/L以上，分子量为100-120Mw之间。
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