CN112553277B - 一种提高硫酸多粘菌素b发酵水平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，包括发酵配方及补料发酵工艺。发酵配方分为由发酵碳源及无机盐组成的基础配方和由发酵氮源组成的补料配方。补料发酵工艺，包括以下部分：a）发酵罐单消灭菌，b）补料瓶单消灭菌，c)在发酵的前中期，匀速补入由发酵氮源组成的补料液。通过本方法进行发酵培养得到的硫酸多粘菌素B，发酵效价平均可达11000u/mL以上，比原发酵水平提高了30%以上，且发酵液组分比例接近标准品液相图谱，易于工业化生产。

Description

一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的发酵配方及补料发酵工艺。

背景技术

多粘菌素是一种由多粘芽孢杆菌所产生由多种氨基酸和脂肪酸组成的一族碱性环多肽类抗生素的总称。由于不同菌株产生化学结构不同的多粘菌素A、B、C、D、E。临床应用上市的产品主要是多粘菌素B和多粘菌素E的硫酸盐和甲磺酸盐。其中多粘菌素B的抗菌作用优于多粘菌素E。多粘菌素对革兰氏阴性细菌具有强烈的杀菌作用，由于其较大的肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞作用，导致这类药的临床应用主要以外用或局部用药为主。尤其是对防止烫伤和外科手术后感染绿脓杆菌及有耐药性的痢疾菌和由其他革兰氏阴性细菌引起的疾病，效果良好，药品使用安全性高。同时其作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后选择，用于治疗一些由革兰氏阴性菌引起的脑膜炎、痢疾等，且不产生耐药性。每年全球多粘菌素B外用药销售量稳定在4亿美元左右，随着合理给药方案的确立以及对毒性的进一步研究，多粘菌素B的临床应用将更加广泛。

目前多黏菌素B的生产均采用微生物发酵法。国内发酵生产厂家较少，发酵工艺及发酵水平整体较低,发酵效价基本都在8000u/mL以下。主要原因是多粘菌素B产生菌为多粘芽孢杆菌，该菌代谢快、培养周期短，发酵过程难进行精确调控。另外，国内发酵厂家所用发酵配方中，大都采用小麦面粉作为主要碳源。由于小麦面粉加量大、糊化过程时间较长，对消后发酵液中氮源质量的影响很大，因此有必要探索新的发酵配方及工艺。

发明内容

本发明的目的是为提高硫酸多粘菌素B的发酵水平，设计一种发酵高产配方及避免营养物质破坏的补料发酵工艺。

本发明的技术方案提供了一种发酵配方，所述发酵配方分为由发酵碳源及无机盐组成的基础配方和由发酵氮源组成的补料配方。基础配方为每升培养基组成：小麦面粉130-150g、淀粉酶0.10-0.12g、氯化钠0.7-0.9g、氯化镁0.9-1.1g、磷酸二氢钾0.6-0.8g、碳酸钙4-6g，消沫剂2-4mL，其余为水。补料配方为每升培养基组成：蛋白胨22-24g、玉米浆31-33g、硫酸铵35-37g，其余为水。

本发明所述发酵配方的小麦面粉为低筋小麦面粉，优选的浓度为140g/L。

本发明所述发酵配方的蛋白胨为骨蛋白胨，优选浓度为23g/L。

本发明所述发酵配方的玉米浆，干物质含量在30-50％，玉米浆使用前要进行预处理，将玉米浆溶于少量的水中，加热煮沸后过滤去除杂蛋白。优选浓度为32g/L。

本发明所述发酵配方的硫酸铵，优选浓度为36g/L。

本发明所述发酵配方的消沫剂为聚醚类泡敌，优选的浓度为3mL/L。

本发明的技术方案，还提供了一种碳氮源分消的补料发酵工艺，包括以下步骤：

a)基础配方的培养基采用发酵罐单消的灭菌方式。将由碳源及无机盐组成的基础发酵培养基溶于发酵罐中，于120-122℃消毒保压25-35min。

b)补料配方的培养基采用补料瓶单消的灭菌方式。将由发酵氮源组成的补料培养基溶于补料瓶中，于114-116℃消毒保压15-20min。

c)将培养好的种子液，以10％接种量接入上述发酵培养基中，在26-34℃下进行发酵培养。依据溶氧不低于20％的控制标准，将转速设为150-250rpm、通气比1：0.6-1.0VVM。在发酵的前中期，匀速补入由发酵氮源组成的补料液。

本发明所述补料发酵工艺步骤a)培养基灭菌前要进行糊化，优选糊化温度为90℃，糊化时间为40min。

本发明所述补料发酵工艺步骤a)的优选灭菌保压温度为121℃，保压时间30min。

本发明所述补料发酵工艺步骤b)的优选灭菌保压温度为115℃，保压时间15min。

本发明所述补料发酵工艺步骤c)温度采取变温控制，发酵开始至溶氧降至最低值时，温度控制在30-34℃，优选的控制32℃，当溶氧开始回升至发酵结束，将温度控制在26-30℃，优选的控制28℃。

本发明所述发酵工艺步骤c)的搅拌转速及通气量依据溶氧不低于20％的标准，优选的搅拌转速为200rpm、通气比1：0.8VVM。

本发明所述发酵工艺步骤c)的发酵周期，依据pH、菌体代谢情况及发酵液效价检测结果择时放罐。

本发明所述发酵工艺步骤c)的补料总体积，控制在发酵初始体积的10％左右。

本发明所述发酵工艺步骤c)的补料方式，采用匀速流加补入的方法。

本发明所述发酵工艺步骤c)的补料从发酵开始后即开始，补料流加速度为每小时流加发酵液初始体积的0.5-1.0％，补料周期为10-20h。优选流速为每小时流加发酵液初始体积的1.0％。

本发明采用碳氮源分消的补料发酵工艺，解决了发酵培养基灭菌时间较长对培养基营养物质的破坏，提高了消后培养基的质量。补料工艺的实施，使培养基营养物质更利于菌体利用并促进产物的合成，在效价显著提高的同时杂质未明显增加，达到了精确调控、高产多粘菌素B的目的。通过本方法进行发酵培养得到的硫酸多粘菌素B，发酵效价平均可达11000u/mL以上，比原发酵水平提高了30％以上，且发酵液组分比例接近标准品液相图谱，易于工业化生产。

附图说明

图1标准品效价图谱

图2对照组放罐效价图谱

图3实施例1放罐效价图谱

图4实施例2放罐效价图谱

图5实施例3放罐效价图谱

图6实施例4放罐效价图谱

图7实施例5放罐效价图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，但本发明的保护范围不能认为局限于下述具体实施方式。所属领域技术人员据此方式做出的工艺改进，均属于本发明的保护范畴。

所用的发酵罐为上海国强50L全自动发酵罐，所用的种子罐为上海国强15L全自动发酵罐，所用的其它设备全为常规仪器设备。

所用发酵原材料均为工业级原材料，来源为公司供应商集采。

以下实施例及对比例中所用种子培养基配方为：每升培养基组成：小麦面粉80g、淀粉酶0.1g、碳酸钙4g、蛋白胨2.5g、氯化钠0.9g、氯化镁0.6g、磷酸二氢钾0.8g、硫酸铵3.5g、消沫剂2mL，其余为水。

所用种子罐培养条件为：温度32℃，搅拌200rpm，通气比1:0.8VVM，发酵周期16-24h。

实施例1

按照下述配方配制发酵用培养基，采用本发明优选得到的培养基配比：基础配方为每升培养基组成：小麦面粉140g、淀粉酶0.11g、氯化钠0.8g、氯化镁1.0g、磷酸二氢钾0.7g、碳酸钙5g，消沫剂3mL，其余为水。补料配方为每升培养基组成：蛋白胨23g、玉米浆32g、硫酸铵36g，其余为水。

新工艺发酵过程按以下具体步骤实施：

a)将小麦面粉与淀粉酶，溶于适量水中，加入消沫剂，消前PH液碱调6.92后加入碳酸钙，90℃糊化40min后，121℃消毒保压30min，消后体积约27L。测得消后pH6.52，消后总糖10.44g/100ml。

b)将蛋白胨、玉米浆、硫酸铵溶于适量水中，补料瓶定容体积3L后，115℃消毒保压15min。

c)将按上述种子工艺培养好的种子液，以10％接种量接入上述发酵培养基中，将转速设为200rpm、通气比1：0.8VVM。发酵开始至溶氧降至最低值23.6％时，发酵温度控制32℃，当溶氧开始回升至发酵结束，温度控制28℃。同时，发酵开始后，采取补料瓶匀速流加的方式，流速控制在每小时流加发酵液初始体积的1.0％(300mL/h)，补料周期约10h。发酵35h时，镜检菌体老化，pH快速回升，放罐HPLC检测发酵液效价达11334u/mL。和采用原配方工艺的对比例得到的放罐效价8455u/mL相比较，效价提高了38％。

实施例2

在实施例1的工艺基础上考察不同配方及发酵温度对代谢的影响。实施例2基础配方为每升培养基组成：小麦面粉150g、淀粉酶0.12g、氯化钠0.9g、氯化镁0.9g、磷酸二氢钾0.6g、碳酸钙4g，消沫剂2mL，其余为水。补料配方为每升培养基组成：蛋白胨22g、玉米浆31g、硫酸铵35g，其余为水。和实施例1工艺不同之处为：发酵开始至溶氧降至最低值时，温度控制在34℃，当溶氧开始回升至发酵结束，温度控制30℃，发酵33h时，镜检菌体老化，pH快速回升，放罐HPLC检测发酵液效价达10786u/mL。和采用原配方工艺的对比例得到的放罐效价8455u/mL相比较，效价提高了36％。

实施例3

在实施例1的工艺基础上考察不同配方及发酵温度对代谢的影响。实施例3基础配方为每升培养基组成：小麦面粉130g、淀粉酶0.10g、氯化钠0.7g、氯化镁1.1g、磷酸二氢钾0.8g、碳酸钙6g，消沫剂4mL，其余为水。补料配方为每升培养基组成：蛋白胨24g、玉米浆33g、硫酸铵37g，其余为水。和实施例1工艺不同之处为：发酵开始至溶氧降至最低值时，温度控制在30℃，当溶氧开始回升至发酵结束，温度控制26℃，发酵38h时，镜检菌体老化，pH快速回升，放罐HPLC检测发酵液效价达11091u/mL。和采用原配方工艺的对比例得到的放罐效价8455u/mL相比较，效价提高了33％。

实施例4

在实施例1的工艺基础上考察不同补料速率对代谢的影响。实施例4和实施例1工艺不同之处为：发酵开始后，采取补料瓶匀速流加的方式，流速控制在每小时流加发酵液初始体积的0.5％(150mL/h)，补料周期约20h。发酵35h时，镜检菌体老化，pH快速回升，放罐HPLC检测发酵液效价达11634u/mL。和采用原配方工艺的对比例得到的放罐效价8455u/mL相比较，效价提高了27％。

实施例5

在实施例1的工艺基础上考察不同补料速率对代谢的影响。实施例5和实施例1工艺不同之处为：发酵开始后，采取补料瓶匀速流加的方式，流速控制在每小时流加发酵液初始体积的约0.75％(200mL/h)，补料周期约15h。发酵37h时，镜检菌体老化，pH快速回升，放罐HPLC检测发酵液效价达11516u/mL。和采用原配方工艺的对比例得到的放罐效价8455u/mL相比较，效价提高了31％。

对比例

按照下述配方配制发酵用培养基，原发酵工艺发酵培养基配比：为每升培养基组成：小麦面粉80g、淀粉酶0.1g、碳酸钙4g、蛋白胨2.5g、氯化钠0.9g、氯化镁0.6g、磷酸二氢钾0.8g、硫酸铵3.5g、消沫剂2mL，其余为水。

发酵过程按现有发酵工艺以下具体步骤实施：

a)将小麦面粉、淀粉酶等发酵物料依次加入溶于适量水的发酵罐中，加入消沫剂，消前PH液碱调6.90后加入碳酸钙，90℃糊化40min后，121℃消毒保压30min，消后体积约27L。测得消后pH6.65，消后总糖7.84g/100ml。

b)将按前述种子工艺培养好的种子液，以10％接种量接入上述发酵培养基中，将转速设为200rpm、通气比1：0.8VVM、温度32℃。发酵36h时，镜检菌体老化，pH快速回升，放罐HPLC检测发酵液效价达8455u/mL。

标准品及对比例、实施例1-5的液相检测图谱依次分别见附图1-7，由图可见实施例1-5中，产物效价显著提高，同时杂质并未明显增加。

Claims (4)

1.一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，包括发酵配方及补料发酵工艺，其特征在于：发酵配方分为由发酵碳源及无机盐组成的基础配方和由发酵氮源组成的补料配方；基础配方的每升培养基组成：小麦面粉130-150g、淀粉酶0.10-0.12g、氯化钠0.7-0.9g、氯化镁0.9-1.1g、磷酸二氢钾0.6-0.8g、碳酸钙4-6g，消沫剂2-4mL，其余为水；补料配方的每升培养基组成：蛋白胨22-24g、玉米浆31-33g、硫酸铵35-37g，其余为水；

补料发酵工艺包括以下步骤：

a）基础配方的培养基采用发酵罐单消的灭菌方式：将其溶于发酵罐中，于120-122℃消毒保压25-35min；

b）补料配方的培养基采用补料瓶单消的灭菌方式：将其溶于补料瓶中，于114-116℃消毒保压15-20min；

c）将培养好的种子液，以10%接种量接入以上所述基础配方的培养基中，进行发酵培养, 发酵温度采取变温控制：发酵开始至溶氧降至最低值时，温度控制在30-34℃，当溶氧开始回升至发酵结束，将温度控制在26-30℃；依据溶氧不低于20%的控制标准，将转速设为150-250rpm、通气比1：0.6-1.0VVM；在发酵的前中期，匀速补入补料配方的培养基；

步骤b）玉米浆使用前要进行预处理，将玉米浆溶于少量的水中，加热煮沸后过滤去除杂蛋白；

步骤c）补料方式采用补料瓶匀速流加的方法，补料流加速度为每小时流加发酵液初始体积的0.5-1.0%，补料量为发酵液体积的10%。

2.根据权利要求1所述的提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，其特征在于：所述基础配方中小麦面粉选用低筋小麦面粉。

3.根据权利要求1所述的提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，其特征在于：步骤a）所述培养基灭菌前，要进行糊化，糊化温度85-90℃,时间30-40min。

4.根据权利要求1所述的提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，其特征在于：所述基础配方为每升培养基组成：小麦面粉1 0g、淀粉酶0.11g、氯化钠0.8g、氯化镁1.0g、磷酸二氢钾0.7g、碳酸钙5g，消沫剂3mL，其余为水；补料配方为每升培养基组成：蛋白胨23g、玉米浆32g、硫酸铵36g，其余为水。

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