CN114164243A - 一种聚葡萄糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：(1)肠膜明串珠菌发酵培养：向蔗糖发酵培养基中接入肠膜明串珠菌种子培养液进行发酵，菌种进入对数生长期向上述发酵体系加入α‑葡聚糖酶，同时补加碳源流加液；(2)α‑葡聚糖酶催化水解调控聚葡萄糖分子量：待步骤(1)流加结束后，向发酵体系分步多次加入α‑葡聚糖酶。本发明的优点是：采用温和的生物法制备聚葡萄糖，避免化学法高温反应下焦糖色素、5‑羟甲基糠醛等副产物的生成；阶段性补加α‑葡聚糖酶，灵活调控产物分子量，且产物分布更集中；酶解不破坏糖苷键，产品品质稳定。
Description
技术领域
本发明属于多糖制备方法技术领域，涉及一种聚葡萄糖的制备方法。
背景技术
聚葡萄糖(Polydextrose)，又称聚糊精、聚右旋糖，俗名水溶性膳食纤维，是一种以D-葡萄糖为单体，以1,6-糖苷键缩合而成的聚合物，呈白色粉状或颗粒，易溶于水。至今已有五十多个国家批准其作为健康食品配料使用，被大量用于制造强化纤维食品；由于其低热量、低升糖指数、促进肠道益生菌增殖等保健功能，聚葡萄糖也可作为一种替代蔗糖的新型功能性糖源，被广泛用于食品、保健品、饮料等领域。
传统的聚葡萄糖的生产工艺是用食品级葡萄糖、山梨糖醇和柠檬酸以89:10:1的比例调配加热成熔融态混合物，再经真空缩聚、中和、脱色而得，平均分子量约3200，极限分子量＜22000，平均聚合度为20，需要的反应温度为130℃～295℃。该工艺需要高温条件反应，能耗高，易产生色素，产品纯度和色泽不稳定；且局部温度过高易导致产物分子量不均一，性能不稳定，给应用带来溶解性差、口感不好等问题。因此，不少学者对传统制备过程进行优化。
中国发明专利CN110922500A公开了一种低能耗的聚葡萄糖制备方法，使用转子泵将熔融状态的缩合物输送到喷嘴，解决了溶解慢的问题；将热的反应物喷到水中，节省了融化冷却的块状反应物所需的热量，降低能耗。中国发明专利CN102429148A公开了一种高纯度分子量可控聚葡萄糖的制备方法，该专利通过膜集成技术、色谱分离技术对分子量进行分段截取，得到不同分子量区间的均匀聚葡萄糖产品；该方法在140～190℃真空0.072-0.095MPa，反应1.5～4.5h得聚葡萄糖，进一步膜净化色谱分离使聚葡萄糖含量＞95％。该发明利用膜分离及色谱柱进行分子截取，费用成本高，难以实现工业化生产。中国发明专利CN103766695A也公开了一种分子量可控聚葡萄糖及其快速制备方法，该方法采用微波辅助固相合成技术制备聚葡萄糖，该方法缩合反应温度控制在95～250℃，微波频率2.45Hz，反应时间0.5～8min，得到聚葡萄糖，再经过粉碎纯化浓缩干燥得到聚葡萄糖产品。上述列举的方法虽然对现有工艺进行了改进，但仍需高温条件，未能从根本上解决能耗大、局部温度过高导致的产品分子量不均一、控制难的弊端。
一些学者也提出了新的制备方法，中国发明专利CN104561186A公开了一种肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，通过改变蔗糖和麦芽糖的比例调节产物的分子量，但分子量的控制存在不定向性，低聚葡萄糖产量仅60～70g/L，目标产物产量低，且最终产物成分复杂，混有甘露醇、果糖以及未利用完的麦芽糖、蔗糖，需离子交换、冷冻结晶及酵母培养等一系列措施进行低聚糖混合液的除杂，工序繁杂。因此，开发一种低能耗、高产量、分子量可灵活调控、产物分子量均一度高的聚葡萄糖的制备方法是十分迫切的。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种聚葡萄糖的制备方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种聚葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)肠膜明串珠菌发酵培养：
向蔗糖发酵培养基中接入肠膜明串珠菌种子培养液进行发酵，菌种进入对数生长期时向上述发酵体系加入α-葡聚糖酶，同时补加蔗糖流加液；
(2)α-葡聚糖酶催化水解调控聚葡萄糖分子量：
待步骤(1)流加结束后，向发酵体系采用阶段式加入α-葡聚糖酶，继续发酵得到分子量Mw＜5000Da、分布系数小于2.5的聚葡萄糖。
进一步地，步骤(1)中所述肠膜明串珠菌种子培养液的制备包括以下步骤：
S1：菌种活化，将肠膜明串珠菌冻干粉剂用无菌生理盐水溶解，吸菌液在斜面培养基上划线，静置培养；
S2：种子培养，将S1中活化好的肠膜明串珠菌用接种环挑取菌落接种于种子培养基培养得到所述肠膜明串珠菌种子培养液；
优选地，所述斜面培养基的组成为：10～15％蔗糖、0.2～0.6％蛋白胨、0.10～0.16％Na2HPO4·12H2O、0.01～0.05％KH2PO4、1.5％～2％琼脂、余量为水，优选为13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4·12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数；
优选地，所述菌种活化的培养条件为：温度25～30℃，培养时间24～48h，优选为温度25℃，培养时间48h；
优选地，所述种子培养基的组成为：10～15％蔗糖、0.2～0.6％蛋白胨、0.10～0.16％Na2HPO4·12H2O、0.01～0.05％KH2PO4、余量为水，优选为10.0％蔗糖、0.5％蛋白胨、0.1％Na2HPO4·12H2O、0.01％KH2PO4、余量为水，其中的百分数为质量百分数；
优选地，所述种子培养的培养条件为：温度25～30℃，培养时间24～48h，摇床转速80～120r/min，优选为温度25℃，培养时间24h，摇床转速80r/min。
进一步地，步骤(1)中所述蔗糖发酵培养基的组成为：10～15％蔗糖、0.1～1.0％葡萄糖、0.2～0.5％蛋白胨、0.1～0.2％无机氮源、0.10～0.16％Na2HPO4·12H2O、0.01～0.05％KH2PO4、余量为水，优选为10％蔗糖、0.1％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.1％无机氮源、0.1％Na2HPO4·12H2O、0.01％KH2PO4、余量为水，其中的百分数为质量百分数；
优选地，所述无机氮源选自(NH4)2SO4、NaNO3和尿素中的一种或者至少两种的组合，优选为NaNO3。
进一步地，步骤(1)中所述发酵的条件为：发酵温度为25～30℃，培养时间为18～35h，pH为5.0～6.5，搅拌速率为80～120r/min，微量通气；
优选地，所述发酵温度为25℃；
优选地，所述培养时间为18～30h；
优选地，所述搅拌速率为80r/min；
优选地，通气量为0.5～1.0L/min。
进一步地，步骤(1)中所述肠膜明串珠菌种子培养液的体积为蔗糖发酵培养基体积的8～10％。
进一步地，步骤(1)中所述菌种进入对数生长期为发酵体系粘度迅速增长时期，优选为发酵8～18h，更优选为12h。
进一步地，步骤(1)中所述α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为0.1～2.5U/mL，优选为2.0-2.5U/mL。
进一步地，步骤(1)中所述补加蔗糖流加液维持发酵体系中的蔗糖残留为40～60g/L；
优选地，步骤(1)中所述补加蔗糖流加液的速率为10～20g/L/h(即单位时间内向单位体积发酵体系中补加的蔗糖干基质量)，优选为16g/L/h；
优选地，所述蔗糖流加液配制锤度为45～70°Bx，优选为66°Bx。
进一步地，步骤(1)中所述发酵过程进行两阶段pH调控：第一阶段，发酵开始时pH自然发酵；第二阶段，加酶后调控pH为5.0～6.5；
优选地，第一阶段，发酵开始时pH值为6.5；第二阶段，加酶后调控pH为5.5。
进一步地，步骤(2)中所述采用阶段式加入α-葡聚糖酶为分步多次向发酵体系加入α-葡聚糖酶，所述加入α-葡聚糖酶的次数大于等于2；所述α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为2.0～12.0U/mL；
优选地，步骤(2)具体为：待步骤(1)流加结束后，加入α-葡聚糖酶，α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为2.0～3.5U/mL；流加结束后3h再次加入α-葡聚糖酶，α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为2.0～3.5U/mL，继续发酵得到分子量Mw＜5000Da、分布系数为1.4～1.8的聚葡萄糖。
进一步地，所述α-葡聚糖酶选自专一性裂解右旋糖酐分子中的α-1,6葡萄糖苷键的水解酶。
进一步地，步骤(2)使用GPC凝胶色谱分析测定聚葡萄糖分子量以及蔗糖残留、果糖生成浓度情况，结束发酵；
优选地，步骤(2)发酵结束的标志为：利用GPC分析监测蔗糖残留及果糖生成变化及聚葡萄糖分子量，当蔗糖残留变化在0.1～0.5g/L时或者果糖生成浓度不升反降低时，且聚葡萄糖分子量达标时，标志发酵结束。
本发明的有益效果是：
本发明建立了一种生物法替代化学合成法制备聚葡萄糖的方法，工艺简单、清洁，是一种低能耗的聚葡萄糖制备的理想途径；本发明提供了一种改良蔗糖培养基培养肠膜明串珠菌，并通过加入α-葡聚糖酶，克服多糖阻碍传质难题，得到的聚葡萄糖产品浓度可达90g/L；
本发明通过分步多次加酶，灵活调控产物分子量，分子量更集中，且总用酶量减少(本领域技术人员一般认为加酶量越多，产物分子量越小、越集中，而本申请通过分步多次加酶，实现了用酶量少、产物分子量更加集中的目的，具有不可预见性。)，直接得到符合产业要求的产物，无需乙醇分级等步骤即可得到系列聚葡萄糖产品，简便易操作；
本发明通过酶催化作用进行产物的合成与降解，不破坏糖苷键，产物结构较为均一，性能稳定，避免了高温反应下产生焦糖色素、5-羟甲基糠醛等副产物的生成，提升产品品质；
本发明制备的聚葡萄糖作为膳食纤维类配料的食品添加剂，可用于添加到各种食品中，例如应用于无糖糖果、乳制品、功能饮料、调味品及烘焙食品等制作中；
本发明除应用于食品行业外，也可制备口服液、冲剂等直接服用的保健品，以及用于日化品、饲料以及复混肥料等行业。
附图说明
图1为对比例1条件下蔗糖残留、果糖及聚葡萄糖浓度变化的结果图。
图2为对比例2条件下蔗糖残留、果糖及聚葡萄糖浓度变化的结果图。
图3为对比例3条件下蔗糖残留、果糖及聚葡萄糖浓度变化的结果图。
图4为实施例1条件下蔗糖残留、果糖及聚葡萄糖浓度变化的结果图。
图5为实施例2条件下蔗糖残留、果糖及聚葡萄糖浓度变化的结果图。
图6为对比例2(不加酶)、对比例3(一次性加酶-是以流加后加酶次数来算的)以及实施例2(分步多次加酶)产物分子量分布情况的凝胶色谱对比图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
对比例1
菌种活化：
从-80℃取出的安剖管保存的肠膜明串珠菌菌种粉末，用无菌生理盐水溶解，以划线法接种于装有斜面培养基的试管，25℃培养箱中培养48h；斜面培养基的组成为：13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4.12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数，分装于试管中，5ml/管，121℃灭菌15min。
种子培养：
取一支上述活化好的试管，挑取两环接种于装有种子培养基的摇瓶，25℃，80r/min，摇床培养24h得到肠膜明串珠菌种子培养液。种子培养基的组成为：39.0g的蔗糖、0.6g的蛋白胨、0.42g Na2HPO4·12H2O和0.09g KH2PO4、259.89g水，配制好后121℃高压灭菌15min。
聚葡萄糖的制备：
将培养好的肠膜明串珠菌种子培养液转接入5L发酵罐的蔗糖发酵培养基(蔗糖发酵培养基的组成为：390.0g的蔗糖、6.0g蛋白胨、4.2g Na2HPO4·12H2O和0.9g KH2PO4、2598.9g水，配制好后121℃高压灭菌15min。)中进行发酵，25℃，80r/min，通气量为1.0L/min，定时取样分析蔗糖残留、果糖、聚葡萄糖含量，结果如图1所示，发酵18h，发酵结束，蔗糖转化率为65.4％，蔗糖消耗速率为4.72g/L/h，聚葡萄糖产量为27.02g/L。
对比例2
菌种活化：
从-80℃取出的安剖管保存的肠膜明串珠菌菌种粉末，用无菌生理盐水溶解，以划线法接种于装有斜面培养基的试管，25℃培养箱中培养48h；斜面培养基的组成为：13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4.12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数，分装于试管中，5ml/管，121℃灭菌15min。
种子培养：
取一支上述活化好的试管，挑取两环接种于装有种子培养基的摇瓶，25℃，80r/min，摇床培养24h得到肠膜明串珠菌种子培养液。种子培养基的组成为：30.0g的蔗糖、1.5g的蛋白胨、0.3g Na2HPO4·12H2O和0.03g KH2PO4、238.17g水，配制好后121℃高压灭菌15min。
聚葡萄糖的制备：
将培养好的肠膜明串珠菌种子培养液转接入5L发酵罐的蔗糖发酵培养基(蔗糖发酵培养基的组成为：300.0g的蔗糖、3g葡萄糖、9.0g蛋白胨、3.0g NaNO3、3.0g Na2HPO4·12H2O和0.3g KH2PO4、2381.7g水，配制好后121℃高压灭菌15min。)中进行发酵，25℃，80r/min，通气量为1.0L/min，定时取样分析蔗糖残留、果糖、聚葡萄糖含量，结果如图2所示，发酵16h，发酵结束，蔗糖转化率为91.8％，蔗糖消耗速率为5.74g/L/h，聚葡萄糖产量为30g/L。产物分子量分布情况的凝胶色谱如图6所示，经GPC凝胶色谱分析测定多糖分子量仍约为百万级，分散系数75.32，不适于直接应用于食品添加。
该对比例中使用的蔗糖发酵培养基与对比例1中所使用的蔗糖发酵培养基不同，从发酵时间、蔗糖转化率、蔗糖消耗速率、聚葡萄糖产量等指标进行衡量，突出了该对比例中蔗糖发酵培养基所带来的有益效果，即发酵时间短，蔗糖转化率高、蔗糖消耗速率快，聚葡萄糖产量高。
对比例3
菌种活化：
从-80℃取出的安剖管保存的肠膜明串珠菌菌种粉末，用无菌生理盐水溶解，以划线法接种于装有斜面培养基的试管，25℃培养箱中培养48h；斜面培养基的组成为：13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4·12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数，分装于试管中，5mL/管，121℃灭菌15min。
种子培养：
取一支上述活化好的试管，挑取两环接种于装有种子培养基的摇瓶，25℃，80r/min，摇床培养24h得到肠膜明串珠菌种子培养液。种子培养基的组成为：30.0g的蔗糖、1.5g蛋白胨、0.3g Na2HPO4·12H2O和0.03g KH2PO4、238.17g水，配制好后121℃高压灭菌15min。
聚葡萄糖的制备：
蔗糖发酵培养基配方为：300.0g的蔗糖、3g葡萄糖、9.0g蛋白胨、3.0g NaNO3、3.0gNa2HPO4·12H2O和0.3g KH2PO4、2381.7g水，121℃灭菌15min，待温度降至25℃，接入300mL肠膜明串珠菌种子培养液后开始发酵，搅拌速率80r/min，通气量1.0L/min。发酵至12h，向发酵体系加入α-葡聚糖酶，酶与发酵液的酶活体积比为0.1U/ml，开始以16g/L/h流加速率补加含蔗糖质量600g的蔗糖流加液，维持发酵液中的残糖含量为40～60g/L，同时进行pH两阶段调控，发酵开始时pH自然发酵，首次加酶后调控pH维持在5.5。
待流加结束后向发酵体系一次性加入α-葡聚糖酶，使酶与发酵液的酶活体积比为10.8U/mL。定时取样分析蔗糖残留、果糖、聚葡萄糖含量，结果如图3所示，发酵30h，蔗糖残留基本不变，结束发酵，发酵液中产物浓度为89.3g/L。产物分子量分布情况的凝胶色谱如图6所示，根据GPC凝胶色谱分析测定，产物分子量集中在997Da、4299Da两个区间，产物分子量均一度不高，分布系数2.65。
实施例1
菌种活化：
从-80℃取出的安剖管保存的肠膜明串珠菌菌种粉末，用无菌生理盐水溶解，以划线法接种于装有斜面培养基的试管，25℃培养箱中培养48h；斜面培养基的组成为：13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4·12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数，分装于试管中，5mL/管，121℃灭菌15min。
种子培养：
取一支上述活化好的试管，挑取两环接种于装有种子培养基的摇瓶，25℃，80r/min，摇床培养24h得到肠膜明串珠菌种子培养液。种子培养基的组成为：30.0g的蔗糖、1.5g蛋白胨、0.3g Na2HPO4·12H2O和0.03g KH2PO4、238.17g水，配制好后121℃高压灭菌15min。
聚葡萄糖的制备：
蔗糖发酵培养基配方为：300.0g的蔗糖、3g葡萄糖、9.0g蛋白胨、3.0g NaNO3、3.0gNa2HPO4·12H2O和0.3g KH2PO4、2381.7g水，121℃灭菌15min，待温度降至25℃，接入300mL肠膜明串珠菌种子培养液后开始发酵，搅拌速率80r/min，通气量1.0L/min。发酵至12h，向发酵体系加入α-葡聚糖酶，酶与发酵液的酶活体积比为0.1U/ml，开始以16g/L/h流加速率补加含蔗糖质量约600g的蔗糖流加液，维持发酵液中的残糖含量为40～60g/L，同时进行pH两阶段调控，发酵开始时pH自然发酵，首次加酶后调控pH维持在5.5。
待流加结束后，向发酵体系加入α-葡聚糖酶，使酶与发酵液的酶活体积比为5.0U/mL；流加结束后3h再次向发酵液中加入α-葡聚糖酶，酶与发酵液的酶活体积比为5.0U/mL，定时取样分析蔗糖残留、果糖、聚葡萄糖含量，结果如图4所示，发酵30h产物浓度为88.7g/L。根据GPC凝胶色谱分析测定，分子量主要分布在1153Da、3755Da两个区间，分布系数为2.31。
实施例2
菌种活化：
从-80℃取出的安剖管保存的肠膜明串珠菌菌种粉末，用无菌生理盐水溶解，以划线法接种于装有斜面培养基的试管，25℃培养箱中培养48h；斜面培养基的组成为：13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4·12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数，分装于试管中，5mL/管，121℃灭菌15min。
种子培养：
取一支上述活化好的试管，挑取两环接种于装有种子培养基的摇瓶，25℃，80r/min，摇床培养24h得到肠膜明串珠菌种子培养液。种子培养基的组成为：30.0g的蔗糖、1.5g蛋白胨、0.3g Na2HPO4·12H2O和0.03g KH2PO4、238.17g水，配制好后进行121℃高压灭菌15min。
聚葡萄糖的制备：
蔗糖发酵培养基配方为：300.0g的蔗糖、3g葡萄糖、9.0g蛋白胨、3.0g NaNO3、3.0gNa2HPO4·12H2O和0.3g KH2PO3、2381.7g水，121℃灭菌15min，待温度降至25℃，接入300mL肠膜明串珠菌种子培养液后开始发酵，搅拌速率80r/min，通气量1.0L/min。发酵至12h，向发酵体系加入α-葡聚糖酶，酶与发酵液的酶活体积比为2.0U/ml，开始以16g/L/h流加速率补加含蔗糖质量约600g的蔗糖流加液，维持发酵液中的残糖含量为40～60g/L，同时进行pH两阶段调控，发酵开始时pH自然发酵，首次加酶后调控pH维持在5.5。
待流加结束后，向发酵体系加入α-葡聚糖酶，使酶与发酵液的酶活质量比为3.0U/mL；流加结束后3h再次向发酵液中加入α-葡聚糖酶，酶与发酵液的酶活体积比为2.0U/mL，定时取样分析蔗糖残留、果糖、聚葡萄糖含量，结果如图5所示，发酵至30h，蔗糖残留基本不变，产物浓度为90.0g/L。产物分子量分布情况的凝胶色谱如图6所示，根据GPC凝胶色谱分析测定，产物分子量集中在1499Da，分布系数为1.71，产物分子量更集中，提高产品品质，且总加酶用量更少。
以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)肠膜明串珠菌发酵培养：
向蔗糖发酵培养基中接入肠膜明串珠菌种子培养液进行发酵，菌种进入对数生长期时向上述发酵体系加入α-葡聚糖酶，同时补加蔗糖流加液；
(2)α-葡聚糖酶催化水解调控聚葡萄糖分子量：
待步骤(1)流加结束后，向发酵体系采用阶段式加入α-葡聚糖酶，继续发酵得到分子量Mw＜5000Da、分布系数小于2.5的聚葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述肠膜明串珠菌种子培养液的制备包括以下步骤：
S1：菌种活化，将肠膜明串珠菌冻干粉剂用无菌生理盐水溶解，吸菌液在斜面培养基上划线，静置培养；
S2：种子培养，将S1中活化好的肠膜明串珠菌用接种环挑取菌落接种于种子培养基培养得到所述肠膜明串珠菌种子培养液；
优选地，所述斜面培养基的组成为：10～15％蔗糖、0.2～0.6％蛋白胨、0.10～0.16％Na2HPO4·12H2O、0.01～0.05％KH2PO4、1.5％～2％琼脂、余量为水，优选为13％蔗糖、0.2％蛋白胨、0.14％Na2HPO4·12H2O、0.03％KH2PO4、2％琼脂、余量为水，其中的百分数为质量百分数；
优选地，所述菌种活化的培养条件为：温度25～30℃，培养时间24～48h，优选为温度25℃，培养时间48h；
优选地，所述种子培养基的组成为：10～15％蔗糖、0.2～0.6％蛋白胨、0.10～0.16％Na2HPO4·12H2O、0.01～0.05％KH2PO4、余量为水，优选为10.0％蔗糖、0.5％蛋白胨、0.1％Na2HPO4·12H2O、0.01％KH2PO4、余量为水，其中的百分数为质量百分数；
优选地，所述种子培养的培养条件为：温度25～30℃，培养时间24～48h，摇床转速80～120r/min，优选为温度25℃，培养时间24h，摇床转速80r/min。
3.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述蔗糖发酵培养基的组成为：10～15％蔗糖、0.1～1.0％葡萄糖、0.2～0.5％蛋白胨、0.1～0.2％无机氮源、0.10～0.16％Na2HPO4·12H2O、0.01～0.05％KH2PO4、余量为水，优选为10％蔗糖、0.1％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.1％无机氮源、0.1％Na2HPO4·12H2O、0.01％KH2PO4、余量为水，其中的百分数为质量百分数；
优选地，所述无机氮源选自(NH4)2SO4、NaNO3和尿素中的一种或者至少两种的组合，优选为NaNO3。
4.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵的条件为：发酵温度为25～30℃，培养时间为18～35h，pH为5.0～6.5，搅拌速率为80～120r/min，微量通气；
优选地，所述发酵温度为25℃；
优选地，所述培养时间为18～30h；
优选地，所述搅拌速率为80r/min；
优选地，通气量为0.5～1.0L/min。
5.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述肠膜明串珠菌种子培养液的体积为蔗糖发酵培养基体积的8～10％。
6.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为0.1～2.5U/mL，优选为2.0-2.5U/mL。
7.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述补加蔗糖流加液维持发酵体系中的蔗糖残留为40～60g/L；
优选地，步骤(1)中所述补加蔗糖流加液的速率为10～20g/L/h，优选为16g/L/h；
优选地，所述蔗糖流加液配制锤度为45～70°Bx，优选为66°Bx。
8.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述发酵过程进行两阶段pH调控：第一阶段，发酵开始时pH自然发酵；第二阶段，加酶后调控pH为5.0～6.5；
优选地，第一阶段，发酵开始时pH值为6.5；第二阶段，加酶后调控pH为5.5。
9.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述采用阶段式加入α-葡聚糖酶为分步多次向发酵体系加入α-葡聚糖酶，所述加入α-葡聚糖酶的次数大于等于2；所述α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为2.0～12.0U/mL；
优选地，步骤(2)具体为：待步骤(1)流加结束后，加入α-葡聚糖酶，α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为2.0～3.5U/mL；流加结束后3h再次加入α-葡聚糖酶，α-葡聚糖酶与发酵体系的酶活体积比为2.0～3.5U/mL，继续发酵得到分子量Mw＜5000Da、分布系数为1.4～1.8的聚葡萄糖。
10.根据权利要求1所述的聚葡萄糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)使用GPC凝胶色谱分析测定聚葡萄糖分子量以及蔗糖残留、果糖生成浓度情况，结束发酵；
优选地，步骤(2)发酵结束的标志为：利用GPC分析监测蔗糖残留及果糖生成变化及聚葡萄糖分子量，当蔗糖残留变化在0.1～0.5g/L时或者果糖生成浓度不升反降低时，且聚葡萄糖分子量达标时，标志发酵结束。
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| CN102429148A (zh) * | 2011-11-11 | 2012-05-02 | 山东龙力生物科技股份有限公司 | 一种高纯度分子量可控聚葡萄糖的制备方法 |
| CN103620048A (zh) * | 2011-08-01 | 2014-03-05 | S.P.C.M.股份公司 | 生产葡聚糖的新方法、获得的葡聚糖溶液及用途 |
| CN104561186A (zh) * | 2015-01-14 | 2015-04-29 | 北京林业大学 | 一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法 |
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2020
- 2020-11-06 CN CN202011230003.6A patent/CN114164243B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| CN114990173A (zh) * | 2021-03-01 | 2022-09-02 | 广州华汇生物实业有限公司 | ɑ-葡聚糖的制备方法 |
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