CN104561186A - 一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，它涉及微生物领域及生物工程领域。本发明采用生物发酵的方法合成功能性低聚糖，旨在建立以明串珠菌发酵法生产功能性低聚糖的具体工艺。具体方法为：一、对肠膜明串珠菌进行培养；二、进行离子交换除盐；三、冷冻结晶除甘露醇；四、活化酿酒酵母培养，即完成。本发明建立了以离子交换除盐、冷冻结晶除甘露醇及酵母选择性发酵的低聚糖纯化三步骤工艺，得到低聚葡萄糖的纯度达到90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域及生物工程领域。
背景技术
低聚糖通常被认为是一类由糖苷键连接，由2～10个单糖单位组成的短链糖类聚合物。带有分枝结构的低聚糖能够抵御肠道内多种消化酶的降解，从而在不被人体消化和吸收的情况下经过上消化道进入大肠，选择性的刺激肠道内有益微生物的生长和繁殖，这种低聚糖称之为非消化性低聚糖(non-digestible oligosaccharide)或功能性低聚糖，它是益生素产品的一个重要来源。另外，低聚糖可以被双歧杆菌和乳酸杆菌代谢利用，而不能被大肠杆菌降解，因此对肠道微生物菌群具有显著的整肠调节作用。正因为如此显著的益生效果，低聚糖被广泛的应用于功能性食品的生产，在改善人体消化道内的微生态平衡、消除便秘、缓解腹泻和防止结肠癌等方面表现出良好的促进作用。
肠膜明串珠菌除了能够利用蔗糖合成大分子葡聚糖之外，还能够以某些特定的二糖、三糖或其他小分子糖类化合物作为受体，利用葡聚糖蔗糖酶的转糖苷作用将蔗糖分子中的葡萄糖苷基转移至受体分子上形成不同聚合度的低聚葡萄糖。
目前国内的低聚糖生产主要通过淀粉的水解的方法制得。但是传统的酶解方法制备的功能性低聚糖产物中通常含有大量的单糖、二糖或者是麦芽糊精，它们都属于能够被人体消化吸收的碳水化合物，不仅不能选择性的刺激肠道有益微生物的生长和活力，而且还增加了食物产品的热能值，因此在很大程度上降低了功能性低聚糖的有效率。大多数低聚葡萄糖可以采用酶解的方法直接获得，但酶解方法并不适用于这种低聚糖的大规模生产，特别是想要以较低的生产成本来获得能够作为食品添加剂的低聚糖产品。
发明内容
本发明目的是采用生物发酵的方法合成功能性低聚糖，旨在建立以明串珠菌发酵法生产功能性低聚糖的具体工艺。此方法能够提高发酵速率、低聚葡萄糖的产量及功能性低聚糖的纯度。
本发明的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、按2％的接种量将肠膜明串珠菌接种于低聚糖生成培养基中，置于28℃条件下以100r/min的转速震荡培养48h；其中，培养过程中低聚糖生成培养基的pH值保持在6.5；
二、将步骤一培养后的培养液进行离子交换柱层析，首先将培养液过阳离子交换柱，再过阴离子交换柱，在柱层析流出液的糖度升高的时刻开始收集流出液，在糖度下降为零的时刻停止收集流出液；
三、采用真空蒸发的方法将步骤二收集的流出液浓缩，然后在0℃温度下静置24h，再在冷冻条件下离心取上清液，即得低聚糖浓缩液；
四、将活化好的酿酒酵母以2％的接种量接种于YEPD培养基中，在30℃条件下以100r/min的转速震荡培养18h；然后将培养后的培养液在8000g转速下冷冻离心20min，弃上清液收集固相物，将固相物用灭菌的蒸馏水悬浮，并按2％的比例接种到步骤三得到的低聚糖浓缩液中，然后置于30℃的摇床中以100r/min的转速震荡培养24h；
五、将步骤四培养后的发酵液经真空减压干燥后，即得低聚糖纯化产物；
其中，步骤二中的离子交换柱层析的树脂预处理过程为：将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂分别用蒸馏水清洗至水澄清，然后将阳离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，再用蒸馏水洗至pH为中性；
阴离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性；
重复离子交换柱层析的树脂预处理过程3次，最后用蒸馏水将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂洗至pH为中性，即完成对离子交换柱层析的树脂预处理。
本发明的肠膜明串珠菌购自CCICC，编号为22177；酿酒酵母购自北京林业大学，编号为BJFU 9.0017。
本发明包含以下有益效果：
本发明建立了以离子交换除盐、冷冻结晶除甘露醇及酵母选择性发酵的低聚糖纯化三步骤工艺，得到低聚葡萄糖的纯度达到90％以上。
本发明的MS培养基配方下培养肠膜明串珠菌48h后，细胞生物量能达到1.50～1.70g/L左右，低聚糖产量达到60～70g/L。
本发明通过加入大豆蛋白胨和酶解酪蛋白能促使肠膜明串珠菌获得较高的细胞生物量，细胞生物量能达到1.50～1.70g/L左右。
本发明通过添加CaCO3至培养基中，肠膜明串珠菌发酵生成的乳酸被CaCO3中和，使发酵液的pH值控制在相对较高的范围，消除乳酸对细胞产生的产物抑制作用，从而使细胞更为良好的生长和繁殖。添加CaCO3的培养基中获得的细胞生物量比没有添加CaCO3的情况高出0.11～0.13g/L。
本发明的肠膜明串珠菌在有氧气存在的条件下能够获得更快的生长速度和更高的细胞生物量。有氧培养时菌株进入细胞生长对数期的时间提前2h，获得的细胞生物量达到1.68-1.75g/L。
本发明采用冷冻结晶法对甘露醇的清除率可达65～79％。
附图说明
图1为酿酒酵母发酵除去果糖、麦芽糖和潘糖的效果图；其中，A为低聚糖(DP>3)的变化曲线；B为果糖的变化曲线；C为潘糖的变化曲线；D为麦芽糖变化曲线；
图2为采用实施例方法得到低聚葡萄糖的高效液相色谱图。
图3为利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的工艺流程图；
图4为本发明的离子交换装置示意图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、按2％的接种量将肠膜明串珠菌接种于低聚糖生成培养基中，置于28℃条件下以100r/min的转速震荡培养48h；其中，培养过程中低聚糖生成培养基的pH值保持在6.5；
二、将步骤一培养后的培养液进行离子交换柱层析，首先将培养液过阳离子交换柱，再过阴离子交换柱，在柱层析流出液的糖度升高的时刻开始收集流出液，在糖度下降为零的时刻停止收集流出液；
三、采用真空蒸发的方法将步骤二收集的流出液浓缩，然后在0℃温度下静置24h，再在冷冻条件下离心取上清液，即得低聚糖浓缩液；
四、将活化好的酿酒酵母以2％的接种量接种于YEPD培养基中，在30℃条件下以100r/min的转速震荡培养18h；然后将培养后的培养液在8000g转速下冷冻离心20min，弃上清液收集固相物，将固相物用灭菌的蒸馏水悬浮，并按2％的比例接种到步骤三得到的低聚糖浓缩液中，然后置于30℃的摇床中以100r/min的转速震荡培养24h；
五、将步骤四培养后的发酵液经真空减压干燥后，即得低聚糖纯化产物；
其中，步骤二中的离子交换柱层析的树脂预处理过程为：将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂分别用蒸馏水清洗至水澄清，然后将阳离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，再用蒸馏水洗至pH为中性；
阴离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性；
重复离子交换柱层析的树脂预处理过程3次，最后用蒸馏水将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂洗至pH为中性，即完成对离子交换柱层析的树脂预处理。
本实施方式步骤二中的流出液糖度测定是在有流出液流出后，每隔10min采用阿贝折光仪检测流出液体的糖度。
本实施方式步骤一的振荡培养其目的在于使培养过程中培养基中含氧量增加，促进菌株的生长以及提高低聚糖的产量。
本实施方式步骤三中的冷冻静置是为了使甘露醇结晶析出。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的低聚糖生成培养基为MS培养基，1L的MS培养基配方为：100g的蔗糖、50g麦芽糖、5g的酵母浸出物、5g的大豆蛋白胨、0.01g的FeSO4·7H2O、0.2g的MgSO4·7H2O、0.01g的MnSO4·H2O、3g的K2HPO4、0.05g的CaCl2、0.01g的NaCl和5mL的Tween 80。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：MS培养基配制过程为：首先将未添加蔗糖和麦芽糖的培养基pH调至7.2，然后进行高压灭菌，向其加入高压灭菌后的蔗糖溶液和麦芽糖溶液，使蔗糖在培养基中的终浓度为100g/L的和麦芽糖终浓度为50g/L的，即得MS培养基。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中进行离子交换柱层析具体过程为：将预处理后的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，灌入φ5cm×30cm的玻璃层析柱，按阳离子交换树脂、阴离子交换树脂与培养液的体积比为：1：1：0.4的比例，首先将培养液过阳离子交换柱，再过阴离子交换柱进行离子交换柱层析。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂；阴离子交换树脂为717型强碱性阴离子交换树脂。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中的1L的YEPD培养基配方含有：10g酵母浸出物、20g蛋白胨和20g葡萄糖，其中，YEPD培养基pH为6.0。其它与具体实施方式一相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一
本实施例的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，它是按照以下步骤进行的：
(1)在MRS培养基中活化好的肠膜明串珠菌(购自CCICC，编号为22177)，按2％的比例接种于400mL低聚糖生成培养基(MS培养基)，混匀后置28℃条件下以100r/min的转速震荡培养48h，添加NaOH使发酵液pH值始终控制在6.5；
其中，1L的MS培养基配方为：100g的蔗糖、50g麦芽糖、5g的酵母浸出物、5g的大豆蛋白胨、0.01g的FeSO4·7H2O、0.2g的MgSO4·7H2O、0.01g的MnSO4·H2O、3g的K2HPO4、0.05g的CaCl2、0.01g的NaCl和5mL的Tween 80；MS培养基配制过程为：首先将未添加蔗糖和麦芽糖的培养基pH调至7.2，然后进行高压灭菌，向其加入高压灭菌后的蔗糖溶液和麦芽糖溶液，使蔗糖在培养基中的终浓度为100g/L的和麦芽糖终浓度为50g/L的，即得MS培养基，即得MS培养基；
(2)离子交换除盐：
树脂预处理：将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂分别用蒸馏水清洗至水澄清，然后将阳离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，再用蒸馏水洗至pH为中性；
阴离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性；
重复离子交换柱层析的树脂预处理过程3次，最后用蒸馏水将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂洗至pH为中性。
阴阳离子交换：将预处理好的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，灌入φ5cm×30cm的玻璃层析柱。选用1000mL阳离子交换树脂和1000mL阴离子交换树脂对400mL发酵液进行离子交换除盐；如图4所示安装离子交换装置，液体首先通过阳离子交换柱，再通过阴离子交换柱。在低聚糖溶液进行离子交换期间，每隔10min采用阿贝折光仪检测流出液体的糖度，从糖度升高的时刻开始收集，糖度下降为零的时刻停止收集；
(3)冷冻结晶除甘露醇：采用真空蒸发的方法将步骤二收集的流出液浓缩至100mL，然后在0℃温度下静置24h，然后在冷冻条件下离心取上清液，即得低聚糖浓缩液；
(4)将活化好的酿酒酵母(购自CCICC，编号为22177)以2％的比例接种于200mL的YEPD培养基，在30℃条件下以100r/min的转速震荡培养18h；发酵液在8000g转速下冷冻离心20min，弃上清液保留酵母细胞；用10mL灭菌的蒸馏水将酵母细胞重新悬浮，并接种到经减压浓缩后的250mL低聚糖浓缩液中，置于30℃的摇床中以100r/min的转速震荡培养24h；YEPD培养基配方含有：10g/L酵母浸出物、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖，其中，YEPD培养基pH为6.0。
(5)将步骤四培养后的发酵液经真空减压干燥后，即得低聚糖纯化产物。
由于在碳源总量相同的条件下，提高蔗糖和麦芽糖的比例有助于肠膜明串珠菌发酵生成聚合度相对较高的低聚糖。在本实施例的MS培养基配方下培养肠膜明串珠菌48h后，细胞生物量能达到1.50～1.70g/L左右，低聚糖产量达到60～70g/L。
本实施例的五种蛋白胨都能有效刺激肠膜明串珠菌的细胞生长，大豆蛋白胨和酶解酪蛋白能促使肠膜明串珠菌获得较高的细胞生物量，细胞生物量能达到1.50～1.70g/L左右。
本实施例通过添加CaCO3至培养基中，肠膜明串珠菌发酵生成的乳酸被CaCO3中和，使发酵液的pH值控制在相对较高的范围，消除乳酸对细胞产生的产物抑制作用，从而使细胞更为良好的生长和繁殖。添加CaCO3的培养基中获得的细胞生物量比没有添加CaCO3的情况高出0.11～0.13g/L。
肠膜明串珠菌在有氧气存在的条件下能够获得更快的生长速度和更高的细胞生物量。有氧培养时菌株进入细胞生长对数期的时间提前2h，获得的细胞生物量达到1.68-1.75g/L。
冷冻结晶法对甘露醇的清除率可达65～79％。
在肠膜明串珠菌发酵生成低聚糖的过程中，由于蔗糖的水解而释放出大量的果糖，其中一部分转化为甘露醇，而另外一部分则直接残留于发酵液当中。还有受体反应中没有完全利用的麦芽糖，它们将通过离子交树脂并且和低聚糖(DP≥3)一起被收获。但是由于果糖和麦芽糖本身并不具备益生特性，可以在小肠内被人体消化和吸收，不仅不能选择性的刺激有益微生物的生长和存活，而且增加了食物产品的能量值，因此它们不具备作为益生素最本质的特征。因此为提高产品中功能性低聚糖的纯度，就需要采取一定的措施清除低聚糖混合液中的麦芽糖和果糖。本实施例利用酿酒酵母发酵10小时后,果糖、麦芽糖和潘糖几乎被完全去除，结果如图1所示。
通过此方法最终得到的低聚葡萄糖纯度可达90％以上，结果如图2所示，图2中左侧的小峰为残留的甘露醇，右侧的大峰为低聚葡萄糖。
Claims (6)
1.一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、按2％的接种量将肠膜明串珠菌接种于低聚糖生成培养基中，置于28℃条件下以100r/min的转速震荡培养48h；其中，培养过程中低聚糖生成培养基的pH值保持在6.5；
二、将步骤一培养后的培养液进行离子交换柱层析，首先将培养液过阳离子交换柱，再过阴离子交换柱，在柱层析流出液的糖度升高的时刻开始收集流出液，在糖度下降为零的时刻停止收集流出液；
三、采用真空蒸发的方法将步骤二收集的流出液浓缩，然后在0℃温度下静置24h，再在冷冻条件下离心取上清液，即得低聚糖浓缩液；
四、将活化好的酿酒酵母以2％的接种量接种于YEPD培养基中，在30℃条件下以100r/min的转速震荡培养18h；然后将培养后的培养液在8000g转速下冷冻离心20min，弃上清液收集固相物，将固相物用灭菌的蒸馏水悬浮，并按2％的比例接种到步骤三得到的低聚糖浓缩液中，然后置于30℃的摇床中以100r/min的转速震荡培养24h；
五、将步骤四培养后的发酵液经真空减压干燥后，即得低聚糖纯化产物；
其中，步骤二中的离子交换柱层析的树脂预处理过程为：将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂分别用蒸馏水清洗至水澄清，然后将阳离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，再用蒸馏水洗至pH为中性；
阴离子交换树脂先用质量百分含量为2％～4％的稀盐酸浸泡4h～8h后，用蒸馏水洗至pH为中性，再用质量百分含量为2％～4％的NaOH溶液浸泡2h～4h，再用蒸馏水洗至pH为中性；
重复离子交换柱层析的树脂预处理过程3次，最后用蒸馏水将阳离子交换树脂和阴离子交换树脂洗至pH为中性，即完成对离子交换柱层析的树脂预处理。
2.根据权利要求1所述的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，其特征在于步骤一中的低聚糖生成培养基为MS培养基，1L的MS培养基配方为：100g的蔗糖、50g麦芽糖、5g的酵母浸出物、5g的大豆蛋白胨、0.01g的FeSO4·7H2O、0.2g的MgSO4·7H2O、0.01g的MnSO4·H2O、3g的K2HPO4、0.05g的CaCl2、0.01g的NaCl和5mL的Tween 80。
3.根据权利要求2所述的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，其特征在于MS培养基配制过程为：首先将未添加蔗糖和麦芽糖的培养基pH调至7.2，然后进行高压灭菌，再向其加入高压灭菌后的蔗糖溶液和麦芽糖溶液，使蔗糖在培养基中的终浓度为100g/L的和麦芽糖终浓度为50g/L的，即得MS培养基。
4.根据权利要求1所述的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，其特征在于步骤二中进行离子交换柱层析具体过程为：将预处理后的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂，灌入φ5cm×30cm的玻璃层析柱，按阳离子交换树脂、阴离子交换树脂与培养液的体积比为：1：1：0.4的比例，首先将培养液过阳离子交换柱，再过阴离子交换柱进行离子交换柱层析。
5.根据权利要求1所述的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，其特征在于阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂；阴离子交换树脂为717型强碱性阴离子交换树脂。
6.根据权利要求1所述的一种利用肠膜明串珠菌生产低聚葡萄糖的方法，其特征在于步骤四中1L的YEPD培养基配方含有：10g酵母浸出物、20g蛋白胨和20g葡萄糖，其中，YEPD培养基pH为6.0。
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| CN114164243A (zh) * | 2020-11-06 | 2022-03-11 | 广东省科学院生物工程研究所 | 一种聚葡萄糖的制备方法 |
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| 高莉莉: "肠膜明串珠菌发酵生成的低聚糖的研究", 《中国博士论文全文数据库 基础科学辑》 * |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |