CN101503720B - 一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法 - Google Patents

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一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法，其特征是用产糖培养基对克雷伯氏菌K13进行液体发酵，提取胞外多糖；另制备噬菌体聚糖酶酶液，将酶液与胞外多糖水溶液混合，进行酶解反应，然后通过超滤除去未降解的大分子糖，所得滤液经精制和浓缩后获得微生物寡糖KOS。试验证明微生物寡糖KOS是一种非消化性低聚糖，能促进双歧杆菌和乳酸菌等肠道益生菌的生长，抑制病原菌、腐败菌等有害菌的生长，起到了改善肠道微生态环境和净化肠道的作用。微生物寡糖KOS是一种新型的益生元，它是通过噬菌体聚糖酶降解克雷伯氏菌K13的胞外多糖而得到的一种新的来自微生物的寡糖，其原料不同于其它寡糖且酶法降解使结果重复性好，应用前景广阔。

Description

一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法。
背景技术
益生元(prebiotics)是指那些能够选择性地促进机体肠道内原有的一种或有限几种有益细菌(益生菌)生长或其活性的一种非消化性的食品功能因子，主要是指各种寡糖或低聚糖。20世纪90年代，Gibson首次提出了益生元的概念，现在益生元作为一种新型的微生态调节剂受到了广泛的关注和研究。益生元因其结构特异性，既不被人体消化系统消化和吸收，亦不被肠道有害菌群分解和利用，只能为肠道有益菌群如双歧杆菌和乳酸菌所利用，从而达到调整肠道正常菌群的目的。目前国内外已有关于利用壳寡糖、果寡糖、甘露寡糖、木寡糖、琼寡糖等作为益生元的研究，但尚未见有微生物寡糖作为益生元的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法，以弥补现有技术的上述不足。
一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法，其特征是用产糖培养基对克雷伯氏菌K13进行液体发酵，提取胞外多糖；另制备噬菌体聚糖酶酶液，将酶液与胞外多糖水溶液混合，进行酶解反应，然后通过超滤除去未降解的大分子糖，所得滤液经精制和浓缩后获得微生物寡糖KOS。
试验证明微生物寡糖KOS是一种非消化性低聚糖，能显著促进双歧杆菌和乳酸菌等肠道益生菌的生长，抑制病原菌、腐败菌等有害菌的生长，起到了改善肠道微生态环境和净化肠道的作用。微生物寡糖KOS是一种新型的益生元，它是通过噬菌体聚糖酶降解克雷伯氏菌K13的胞外多糖而得到的一种新的来自微生物的寡糖，其原料不同于其它寡糖且酶法降解使结果重复性好，所以应用前景广阔。
具体实施方式
本发明为一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法，该方法是由以下步骤所组成：用产糖培养基对克雷伯氏菌K13进行液体发酵，提取胞外多糖；另制备噬菌体聚糖酶酶液，将酶液与胞外多糖水溶液混合，进行酶解反应，然后通过超滤除去未降解的大分子糖，所得滤液经精制和浓缩后获得微生物寡糖KOS。所述的产糖培养基的组分和重量千分数分别为：酵母膏1.0-2.0‰，蛋白胨1.0-2.0‰，葡萄糖20-40‰，Na2HPO4 5-15‰，KH2PO4·3H2O 1-5‰，MgSO4·7H2O 0.1-0.3‰，NaCl 0.5-1.5‰，K2SO4 5-10‰，CaCl20.001-0.002‰，其余为水，配制时，将各组分混合均匀，调pH至7.0-7.6；所述液体发酵的温度为28-36℃，液体发酵的时间为96-168小时；所述的提取胞外多糖为：发酵液经离心去除沉淀细胞和蛋白质，收集上清液后旋转蒸发浓缩，然后加入2-4倍体积的冷丙酮以沉淀胞外多糖，收集到的胞外多糖再溶于去离子水中，密封于透析袋中透析24-48小时，透析液离心去除杂质后，冷冻干燥；所述的制备噬菌体聚糖酶酶液：在营养肉汤培养基中培养克雷伯氏菌K13，至600nm下光吸收值为0.4-0.5时，加入克雷伯氏菌K13专一性噬菌体，并监测光吸收值，当光吸收值达到0.1以下时，收集培养液，过滤去除细菌细胞，滤液密封于透析袋中透析24-48小时，透析液离心去除杂质后即得；所述的酶解反应为：0.5-1.0g上述胞外多糖分散至去离子水中，再加入50-100ml上述噬菌体聚糖酶酶液，于28-60℃反应4-12h后，沸水加热5-10min以终止反应。
实施例
先配制产糖培养基，称取酵母膏1.0g、蛋白胨1.0g、葡萄糖30g、Na2HPO4 10g、KH2PO4·3H2O 3g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 1.0g、K2SO4 10g、CaCl2 0.001g，最后加水至总重量为1kg。然后用1M的NaOH水溶液调产酶培养基的pH至7.2。产酶培养基经112℃20分钟高压蒸汽灭菌后，冷却至室温。克雷伯氏菌K13用普通细菌培养基进行液体振荡培养，24小时后生长达到对数期，此时的培养液作为发酵种子接种到200ml上述的产糖培养基中，于30℃液体发酵120小时，发酵液经离心去除沉淀细胞和蛋白质，收集上清液后于60℃旋转蒸发浓缩至40ml，然后向浓缩液中加入80ml冷丙酮以沉淀胞外多糖，经离心收集到的胞外多糖再溶于20ml去离子水中，密封于透析袋中透析48小时，透析液经离心去除杂质后，冷冻干燥，备用。
再制备噬菌体聚糖酶酶液：克雷伯氏菌K13在营养肉汤培养基中培养，至600nm下光吸收值为0.4时，加入克雷伯氏菌K13专一性噬菌体，并监测光吸收值。当光吸收值达到0.1以下时，收集培养液，用0.45μm微孔滤膜过滤去除细菌细胞，滤液密封于透析袋中透析48小时，透析液离心去除杂质后即得噬菌体聚糖酶酶液。
将0.5g上述的克雷伯氏菌K13胞外多糖分散至去离子水中，配成质量百分浓度为1％的水溶液，再加入50ml上述噬菌体聚糖酶酶液，于40℃酶解反应6h后，用沸水加热10min以终止反应。为了防止反应过程中杂菌的生长，也可向反应液中加入重量百分浓度为0.02％的叠氮化钠，但操作时必须注意反应液不得与皮肤表面发生接触。酶解产物通过超滤(Millipore，10000MW)除去未降解的大分子糖，滤液经冷冻干燥后，用Bio-gelP4凝胶柱分离纯化，收集寡糖组分，再次冷冻干燥后即得微生物寡糖KOS。
按上述方法制备的微生物寡糖KOS具有益生元作用，对肠道菌群具有良好的调节功能，具体验证方法如下：
一、PI值测定
1.采用液体发酵培养基：蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，NaCl 0.1g/L，K2HPO4 0.04g/L，KH2PO4 0.04g/L，MgSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.01g/L，NaHCO3 2g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，胆盐0.5g/L，vitamin K 10μl/L，Tween 80 2ml/L，hemin 0.05g/L，培养基初始pH为7.0，后期发酵过程不再控制调节。
2.采用肠道菌悬液：分别取三位健康志愿者(近三个月未服用过抗生素类药物)新鲜粪便1.0g于50ml 0.1mol/L PBS溶液中，混匀。
3.微生物寡糖KOS用量：0.5％(质量百分数)。
4.菌落数测定方法：测定双歧杆菌数采用GB/T4789.34-2003，测定乳酸杆菌数采用GB/T4789.35-2003，测定产气荚膜梭菌数采用GB/T4789.13-2003，测定大肠杆菌数采用GB/T4789.03-2003，测定菌落总数采用GB/T4789.2-2003。
根据测得的细菌数计算益生元指数(PI)：PI＝(Bif/Total)-(Esc/Total)+(Lab/Total)-(Clos/Total)，其中Bif、Esc、Lab、Clos分别表示培养一定时间后的双歧杆菌数、大肠杆菌数、乳酸杆菌数及产气荚膜梭菌数与对应菌初始时间的菌数之比；Total表示培养一定时间后的总菌数与初始时间总菌数之比。
由表1可见，给予微生物寡糖KOS体外静置培养，培养8h时的PI值为1.16，培养24h时的PI值为3.59。PI值越大，益生元作用越强；当PI值大于1时，益生元作用较好，可见微生物寡糖KOS有益生元作用。
表1给予微生物寡糖KOS后发酵8h和24h时细菌数量的变化
Figure G2009100145071D00031
注：以1g cfu/ml±S.D表示
二、产气量测定
1.按上述方法进行四种细菌的液体培养，培养时间分别为8h、24h、32h时，用无菌注射器测定产气量。
2.施加微生物寡糖KOS后，细菌产气量的结果如表2所示，以葡萄糖(GLC)为参照。从三位志愿者粪样发酵32h后的总产气量的平均值可知，GLC的产气量为6.61ml，KOS的产气量为1.81ml，由此可知，KOS较适合作为益生元。
表2受试细菌在发酵过程中的产气量(单位：ml)
Figure G2009100145071D00041
*三名供样志愿者编号

Claims (1)

1.一种具有益生元作用的微生物寡糖的制备方法，其特征是用产糖培养基对克雷伯氏菌K13进行液体发酵，提取胞外多糖；另制备噬菌体聚糖酶酶液，将酶液与胞外多糖水溶液混合，进行酶解反应，然后通过超滤除去未降解的大分子糖，所得滤液经精制和浓缩后获得微生物寡糖KOS；所述产糖培养基的组分和重量千分数分别为：酵母膏1.0-2.0‰，蛋白胨1.0-2.0‰，葡萄糖20-40‰，Na2HPO4 5-15‰，KH2PO4·3H2O 1-5‰，MgSO4·7H2O0.1-0.3‰，NaCl 0.5-1.5‰，K2SO45-10‰，CaCl2 0.001-0.002‰，其余为水，配制时，将各组分混合均匀，调pH至7.0-7.6；所述液体发酵的温度为28-36℃，液体发酵的时间为96-168小时；所述的提取胞外多糖为：所得发酵液经离心去除沉淀细胞和蛋白质，收集上清液后旋转蒸发浓缩，然后加入2-4倍体积的冷丙酮以沉淀胞外多糖，收集到的胞外多糖再溶于去离子水中，密封于透析袋中透析24-48小时，透析液离心去除杂质后，冷冻干燥；所述的制备噬菌体聚糖酶酶液：在营养肉汤培养基中培养克雷伯氏菌K13，至600nm下光吸收值为0.4-0.5时，加入克雷伯氏菌K13专一性噬菌体，并监测光吸收值，当光吸收值达到0.1以下时，收集培养液，过滤去除细菌细胞，滤液密封于透析袋中透析24-48小时，透析液离心去除杂质后即得；所述酶解反应为：0.5-1.0g所述胞外多糖分散至去离子水中，再加入50-100ml所述噬菌体聚糖酶酶液，于28-60℃反应4-12h后，沸水加热5-10min以终止反应。
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