CN109182307B - 一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法 - Google Patents

一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β‑半乳糖苷酶的方法及其所产β‑半乳糖苷酶。所述凝结芽孢杆菌具体为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)突变株BR‑171，保藏号为CGMCC No.14413。该菌株能够稳定、高效产β‑半乳糖苷酶，通过50L发酵罐液体深层发酵，同时经补料发酵培养84h，产酶可达4000u/ml以上。所述菌株生产的β‑半乳糖苷酶最适反应pH为5.0，在β‑半乳糖苷酶pH2.5～8.5范围内仍具有80％以上的活力，该酶的pH耐受性范围适合大部分乳制品；β‑半乳糖苷酶最适作用温度为60℃，在65℃下保温2h后剩余酶活仍达到88.4％，具有显著的耐热性；在乳制品行业具有较高的工业价值。

Description

一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，特别涉及一种凝结芽孢杆菌液体发酵产β-半乳糖苷酶的方法及其所产β-半乳糖苷酶。
背景技术：
凝结芽孢杆(Bacillus coagulans)，革兰氏阳性菌，属于硬(或厚)壁菌门。凝结芽孢杆菌分类学上属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，端生芽孢，无鞭毛，分解糖类生成L-乳酸，为同型乳酸发酵菌。最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0。凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可以生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能够降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。
β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.238)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，常用名为乳糖酶，该酶能催化半乳糖苷键水解，水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类，牛奶中绝大多数糖类是乳糖，但乳糖只有被β-半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖后才能被机体小肠粘膜细胞吸收。
β-半乳糖苷酶广泛应用于乳制品行业。在奶类和乳制品加工过程中，加入安全的β-半乳糖苷酶，使其消化为葡萄糖和半乳糖，这样的奶类被称作低乳糖奶。低乳糖奶不仅可以满足正常消费者的需要，更可以满足乳糖不耐症者、先天性β-半乳糖苷酶缺乏者食用乳制品、充分吸收乳制品营养的需要。
β-半乳糖苷酶来源广泛，目前已经商品化的β-半乳糖苷酶主要来源于微生物，包括大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)等。凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的乳酸菌，具有快速水解乳糖发酵产酸的特性。目前天然产酶菌株所产的β-半乳糖苷酶的酶活普遍较低，优良天然菌株资源匮乏，因此选育出新型高产酶优良菌株具有重要意义。
发明内容：
为了解决上述问题，本文中将提供具有很好的耐热性的诱变菌株，同时改进了发酵工艺，提高产β-半乳糖苷酶的酶活，对酶制剂工业具有非常广阔的开发潜力和应用前景。
针对目前的天然产酶菌株所产β-半乳糖苷酶的酶活普遍较低，优良的天然菌株匮乏的现状，本发明的目的在于提供一种高产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌菌株。
本发明还提供上述产β-半乳糖苷酶的菌株的应用及其液体发酵方法。
本发明提供的高产β-半乳糖苷酶的菌株具体为凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)BR-171。该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101)，保藏号为CGMCC No.14413。
所述菌株由从土壤中经筛选分离并经室温常压等离子体诱变筛选获得，具有产β-半乳糖苷酶效率高，稳定性好的特性。
所述菌株经液体深层通气发酵β-半乳糖苷酶的发酵液酶活力在4000U/mL以上。
所述菌株生产的β-半乳糖苷酶最适反应pH为5.0，在β-半乳糖苷酶pH2.5-8.5范围内保藏1h仍具有80％以上的活力，该酶的pH耐受性范围适合大部分乳制品；β-半乳糖苷酶最适作用温度为60℃，在65℃下保温2h后剩余酶活仍达到88.4％，具有显著的耐热性；在乳制品行业具有较高的工业价值。
本发明还提供一种以上述凝结芽孢杆菌为生产菌株制备β-半乳糖苷酶的液体深层通气发酵方法，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：将凝结芽孢杆菌突变菌株BR-171斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入3000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量800毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间10-15h；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以3.5％接种量接入总容积为50L的一级种子罐，培养基装量30L，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量(V/V)1:1-2,罐压0.05MPa,培养时间10-20小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以5-10％接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量(V/V)1:1-3,罐压0.05MPa,培养时间70-100h；
(6)发酵控制条件：
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15-30％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.0-7.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量至5mg/mL-8mg/mL时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/mL-5mg/mL；
放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
(7)所述β-半乳糖苷酶的提取与精制方法如下：
向上述发酵液中加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1％20#硅藻土进行精滤；用超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(2％盐)、防腐剂(3‰苯甲酸钠，1.5‰山梨酸钾)，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-半乳糖苷酶成品酶制剂。
所述一级、二级、三级种子培养的培养基组成为(质量体积百分比)：
乳糖3％，酵母粉0.5％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.6％，磷酸氢二钾0.8％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌30min。
所述种子罐培养的培养基基组成为(质量体积百分比)：
乳糖3％，酵母粉0.8％，麦芽糊精15％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。
所述发酵罐培养的培养基组成为(质量体积百分比)：
乳糖3％，酵母粉1.0％，玉米粉15％，豆饼粉3.0％，玉米浆1％，氯化钙0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，柠檬酸钠0.5％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。
所述补料培养基组成为(质量体积百分比)：乳糖1％，麦芽糊精50％，豆饼水解液3.0％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。
所述发酵培养的培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.5，121-123℃灭菌35min备用。
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5-7均匀混合，然后加入豆饼质量5-7％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应65min，降至室温，既得豆饼水解液。
有益效果：
本发明提供了一种适于工业化生产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌菌株，并优化了相应的发酵机制。该发酵机制，过程操作简便，培养条件温和，发酵酶活力平均在4000U/mL以上，降低了单位酶活的生产成本，大大满足了市场的需要。使β-半乳糖苷酶能够在乳制品行业得到更为广泛的应用。
附图说明：
图1为实施例3发酵过程酶活力随培养时间变化曲线；
图2β-半乳糖苷酶的最适作用pH；
图3β-半乳糖苷酶pH耐受性曲线；
图4β-半乳糖苷酶的最适作用温度；
图5β-半乳糖苷酶的热稳定性曲线。
具体实施方式：
以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。
本发明液体深层发酵制备β-半乳糖苷酶过程中所用培养基如下：
一级、二级、三级种子培养的培养基组成为(质量体积百分比)：
乳糖3％，酵母粉0.5％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.6％，磷酸氢二钾0.8％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌30min。
种子罐培养的培养基组成为(质量体积百分比)：
乳糖3％，酵母粉0.8％，麦芽糊精15％，蛋白胨0.5％，玉米浆0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。
所述发酵罐培养的培养基组成为(质量体积百分比)：
乳糖3％，酵母粉1.0％，玉米粉15％，豆饼粉3.0％，玉米浆1％，氯化钙0.5％，磷酸氢二钾1.5％，硫酸镁0.1％，柠檬酸钠0.5％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。
所述补料培养基组成为(质量体积百分比)：乳糖1％，麦芽糊精50％，豆饼水解液3.0％，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌35min。
所述发酵培养的培养基的调配方法为：
按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调pH6.0，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70℃保温15min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH7.5，121-123℃灭菌35min备用。
所述豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:5-7均匀混合，然后加入豆饼质量5-7％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应65min，降至室温，既得豆饼水解液。
实施例1出发菌株的筛选
(1)从奶牛场养殖基地取2g土样，加到含有50mL冷却无菌水的小三角瓶中，摇床200r/min，摇动20min，然后放在80℃水浴锅中，水浴10min，不断摇动三角瓶混匀土样，静置5min吸取上清液100μL，依次梯度稀释到10-1～10-9浓度，选取10-3，10-4，10-5，10-6浓度涂布牛肉膏蛋白胨平板，37℃培养24h，继续30℃培养24h。
(2)根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘结构、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶色素等方面的特征，用接种环将孤立的单个菌落挑出，移到筛选培养基平板上，并编号，34℃培养48h。
所述筛选培养基组成为：乳糖1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，蛋白陈1.0％，琼脂粉1.5％，蒸馏水l000mL，pH7.2，121℃灭菌20min。
(3)待菌株在平板上培养48h后，将不同编号平板上的优势菌落接种到筛选培养基斜面上，保藏以供复筛使用。
(4)将保藏的不同编号的菌株分别接种到斜面活化2次后，将活化好的菌种接入种子培养基，180r/min，37℃，培养18h。再按5％的接种量接种到发酵培养基，200r/min，28℃，发酵48h。将所得发酵液10000r/min离心去菌体，发酵液上清液进行β-半乳糖苷酶酶活力测定实验。
所述种子培养基成为：乳糖2％，葡萄糖2％，蛋白胨1％，NaH2PO4·2H2O 0.02％，Na2HPO4·2H2O 0.04％，MgSO4·7H2O 0.005％，蒸馏水100mL，pH7.4，121℃灭菌20min。
所述发酵培养基组成为：乳糖2％，葡萄糖4％，蛋白胨2％，NaH2PO4·2H2O 0.02％，Na2HPO4·2H2O 0.04％，MgSO4·7H2O 0.005％，CaCl2 0.01％，MnSO40.002％，蒸馏水100mL，pH7.4，121℃灭菌20min。
(5)挑选产β-半乳糖苷酶酶活力强的菌株进行甘油保存，得到本发明菌株的出发菌株。
实施例2菌株的诱变选育
(1)吸取出发菌株活化后，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为107-108个/mL，以此作为出发菌悬液。
(2)开启常温常压等离子体系统，以酒精棉擦拭操作室内外，并开启紫外灯灭菌30min。灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上。开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变。诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s。每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min。稀释涂布后置于34℃培养箱内培养。
(3)平板初筛
将经过诱变长出的单菌落转接初筛培养基中，30℃培养3d。在超净台中向初筛小管喷洒灭菌的10％Na2CO3溶液，静置数分钟；挑取颜色变黄的小管按颜色深浅进行降序排列、编号。依次转接保存斜面，30℃培养至孢子成熟，于冰箱4℃保藏。
所述平板初筛培养基为：乳糖2％、蛋白胨1％、(NH4)2SO4 0.14％、KH2PO42 0.1％、CaCl2 0.03％、MgSO4 0.3％、Toween-8 0.2％、FeSO4 0.05％、MnSO4 0.016％、ZnSO40.014％、CoCl2 0.02％、其余为水，pH5.5。灭菌冷却至60度后加入微滤除菌的1％邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)母液，摇匀后加入到灭菌的1.5mL离心管中；
(4)摇瓶复筛
将初筛得到的菌落接种于复筛培养基中，34℃培养48小时，检测β-半乳糖苷酶酶活。
所述复筛培养基组成：乳糖3％、蛋白胨1.5％、(NH4)2SO4 0.2％、KH2PO42 0.15％、CaCl2 0.035％、MgSO4 0.35％、Toween-8 0.2％、FeSO4 0.1％、MnSO4 0.02％、ZnSO40.02％、CoCl2 0.03％，不足部分纯净水补足，pH7.0-8.0，121-123℃灭菌30-35min。
(5)菌株稳定性检测：
将复筛所得高酶活菌株进行传代培养，并跟踪摇瓶检测其酶活。经摇瓶复筛，最终确定生产菌株，并将其命名为BR-171，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14413。该菌株的特性是产β-半乳糖苷酶效率高，稳定性好。
选取高产菌株BR-171连续传代6次的摇瓶结果如表1所示：
表1.菌株BR-171稳定性检测结果
代数 摇瓶酶活(U/mL) 相对酶活(％)
F1 1589 100
F2 1601 100.8
F3 1551 97.6
F4 1571 98.9
F5 1610 101.3
F6 1591 100.1
实施例3液体发酵产内切β-半乳糖苷酶及其提取精制
(1)一级种子培养：将凝结芽孢杆菌突变菌株BR-171斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间11h；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入3000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量800毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间11h；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以3.5％接种量接入总容积为50L的一级种子罐，发酵培养基装量30L，培养温度35℃，搅拌速度300rpm，通风量(V/V)1:2,罐压0.05MPa,培养时间15小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以8％接种量接入发酵罐，培养温度35℃，搅拌速度500r/m，通风量(V/V)1:1.5,罐压0.05MPa,培养时间84h；
(6)发酵控制条件：
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15-30％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.0-7.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至5mg/mL时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/mL-5mg/mL；
放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
如下表2为30L发酵罐6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为4091U/mL，同时，对BF-4批次酶活随培养时间变化作图，如图1所示为酶活随培养时间的变化曲线。
表2.菌株BR-171在30L发酵罐6批次的发酵产酶
发酵批次 发酵周期(h) 发酵酶活(U/mL)
BF-1 84 3984
BF-2 84 4201
BF-3 84 4115
BF-4 84 4231
BF-5 84 3997
BF-6 84 4021
(7)所述β-半乳糖苷酶的提取与精制方法如下：
向上述发酵液中加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1％20#硅藻土进行精滤；用超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(2％盐)、防腐剂(3‰苯甲酸钠，1.5‰山梨酸钾)，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-半乳糖苷酶成品酶制剂。
豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:6均匀混合，然后加入豆饼质量6％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应65min，降至室温，既得豆饼水解液。
实施例4液体发酵产内切β-半乳糖苷酶及其提取精制
(1)一级种子培养：将凝结芽孢杆菌突变菌株BR-171斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度34-35℃，培养时间15h；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入3000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量800毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度34-35℃，培养时间15h；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以3.5％接种量接入总容积为50L的一级种子罐，发酵培养基装量30L，培养温度32℃，搅拌速度400rpm，通风量(V/V)1:1,罐压0.05MPa,培养时间20小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入发酵罐，培养温度32℃，搅拌速度700r/m，通风量(V/V)1:3,罐压0.05MPa,培养时间90h；
(6)发酵控制条件：
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制发酵过程溶解氧15-30％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH保持在7.0-7.2；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至8mg/mL时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为2mg/mL-5mg/mL；
放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢；
发酵结束时，产酶水平为4532U/mL发酵液。
(7)所述β-半乳糖苷酶的提取与精制方法如下：
向上述发酵液中加入3％珍珠岩助滤剂，进行板框压滤；将压滤液中加入1％20#硅藻土进行精滤；用超滤膜对精滤液进行超滤浓缩；在浓缩液中加入稳定剂(2％盐)、防腐剂(3‰苯甲酸钠，1.5‰山梨酸钾)，然后用无菌膜进行过滤除菌，即得到内切β-半乳糖苷酶成品酶制剂。
豆饼水解液的制备方法为：将豆饼与水按照质量比1:7均匀混合，然后加入豆饼质量7％的石灰，搅拌均匀，于120℃反应65min，降至室温，既得豆饼水解液。
实施例5β-半乳糖苷酶的酶活测定方法
总体系为1mL，含700μL去离子水，100μL 500mmol/L pH6.0的磷酸钾缓冲液，100μL20mmol/L的oNPG，混匀孵育5分钟后，加入100μL经适当稀释的酶液，混匀，55℃温浴10分钟，立即加入2mL 0.5mmol/L的Na2CO3终止反应，用分光光度计测量410nm处的吸光值即oNP的生成量。酶的活力单位定义为：1分钟水解生成1μmol oNP的酶量为1个活力单位U。
实施例6酶的最适作用pH范围
以本发明所产的酶活力11401U/mL的β-半乳糖苷酶产品为基准，在60℃条件下，按照实施例5中所述酶活测定方法，分别在不同pH值(3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0)缓冲液中，测定的相对酶活力变化曲线如图2所示，β-半乳糖苷酶最适反应pH为5.0。另外，在不同pH(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)缓冲液下保存1h，测定相对酶活力变化曲线如图3，该酶在pH2.5-8.5下，具有较好的pH耐受性，相对酶活在pH2.5-8.5下仍能达到80％以上。
上述不同pH缓冲液分别为：50mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液pH2.5～6.5，50mmol/L磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液pH6.5～8.5。
实施例7β-半乳糖苷酶的最适作用温度
以本发明所产的酶活力11401U/mL的β-半乳糖苷酶产品为基准，在pH值为5.0条件下，分别在不同温度(40、50、55、60、65、70、80)下，测定酶活力，测定的相对酶活力变化曲线如图4所示，酶的最适作用温度为60℃。
实施例8β-半乳糖苷酶的热稳定性
以酶活力11401U/mL的β-半乳糖苷酶产品为基准，在pH值为5.0条件下，分别在不同温度(30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80)下保温2h，按照实施例3中所述酶活测定方法，测定剩余酶活力，如图5所示，65℃下保温2h后剩余酶活为88.4％，具有良好的耐热保存活性，可广泛应用于高温工业生产中。

Claims (2)

1.一种发酵制备β-半乳糖苷酶的方法，其特征在于，具体如下：
（1）一级种子罐培养：将种子液以3.5%接种量接入一级种子罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-400rpm，通风量1:1-2, 罐压0.05MPa, 培养时间10-20小时；
（2）发酵培养：将一级种子罐菌种以 5-10% 接种量接入发酵罐，培养温度32-36℃，搅拌速度200-700r/m，通风量1:1-3, 罐压0.05MPa, 溶解氧15-30%，pH7.0-7.2；培养时间70-100h ；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量至 5mg/mL-8mg/mL 时，开始添加补料培养基，补料量使发酵液还原糖含量维持为 2mg/mL-5mg/mL ；
放罐标准：60-80% 菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢；
发酵菌种为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）BR-171，保藏号为CGMCC No. 14413。
2.如权利要求1所述的一种发酵制备β-半乳糖苷酶的方法，其特征在，
所述发酵培养的培养基组成为：乳糖3%，酵母粉1.0%，玉米粉15%，豆饼粉3.0%，玉米浆1%，氯化钙0.5%，磷酸氢二钾1.5%，硫酸镁0.1%，柠檬酸钠0.5%，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌 35min；
所述补料培养基组成为：乳糖1%，麦芽糊精50%，豆饼水解液3.0%，不足部分纯净水补足，pH7.5，121-123℃灭菌 35min。
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