CN114891641B - 一种产淀粉酶的菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明所述菌株为菌株Aspergillus flavus 9263，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62292。本发明的菌株Aspergillus flavus 9263的培养基成分简单，培养条件宽松，增值快。所产生的淀粉酶对温度和pH值有较宽的耐受范围，可在pH 2.0～11.0的范围内保持较高活性。
Description
技术领域
本发明涉及属于生物技术领域，具体涉及一种新的菌株及其应用，更具体地，涉及一种产淀粉酶的菌株及其应用。
背景技术
淀粉酶(amylase)是指能水解淀粉，糖原等相关多糖的酶类总称，应用于淀粉糖浆、传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是用途最广产量最大的酶制剂之一。微生物是工业淀粉酶的主要来源之一，已知众多细菌及真菌可以产生淀粉酶，且以芽孢杆菌属(Bacillus)中细菌代谢产生淀粉酶的研究报道居多。其中，凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(B.licheninformis)等均能产生高温淀粉酶。
淀粉酶具有广泛的应用领域，如：应用于淀粉加工业制造葡萄糖，麦芽糖等；应用于食品工业制作果汁、香料、味精、面包等；应用于酿造发酵工业制作白酒、啤酒、酱油、醋等；应用于医药领域制备诊断酶、消化药等。然而，如此广泛的应用要求淀粉酶不仅要活力高，还要具备不同酸碱稳定性及热稳定性以适应不同行业的需求。然而现有淀粉酶耐酸碱稳定性差，因此，筛选产耐酸碱稳定性的淀粉酶的优良菌株仍非常必要。
发明内容
发明概述
一方面提供一种新的能产淀粉酶的菌株，所述菌株具有良好的耐酸碱稳定性。
另一方面提供该菌株的用途和培养方法，以及利用该菌株生产淀粉酶的方法以及所产的淀粉酶。
发明详述
第一方面，提供一种新的菌株。
一种菌株Aspergillusflavus 9263，所述菌株Aspergillusflavus9263分离自中华人民共和国南海海水(站点站位112.69°E，18.56°N，1000米)，并已于2002年3月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：62292。该菌需氧生长，最适生长pH为6.0～8.0，最适生长温度为28℃～37℃，最适生长NaCl浓度为2％(W/V)～5％(W/V)。
所述菌株Aspergillus flavus 9263(下文简称“菌株9263”或“9263”)能够在含有淀粉的培养环境下产生淀粉酶。所述述菌株Aspergillusflavus9263所产生的淀粉酶的反应条件为pH 3.0～7.0，35～75℃，最适条件为pH5.0，温度为55℃。进一步研究发现，所述菌株Aspergillusflavus 9263产生的淀粉酶在较为宽泛的pH范围内(2.0～11.0)耐酸碱稳定性好，在该较为宽泛的pH范围内(2.0～11.0)放置后仍能表现出令人满意的活性，具有广泛的应用前景。
第二方面，提供所述菌株Aspergillus flavus 9263的用途。
一种第一方面所述菌株Aspergillusflavus 9263在生产淀粉酶上的用途。
第三方面，提供一种生产淀粉酶的方法。
一种生产淀粉酶的方法，其包括将第一方面所述菌株Aspergillus flavus 9263进行培养的步骤和获取发酵液中的淀粉酶的步骤。
所述培养可以包括在培养基中于20℃-40℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃)的条件下培养。在一些实施例中，所述培养包括在培养基中于20℃-40℃(例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃)的条件下恒温培养。在一些实施例中，所述培养可以包括在培养基中于25℃-37℃的条件下培养。在一些实施例中，所述培养可以包括在培养基中于28℃-37℃的条件下培养。
所述培养基可以包括含淀粉的培养基或含淀粉和1％(W/V)-5％(W/V)氯化钠的培养基。在一些实施例中，所述培养基包括含1％(W/V)-5％(W/V)(例如1％(W/V)、1.5％(W/V)、2％(W/V)、2.5％(W/V)、3％(W/V)、3.5％(W/V)、4％(W/V)、4.5％(W/V)或5％(W/V))氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂培养基或含1％(W/V)-5％(W/V)((例如1％(W/V)、1.5％(W/V)、2％(W/V)、2.5％(W/V)、3％(W/V)、3.5％(W/V)、4％(W/V)、4.5％(W/V)或5％(W/V)))氯化钠的马铃薯葡萄糖水培养基。在一些实施例中，所述培养基可以包括含2％(WN)-5％(W/V)氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂培养基或含2％(W/V)-5％(W/V)氯化钠的马铃薯葡萄糖水培养基。
所述氯化钠可以为海盐。
当培养液中的菌浓度达到一定值时可通过过滤的方法获得菌体，并通过超声破壁的方法获取粗酶液。
第四方面，提供通过上述方法获得的淀粉酶。
一种通过第三方面所述方法所得淀粉酶。
研究发现，所述菌株Aspergillusflavus 9263产生的淀粉酶在较为宽泛的pH范围内(2.0～11.0)耐酸碱稳定性好，表现出令人满意的活性，具有广泛的应用前景。
所述淀粉酶的反应条件的pH可以为3.0～7.0(例如：pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH6.5或pH7.0)。在一些实施例中，所述淀粉酶的最适反应条件的pH为5.0。
所述淀粉酶的反应条件的温度可以为35℃～75℃(例如：35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或75℃)。在一些实施例中，所述淀粉酶的反应条件的温度为35℃～55℃。
有益效果
相比现有技术，本发明的某一实施例至少包括以下一个有益效果：
(1)本发明的菌株Aspergillusflavus 9263能培养产生淀粉酶，其培养条件简单，温和，成本低；本发明的菌株Aspergillusflavus 9263产生淀粉酶的速度快，产率高，纯度高，活性高。
(2)本发明的菌株Aspergillus flavus 9263培养基成分简单，培养条件宽松，增值快。
(3)本发明的菌株Aspergillusflavus 9263所产生的淀粉酶能够对温度和pH值有较宽的耐受范围，可在pH 2.0～11.0的范围内存放后仍能保持较高活性。
(4)本发明的菌株Aspergillusflavus 9263所产生的淀粉酶的反应条件优选为pH为3.0～7.0，温度为35～75℃的条件下反应，更优选为pH5.0、温度为55℃的条件下反应。
因此，本发明的菌株以及由该菌株生产的淀粉酶在医药、化工和食品等众多的领域和工业，特别是经历pH变化那些工艺中，具有广阔的应用前景。
附图说明：
图1为菌株9263的系统发育树。
图2为实施例2中菌株9263所产淀粉酶在不同温度下的相对活性变化曲线图。
图3为实施例2中以不同温度处理菌株9263所产淀粉酶对其活性的影响曲线图。
图4为实施例3中菌株9263所产淀粉酶在不同pH条件下相对活性变化曲线图。
图5为实施例3中在不同pH条件处理菌株9263所产淀粉酶对其活性的影响曲线图。
术语说明
术语“W/V”表示质量体积比，例如含1％(W/V)氯化钠的马铃薯葡萄糖水培养基表示100mL含氯化钠的马铃薯葡萄糖水培养基溶液中的海盐的质量为1g。
1个酶活单位(U)定义为：在55℃、pH5.0条件下，1min内酶解淀粉生成1mg还原糖(以葡萄糖为标准)所需的酶(或菌体)量。
术语“U/g”表示酶比活，即每克酶或菌体所含酶活力。
在本发明的上文中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。基于公开的数字，每一个数字的数值有可能会出现±10％以下的差异或者本领域人员认为的合理的差异，如±1％、±2％、±3％、±4％或±5％的差异。
术语“室温”是指温度在大约18℃至大约35℃，或大约20℃至30℃，或大约25℃。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，但本发明不限于下述实施例。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
以下实施例中淀粉酶活性测定及表征方法如下：
利用DNS(3，5-Dinitrosalicylic acid，3，5-二硝基水杨酸)法测定淀粉酶活性。
在碱性条件下，二硝基水杨酸(DNS)与还原糖发生氧化还原反应，生成的3-氨基-5-硝基水杨酸在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系，可用比色法测定还原糖含量。
DNS试剂的配制：取适量去离子水煮沸10min后冷却至室温，用于DNS试剂配制。称取6.3g 3，5-二硝基水杨酸溶于少量水中，加入21.0g氢氧化钠充分溶解于约500mL水中，再依次溶解182.0g酒石酸钠，5.0g苯酚，5.0g亚硫酸钠，定容1L后储存棕色瓶中放置于4℃保存、备用。
葡萄糖标准曲线的制作：无菌去离子水分别配制0.08、0.16、0.24、0.32和0.4μg/μL的葡萄糖溶液。以纯水为空白对照，各设3个平行，分别取250μL上述溶液与450μL DNS溶液混合后置沸水浴中5min，冷却至室温，取200μL反应液于96孔板中测定540nm处吸光度。以葡萄糖质量为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。
实施例1：菌株9263的分离鉴定
纯化得到的所述菌株9263经ITS序列比对，与Aspergillus flavus有最高的相似性(为99.82％)，命名为Aspergillus flavus 9263。
取所述菌株9263(湿重)测定其酶比活，所述菌株9263(湿重)的酶比活为33.163U/g(即每克所述菌株9263(湿重)的1分钟能转化淀粉酶水解生成33.163mg的还原糖)。
挑取9263菌落接入装有200mL含3％(W/V)氯化钠的PDA液体培养基试管中，28℃，180rpm/min摇床培养48h，用茶袋收集菌体，超声破壁，获得的破壁液作为粗酶液，用于淀粉酶活测定。
实施例2：菌株9263所产淀粉酶最适反应温度及其热稳定性
1)pH7.0的磷酸缓冲液配制1.0％可溶性淀粉溶液。取1.0％可溶性淀粉溶液150μL置于2.0mL离心管中，分别在25℃、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、75℃水浴中预热10min，加入100μL实施例1制备的粗酶液，精确反应20min后，加入450μL DNS溶液混合后置沸水浴中5min，冷却至室温，取200μL反应液于96孔板中测定540nm处吸光度。每组设置3个平行样，各温度梯度以煮沸5min失活的粗酶液为阴性对照，以55℃反应体系的酶活力为100％，计算该酶在各温度下的相对活性并做图。结果显示，该酶在45～55℃反应体系中表现出较高相对酶活性(大于80％)，在55℃时表现出最大酶活性。
2)将实施例1制备的粗酶液分别在37℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃水浴中分别热处理0h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h后，按实施例2中1)所述方法测定酶活力。以未经处理的原酶液活力为100％，计算该酶的热稳定性(见图3)。结果显示，在55℃条件下热处理1h，剩余相对酶活仍高于50％。
实施例3：菌株9263所产淀粉酶最适反应pH及其酸碱稳定性
1)用磷酸缓冲液分别配制pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13的1％可溶性淀粉溶液。每组设置3个平行样，各pH梯度以煮沸5min失活的粗酶液为阴性对照，测定淀粉酶活性。以pH5.0反应体系的酶活力为100％，计算该酶在各pH下的相对活性(见图4)。结果显示，该酶在pH4.0～5.0反应体系中表现出较高相对酶活性(大于80％)，在pH5.0反应体系中表现出最大酶活性。
2)用上述pH缓冲液及浓盐酸，氢氧化钠溶液分别调整粗酶液的pH值为2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13于室温放置60min，在pH 5.0，温度55℃下测定剩余酶活。以未处理的原酶液活力为100％，计算该酶的酸碱稳定性(见图5)。结果显示，该酶在pH4.0～9.0范围内均比较稳定，剩余相对酶活性均高于70％。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (5)
1.一种菌株Aspergillus flavus 9263，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62292。
2.如权利要求 1 所述的菌株Aspergillus flavus 9263用于产生淀粉酶的用途。
3.一种生产淀粉酶的方法，包括 ： 将权利要求 1所述的菌株Aspergillus flavus9263进行培养后获得菌株中的淀粉酶， 其中所述培养包括在培养基中于20℃-40℃的条件下培养，所述菌株Aspergillus flavus 9263所产生的淀粉酶的反应条件为 pH 3.0 ～7.0，35 ～ 75℃，最适条件为 pH 5.0，温度为 55℃。
4.根据权利要求3所述的方法，所述培养基包括含淀粉的培养基或含淀粉和1%（W/V）-5%（W/V）氯化钠的培养基。
5.根据权利要求3所述的方法，所述培养基包括含1%（W/V）-5%（W/V）氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂培养基或含1%（W/V）-5%（W/V）氯化钠的马铃薯葡萄糖水培养基。
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