CN110117550A - 基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺及酿酒酵母 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母，其生物保藏号为CCTCC NO M2018718，并结合该酿酒酵母研究出了根皮素的生产工艺，主要包括培养基活化酿酒酵母菌株、扩大培养、发酵罐发酵培养、接种、补料以及发酵生产过程，提供了一种成本低、设备要求简单、生产试剂无毒无害、符合绿色生产理念的根皮素生产工艺，且根皮素的产量可观。

Description

基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺及酿酒酵母
技术领域
本发明属于根皮素的合成技术领域，尤其涉及到一种酿酒酵母以及利用酿酒酵母合成根皮素的工艺。
背景技术
酵母是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，培养方式简单。酵母克隆载体的种类也很多。酵母菌也有质粒存在，这种2pm 长的质粒称为2um 质粒，约6300bp。这种质粒至少有一段时间存在于细胞核内染色体以外，利用2pm 质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的穿梭质粒，酵母克隆载体都是在这个基础上构建的。根皮素是国内外最新研究开发的的一种天然皮肤美白剂，根皮素能抑制皮脂腺的过度分泌，用于治疗分泌旺盛型粉刺;能抑制黑色素细胞活性，对各种皮肤色斑有作用。与同类天然成分熊果苷和曲酸相比，同等浓度的根皮素对酪氨酸酶的抑制作用要好于它们，并且当其与熊果苷和/或曲酸进行复配时，能大大提高产品对酪氨酸酶的抑制率，使抑制率达到100%。目前国内根皮素的合成工艺都是以植物提取或化学合成为主要途径，这两个途径制得的根皮素虽然也可以达到很高的纯度，但是成本过高，就植物提取而言，操作过于复杂，原料的消耗过多，不利于可持续性发展。
经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN101701226A，公开日2010.05.05，记载了一种“酶解法生产根皮素的方法”，该技术包括如下步骤：将根皮苷质量含量为10%~80%的根皮苷原料溶于去离子水中；加入活化的sino-β水解酶，所述根皮苷原料与所述sino-β水解酶的质量比为1~50∶1，在20℃~90℃，在搅拌下，酶解反应5~72小时；迅速升温到60℃~100℃灭活15~35min；固液分离，固体经干燥，得根皮素。但是该技术需要使用价格较高的根皮苷与水解酶作为原料，大大增加了根皮素的成本，不利于开展较大的工业化生产。
其中，酵母菌作为一种常见的单细胞真菌，价格低廉，使用其发酵合成根皮素，原料易得，实验操作简单，设备的要求较低，试剂无毒无害，符合绿色生产的理念，并且根皮素的产量相当可观。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用酿酒酵母生产根皮素的工艺，增加了生产根皮素的原料种类的选择，开发了一种新的根皮素合成工艺，本发明符合绿色生产的理念，对设备的要求较低，操作简单，无毒无害，并且根皮素的产量相当可观。
本发明的目的是通过以下技术解决方案来实现的，本发明提供了一种酿酒酵母，其生物保藏号为CCTCC NO M2018718。
同时，本发明提供了基于该酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）培养基活化酿酒酵母菌株：将保藏编号为CCTCC NO M2018718的酿酒酵母放入CM-l-u-t培养基中进行培养，将培养基于600nm波长下测定菌液的吸光度值，培养至菌液的吸光度值在4~6之间；
2）扩大培养：取上述菌液，加入到YPAD培养基中进行培养，所述菌液与YPAD培养基的体积比为1:100；
3）发酵罐发酵培养：进行发酵培养基的配置，将所述发酵培养基放入发酵罐中进行灭菌处理，灭菌完成之后，调节发酵液的pH，使发酵液的pH稳定在5.1~5.3之间；
4）接种：利用火焰接种法对用YPAD培养基培养的酿酒酵母在步骤3中的发酵培养基中进行接种，培养至发酵罐内的菌液在基于600nm波长下吸光度值在1.5~3之间；
5）补料：在发酵24小时，发酵罐溶氧降到40%或者发酵液在基于600nm波长下测定菌液的吸光度值达到20时，开始分时段添加补料培养基，使得酵母菌将每个时间段补料培养基中含有的葡萄糖完全消耗；
6）补料完毕，发酵液在基于600nm波长下测定菌液的吸光度值达到110以上，添加底物使其合成根皮素，所述底物为对羟基苯丙酸与丙二酸或者对羟基苯丙酸与丙二酸钠；
其中，1000ml的所述缺陷型CM-l-u-t培养基组成为：酵母氮源6.7g、腺嘌呤50mg、组氨酸100mg、dropout powder 0.83g溶解于950mL超纯水，调节pH至5.6，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖溶液50mL，混匀，备用；
3000ml的所述发酵培养基组成为：葡萄糖66g、硫酸铵45g、磷酸二氢钾24g、七水合硫酸镁18.6g、dropout powder 6g、trace metal solution 30mL、浓度为2g/L的二水合氯化钙3mL，以及组氨酸7.5g溶解于2877mL超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加过滤除菌的浓度为10%的腺嘌呤水溶液75mL和过滤除菌的Vitamin solution 48mL，混匀，备用，所述Vitamin solution组成为：称取0.05 g生物素 ，1 g泛酸钙 ，1 g烟酸 ，25 g肌醇 ，1 g硫胺素 ，1 g吡哆醛以及0.2 g对氨基苯甲酸，溶解于1000mL水中，过滤除菌。
进一步，所述YPAD培养基组成为：酵母提取物10g、腺嘌呤50mL和蛋白胨20g溶解于950ml超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖溶液50mL，混匀备用。
进一步，所述步骤3中的灭菌条件为121℃，30min。
进一步，所述补料培养基包括第一补料培养基与第二补料培养基，
进一步，所述第一补料培养基组成为：七水合硫酸镁10.24g、dropout powder 4g、trace metal solution 20mL、腺嘌呤10g、质量浓度为2g/L的二水合氯化钙2mL、组氨酸10g、硫酸钾7g以及硫酸钠0.56g溶解于超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加过滤除菌的维生素溶液32mL、高压灭菌的浓度为57.2%的葡萄糖1350ml、高压灭菌的浓度为18%的磷酸二氢钾100ml，混匀备用；
所述第二补料培养基组成为：七水合硫酸镁10.24g、dropout powder 4g、trace metalsolution 20mL、腺嘌呤10g、质量浓度为2g/L的二水合氯化钙2mL、组氨酸10g、硫酸钾7g以及硫酸钠0.56g溶解于超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为53.3%的葡萄糖1450ml，过滤除菌的维生素溶液 32mL，混匀备用。
本发明还提供了另一种基于该酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，包括以下步骤：
1）培养基活化酿酒酵母菌株：将保藏编号为CGMCC No：M2018718的酿酒酵母放入CM-l-u-t培养基中进行培养，将培养基于600nm波长下测定菌液的吸光度值，培养至菌液的吸光度值在4~6之间；
2）摇瓶发酵培养：使用移液管精密移取实施例1中的菌液2mL，按百分之一的比例加入到经过高压灭菌处理的，装有200mL CM-l-u-t培养基的锥形瓶中， 添加0.5g/mL的底物各80μL使其合成根皮素，使菌液中底物的浓度达到200mg/L，所述底物为对羟基苯丙酸与丙二酸或者对羟基苯丙酸与丙二酸钠。
进一步，1000ml的所述CM-l-u-t培养基组成为：无氨基酵母氮源6.7g、腺嘌呤50mg、组氨酸100mg和dropout powder 0.83g，溶解于超纯水，调节pH为5.6，定容至950mL，高压灭菌，然后冷却至室温，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖水溶液50mL，混合均匀，备用；
本发明的有益效果在于：
本发明采用的原料来自本公司自行研发的一种可以通过发酵产生根皮素的酵母菌菌株，增加了生产根皮素的原料种类的选择，开发了一种新的根皮素生产工艺，本发明符合绿色生产的理念，原料易得，实验操作简单，设备的要求较低，试剂无毒无害，对原料的转化率可以达到90%以上。
本发明利用本公司自行研发的一种特殊的酵母菌进行发酵产生根皮素，其优点在于:酵母菌作为一种常见的单细胞真菌，价格低廉，并且可以对酵母菌进行保种，从而达到重复利用的效果，具有可持续性发展的优点。
本发明采用的其它试剂相较于另外两种根皮素的生产方法而言，价格更加低廉，更进一步压低了生产根皮素的成本，从而可以使本发明生产的酵母菌价格更加稳定，受市场价格波动的影响较小。
具体实施方式
为了使得本公开实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本公开实施例，对本公开实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本公开的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
本发明公开了一种酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae），其保藏单位代码CCTCC-中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2018年10月26日，保藏编号为CCTCC NO：M2018718，分类命名：酿酒酵母CM-leu-trp-ura-181016，检测完毕结果为存活状态，本发明还提供了利用其来进行生产根皮素的工艺，下面结合实施例进行详细说明。
实施例1
本实施例提供CM-l-u-t培养基活化酿酒酵母的过程：
将冻存的生物保藏号为CCTCC NO M2018718的酿酒酵母解冻，按百分之一的比例加入到缺陷型CM-l-u-t培养基中进行培养，该培养基组成无氨基酵母氮源6.7g、腺嘌呤50mg、组氨酸100mg、 dropout powder 0.83g，溶解于超纯水，调节pH为5.6，定容至950mL，高压灭菌，然后冷却至室温，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖水溶液50mL，混合均匀，备用；本次实验将150mL的缺陷型CM-l-u-t培养基加入到经过高压灭菌处理过的250mL锥形瓶中，并且加入1.5mL的酿酒酵母菌液，进行菌种的活化，培养至菌液的OD600（即为基于600nm波长下测定菌液的吸光度值）达到4-6为止，培养条件：温度30℃，转速220r/min。
实施例2
本实施例提供YPAD培养基扩大培养过程：
使用移液管精密移取实施例1中的菌液10mL，按百分之一的比例加入到经过高压灭菌处理的，装有1000ml的 YPAD培养基的2L锥形瓶中，其中YPAD培养基组成为：酵母提取物10g、腺嘌呤50mL和蛋白胨20g溶解于950ml超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖溶液50mL。
对酵母菌进行YPAD培养基培养，培养至菌液的OD600达到4.5~9为止，培养条件：温度30℃，转速220 r/min。
实施例3
本实施例提供发酵罐发酵培养过程：
首先，发酵过程，取上述实施例2中的菌液进行发酵罐发酵，完整的步骤如下：配制发酵培养基，3000ml的所述发酵培养基组成为：葡萄糖66g、硫酸铵45g、磷酸二氢钾24g、七水合硫酸镁18.6g、dropout powder 6g、trace metal solution 30mL、浓度为2g/L的二水合氯化钙3mL，以及组氨酸7.5g溶解于2877mL超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加过滤除菌的浓度为10%的腺嘌呤水溶液75mL和过滤除菌的Vitamin solution（维生素溶液） 48mL，混匀，备用，所述Vitamin solution组成为：称取0.05 g生物素 ，1 g泛酸钙 ，1 g烟酸 ，25 g肌醇 ，1 g硫胺素 ，1 g吡哆醛以及0.2 g对氨基苯甲酸，溶解于1000mL水中，过滤除菌，备用使用氢氧化钠溶液以及磷酸调节罐内pH，并且使其pH保持在5.1~5.3之间，用火焰接种法将1L酵母菌菌液接种到发酵罐中，必须保证接种完毕后，罐内菌液的OD600在1.5-3之间，此时发酵罐内的液体体积为3L，调节转速为300 r/min，并在溶氧界面设置串级转速。
其次，补料过程，当发酵时间达到24小时，罐内发酵液溶氧下降到40%或者罐内菌液的OD600达到20时，使用拟指数补料方式添加补料培养基对发酵液进行补料，补料培养基包括第一补料培养基以及第二补料培养基，第一补料培养基组成为：所述第一补料培养基组成为：七水合硫酸镁10.24g、dropout powder 4g、trace metal solution 20mL、腺嘌呤10g、质量浓度为2g/L的二水合氯化钙2mL、组氨酸10g、硫酸钾7g以及硫酸钠0.56g溶解于超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加过滤除菌的维生素溶液32mL、高压灭菌的浓度为57.2%的葡萄糖1350ml、高压灭菌的浓度为18%的磷酸二氢钾100ml，混匀备用；
第二补料培养基组成为：七水合硫酸镁10.24g、dropout powder 4g、trace metalsolution 20mL、腺嘌呤10g、质量浓度为2g/L的二水合氯化钙2mL、组氨酸10g、硫酸钾7g以及硫酸钠0.56g溶解于超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为53.3%的葡萄糖1450ml，过滤除菌的维生素溶液 32mL，混匀备用。
在补料过程中，先使用营养成分较高的第一补料培养基，待第一补料培养基消耗完，再使用第二补料培养基，拟指数补料方式的公式如下：
其中X0是t0时刻的生物量, g/L；V0 是t0 时刻的体积, L；μset是酵母的生长速率, h-1；F(t) 补料速率，L/h；SF 补料培养基中的葡萄糖的浓度, g/L；YX/S酿酒酵母表观系数, gDCW (细胞干重)/g葡萄糖； t 补料时间, h。
最后，生产过程，在补料完成，且当菌液的OD600达到110以上时开始添加7g对羟基苯丙酸和7g丙二酸，如底物不足还可补加，最后就可以经过宿主菌体内若干酶的催化从而生成根皮素，经过液相检测发现，最终根皮素的浓度为0.7g/L。
实施例4
本实施例同实施例3一样提供发酵罐发酵培养过程，区别在于，在本实施例中，补料方式采用分时段补料方式对发酵液进行补料，具体补料方式为：当发酵时间达到24小时，罐内发酵液溶氧下降到40%或者罐内菌液的OD600达到20时，对发酵液进行补料，开始补料后的10小时以内，采用5mL/h/L的速率进行补料，开始补料后的10~12小时，ongoing15mL/h/L，开始补料后的12~20小时，为20mL/h/L，开始补料后的20~30小时，为25mL/h/L，开始补料后的30~64小时，则为15mL/h/L。补料完毕且当菌液的OD600达到110以上时开始添加7g对羟基苯丙酸和7g丙二酸，如底物不足还可补加，最后就可以经过宿主菌体内若干酶的催化从而生成根皮素，经过液相检测发现，最终根皮素的浓度为0.65g/L。
实施例5
本实施例同实施例3一样提供发酵罐发酵培养过程，区别在于，在本实施例中，底物为对羟基苯丙酸和丙二酸钠，区别过程如下：当发酵时间达到24小时，罐内发酵液溶氧下降到40%或者罐内菌液的OD600达到20时，使用拟指数补料方式对发酵液进行补料，当菌液的OD600达到110以上时开始添加7g对羟基苯丙酸和7g丙二酸钠，如底物不足还可补加，最后就可以经过宿主菌体内若干酶的催化从而生成根皮素，经过液相检测发现，最终根皮素的浓度为0.65g/L。
实施例6
本实施例同实施例3一样提供发酵罐发酵培养过程，区别在于，在本实施例中，底物的添加时间进行了变化，区别过程如下：当发酵时间达到24小时，罐内发酵液溶氧下降到40%或者罐内菌液的OD600达到20时，使用拟指数补料方式对发酵液进行补料，当菌液的OD600达到55以上时开始添加3.5g对羟基苯丙酸和3.5g丙二酸钠，如底物不足还可补加，最后就可以经过宿主菌体内若干酶的催化从而生成根皮素，经过液相检测发现，最终根皮素的浓度为0.72g/L。
实施例7
本实施例提供摇瓶发酵培养过程：
使用移液管精密移取实施例1中的菌液2mL，按百分之一的比例加入到经过高压灭菌处理的，装有200 mL缺陷型CM-l-u-t培养基的250mL锥形瓶中，并且加入0.5g/mL的底物（对羟基苯丙酸和丙二酸）各80μL，对酵母菌进行缺陷型CM-l-u-t培养基的摇瓶培养，培养条件：温度30℃，转速220r/min，从第四天开始对摇瓶内的根皮素含量进行跟踪监测，最终得到根皮素最高浓度为130mg/L。
综上所述，本发明通过酿酒酵母实现了根皮素的生产，证明该工艺是可实施的，并且酵母菌作为一种常见的单细胞真菌，价格低廉，使用其发酵合成根皮素，原料易得，实验操作简单，设备的要求较低，试剂无毒无害，符合绿色生产的理念，且根皮素的产量相当可观。综上所述，上述实施方式并非是本发明的限制性实施方式，凡本领域的技术人员在本发明的实质内容的基础上所进行的修饰或者等效变形，均在本发明的技术范畴。

Claims (7)

1.一种酿酒酵母，其生物保藏号为CCTCC NO M2018718。
2.基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）培养基活化酿酒酵母菌株：将保藏编号为CCTCC NO M2018718的酿酒酵母放入CM-l-u-t培养基中进行培养，将培养基于600nm波长下测定菌液的吸光度值，培养至菌液的吸光度值在4~6之间；
2）扩大培养：取上述菌液，加入到YPAD培养基中进行培养，所述菌液与YPAD培养基的体积比为1:100，在YPAD培养基中培养4-6小时，备用接种至发酵罐上；
3）发酵罐发酵培养：进行发酵培养基的配制，将所述发酵培养基放入发酵罐中进行高压灭菌处理，灭菌完成之后，调节发酵液的pH，使发酵液的pH稳定在5.1~5.3之间；
4）接种：利用火焰接种法对用YPAD培养基培养4-6小时的酿酒酵母在步骤3中的发酵培养基中进行接种；
5）补料：在发酵24小时，发酵罐溶氧降到40%或者发酵液在基于600nm波长下测定菌液的吸光度值达到18~22时，开始分时段添加补料培养基，使得酵母菌将每个时间段补料培养基中含有的葡萄糖完全消耗；
6）补料完毕，发酵液在基于600nm波长下测定菌液的吸光度值达到110以上，添加底物使其合成根皮素，所述底物为对羟基苯丙酸与丙二酸或者对羟基苯丙酸与丙二酸钠；
其中，1000ml的所述缺陷型CM-l-u-t培养基组成为：无氨基酵母氮源6.7g、腺嘌呤50mg、组氨酸100mg、 dropout powder 0.83g，溶解于超纯水，调节pH为5.6，定容至950mL，高压灭菌，然后冷却至室温，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖水溶液50mL，混合均匀，备用；
3000ml的所述发酵培养基组成为：葡萄糖66g、硫酸铵45g、磷酸二氢钾24g、七水合硫酸镁18.6g、dropout powder 6g、trace metal solution 30mL、浓度为2g/L的二水合氯化钙3mL、以及组氨酸7.5g溶解于2877mL超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加过滤除菌的浓度为10%的腺嘌呤水溶液75mL和过滤除菌的Vitamin solution 48mL，混匀，备用；
所述Vitamin solution组成为：称取0.05 g生物素 ，1 g泛酸钙 ，1 g烟酸 ，25 g肌醇，1 g硫胺素 ，1 g吡哆醛以及0.2 g对氨基苯甲酸，溶解于1000mL水中，过滤除菌，备用。
3.如权利要求1所述基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于，所述YPAD培养基组成为：酵母提取物10g、腺嘌呤50mL和蛋白胨20g溶解于950ml超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖溶液50mL。
4.如权利要求1所述基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于所述步骤3中的灭菌条件为121℃，30min。
5.如权利要求1所述基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于，所述补料培养基包括第一补料培养基与第二补料培养基，
所述第一补料培养基组成为：七水合硫酸镁10.24g、dropout powder 4g、trace metalsolution 20mL、腺嘌呤10g、质量浓度为2g/L的二水合氯化钙2mL、组氨酸10g、硫酸钾7g以及硫酸钠0.56g溶解于超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加过滤除菌的维生素溶液32mL、高压灭菌的浓度为57.2%的葡萄糖1350ml、高压灭菌的浓度为18%的磷酸二氢钾100ml，混匀备用；
所述第二补料培养基组成为：七水合硫酸镁10.24g、dropout powder 4g、trace metalsolution 20mL、腺嘌呤10g、质量浓度为2g/L的二水合氯化钙2mL、组氨酸10g、硫酸钾7g以及硫酸钠0.56g溶解于超纯水，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为53.3%的葡萄糖1450ml，过滤除菌的维生素溶液 32mL，混匀备用。
6.基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1）培养基活化酿酒酵母菌株：将保藏编号为CGMCC No（）的酿酒酵母放入CM-l-u-t培养基中进行培养，将培养基于600nm波长下测定菌液的吸光度值，培养至菌液的吸光度值在4~6之间；
2）摇瓶发酵培养：使用移液管精密移取实施例1中的菌液2mL，按百分之一的比例加入到经过高压灭菌处理的，装有200mL CM-l-u-t培养基的锥形瓶中， 添加0.5g/mL的底物各80μL使其合成根皮素，使菌液中底物的浓度达到200mg/L，所述底物为对羟基苯丙酸与丙二酸或者对羟基苯丙酸与丙二酸钠。
7.如权利要求6所述基于酿酒酵母发酵生产根皮素的工艺，其特征在于，1000ml的所述CM-l-u-t培养基组成为：无氨基酵母氮源6.7g、腺嘌呤50mg、组氨酸100mg、和dropoutpowder 0.83g溶解于950mL超纯水，调节pH至5.6，高压灭菌，冷却至室温后，添加高压灭菌的浓度为40%的葡萄糖溶液50mL，混匀备用。
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