CN105874076A - 使用转糖苷酶的增强发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于改善发酵工艺的方法，所述方法包括提高产品收率、降低粘度和/或减少发泡。

Description

使用转糖苷酶的增强发酵工艺
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2013年10月24日的国际专利申请PCT/CN2013/085866的优先权，该申请的内容全文以引用方式并入本文。
发明领域
本发明涉及使用转糖苷酶制剂改进发酵工艺。还提供了用于筛选合适的发酵宿主和发酵产物以获得改进的方法。
相关领域的描述
工业生物技术代表着生物技术的第三波浪潮，如今越来越多的公司开始关注特种化学品，并利用其作为切入点来构建生物经济。谷氨酸、赖氨酸、乳酸是工业生物技术中有待进一步研究和开发的主要对象。生物炼制的目标是尽可能由生物质开发更多的产品和价值流。现有生物炼制发酵技术的背景总结可见于Eggeling,L.和M.Bott，(2010).Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC press；Zahoor,A.、S.N.Lindner等人，(2012).“Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum aimed atalternative carbon sources and new products.”Computational and Structural Biotechnology Journal 3(4)；Ikeda,M.和S.Takeno，(2013).“Amino AcidProduction by Corynebacterium glutamicum.”23:107-147。
当前的挑战和目标包括最大程度地提高原材料的产品收率。尽管在这一领域已进行了许多研究，包括菌株改造、各类原材料的利用和工艺优化，但产量仍远不及理论最大值。当前的另一问题是控制需氧发酵的发泡水平。在某些情况下，可将生物反应器中发泡阶段的存在视为促进给定培养物的质量传递和生长的积极因素。在另一方面，泡沫的集中形成在很多情况下减少了液体的实际体积。此外，可能出现泡沫喷出和发酵产物损失，这会对工厂生产能力产生负面影响。并且，泡沫溢出会导致污染，因此通常需要使用消泡剂来控制泡沫，这可能会增加成本并对用于回收最终产物的下游处理产生负面影响。在需氧发酵过程中，通常通过发泡来控制每一反应器中发酵液的最大量，因此在工业实践中，填充程度(测定为质量/反应器体积)在70％和85％之间变化。发泡受发酵液的密度、生产菌株的表面组成、培养基组成、工艺条件、发酵培养基的粘度等影响。虽然有一些研究关注于泡沫的形成(参见例如，Eggeling,L.、K.Krumbach等人，(2001).“L-glutamate efflux with Corynebacterium glutamicum:why ispenicillin treatment or Tween addition doing the same？”Journal of molecular microbiology and biotechnology 3(1):67-68；Eggeling,L.和H.Sahm，(2001).“The cell wall barrier of Corynebacterium glutamicum and amino acid efflux.”Journal of bioscience and bioengineering 92(3):201-213；Eggeling,L.和M.Bott，(2010).Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC press；Yang,Y.、F.Shi等人，(2012).“Purification and structure analysis of mycolic acidsin Corynebacterium glutamicum.”The Journal of Microbiology 50(2):235-240)，但仍未有关于通过使用额外的酶减少发泡的报道。本研究的另一个领域涉及提高生物炼制发酵的下游工艺效率。从发酵液中回收氨基酸和有机酸的工艺可包括常规色谱方法、浓缩结晶方法、直接干燥方法、钙盐沉淀法等等。还经常使用离心、过滤、超滤、结晶、喷雾干燥等来回收发酵产物。
发明内容
一种制备发酵产物的方法，该方法包括：在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并且其中发酵产物的收率高于不含转糖苷酶的对照发酵。在一些实施方案中，所述方法还包括回收发酵产物。在一些实施方案中，发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。在一些实施方案中，发酵生物为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178、谷氨酸棒状杆菌10238或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。在一些实施方案中，转糖苷酶包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:180％、85％、90％、95％、98％、99％相同的任何序列。在一些实施方案中，转糖苷酶在木霉属中产生。在一些实施方案中，原料包含液化淀粉、颗粒状淀粉、纯葡萄糖、纯蔗糖或糖浆。在一些实施方案中，所述方法还包括减少发酵液中的泡沫和/或降低发酵液的粘度。在一些实施方案中，转葡糖苷酶制剂(TrTG)以发酵原料的1Kg/MT至6Kg/MT、2Kg/MT至5Kg/MT或2Kg/MT至4Kg/MT干固形物的量存在。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种筛选发酵益处以识别有益的转糖苷酶的方法，该方法包括：在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并且其中发酵产物的收率高于不含转糖苷酶的对照发酵；以及从这些发酵产物中识别有益的转糖苷酶。在一些实施方案中，发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种筛选发酵益处以识别有益的转糖苷酶的方法，该方法包括：在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并且其中与不含转糖苷酶的对照反应相比，所述发酵的发酵液中包括减少所述发酵液中的泡沫和/或降低所述发酵液的粘度；以及从这些发酵产物中识别有益的转糖苷酶。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括：在发酵液中用黄色短杆菌发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含TrTG，其中赖氨酸的收率比不含TrTG的对照发酵高，并且其中发酵液的粘度与不含TrTG的对照发酵相比降低。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括：在发酵液中用黄色短杆菌发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含黑曲霉(A.Niger)TG，其中赖氨酸的收率比不含黑曲霉TG的对照发酵高。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括：在发酵液中用黄色短杆菌发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含转葡糖苷酶，其中赖氨酸的收率比不含转葡糖苷酶的对照发酵高。在一些实施方案中，原料包含纯葡萄糖或糖浆。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备赖氨酸的方法，该方法包括：在发酵液中用黄色短杆菌发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，其中赖氨酸的收率比不含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵高。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备谷氨酸的方法，该方法包括：在发酵液中用谷氨酸棒状杆菌SP 10238发酵原料以制备谷氨酸，其中所述发酵包含TrTG，其中发酵液的粘度与不含TrTG的对照发酵相比降低，并且其中发酵液中的泡沫与不含TrTG的对照发酵相比有所减少。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备谷氨酸的方法，该方法包括：在发酵液中用谷氨酸棒状杆菌SP 10238发酵原料以制备谷氨酸，其中所述发酵包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶，其中发酵液的粘度与不含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶的对照发酵相比降低，并且其中发酵液的粘度与不含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶的对照发酵相比降低。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备乳酸的方法，该方法包括：在发酵液中用鼠李糖乳杆菌发酵原料以制备乳酸，其中所述发酵包含TrTG，其中乳酸的收率比不含TrTG的对照发酵高，并且其中发酵液的粘度与不含TrTG的对照发酵相比降低。在一些实施方案中，原料包含纯葡萄糖或糖浆。
在一些实施方案中，本教导内容提供了一种制备乳酸的方法，该方法包括：在发酵液中用鼠李糖乳杆菌发酵原料以制备乳酸，其中所述发酵包含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，其中乳酸的收率比不含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵高，并且其中发酵液的粘度与不含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵相比降低。
更一般地说，本发明涉及在精细化工发酵过程中添加额外的酶。提高产品收率、减少消泡剂的消耗量、提高下游效率。这些目标在很大程度上可通过添加额外的酶实现，尤其是含转糖苷酶活性的酶制剂。不受理论的约束，本发明人发现，在生物炼制发酵过程中，借助于额外的酶，可获得益处，这些益处包括但不限于菌株刺激、发酵速率加快、发酵产物收率提高、最终残糖减少、消泡剂消耗量减少、发酵液粘度降低和/或沉淀/沉降速度增加。
附图简述
图1示出使用葡萄糖浆作为底物时，转葡糖苷酶对发酵液中不溶物沉降的影响。
图2示出使用纯葡萄糖作为底物时，TrTGL2000对发酵液中不溶物沉降的影响。
图3示出使用葡萄糖浆作为底物时，TrGA对发酵液中不溶物沉降的影响。
图4A至4B示出使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌10178菌株时，TrTG L2000对发酵液中不溶物沉降的影响。
图5A至5C示出使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP10238菌株时，TrTG L2000对发泡液的影响。
图6示出使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株时，ACCELLERASE DUET对发泡液的影响。
定义
如本文所用，术语“转糖苷酶”是指能够将如下文所定义的单糖部分从一个分子转移到另一个分子的任何酶或含酶制剂。术语“转葡糖苷酶”在单糖部分为葡萄糖部分时使用。在一个实施方案中，转糖苷酶为转葡糖苷酶。在一个实施方案中，转糖苷酶被归入酶类(E.C.)3.2.1.24。在一个实施方案中，转糖苷酶被归入碳水化合物活性酶(CAZy)数据库的糖苷水解酶家族31。该数据库在http://www.cazy.org/以及Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)中有所描述。这种分类系统以结构和序列特征，而不是底物特异性为基础：由于序列和折叠相似性之间存在直接关系，这种分类：(i)比单独的底物特异性更好地反映了这些酶的结构特征，(ii)有助于反映这些酶之间的进化关系，以及(iii)提供了一种便利的工具来获得机制信息。在这种分类中，糖苷水解酶(EC 3.2.1.-)是一组分布广泛的酶，其水解两个或更多个碳水化合物之间的糖苷键，或碳水化合物与非碳水化合物部分之间的糖苷键。对糖苷水解酶(糖苷酶和转糖苷酶)分类的进一步描述可见于Henrissat B(1991)、Henrissat B,Bairoch A(1993)、Henrissat B,Bairoch A(1996)、Davies G,Henrissat B(1995)和Henrissat B,Davies G J(1997)。在一个实施方案中，转糖苷酶可得自或得自活生物体。合适的转糖苷酶来源于细菌或真菌。优选的是来源于真菌的转糖苷酶。在一个实施方案中，转糖苷酶来源于真菌或与真菌来源的成熟转葡糖苷酶(即SEQ ID NO:1，在本文中称为“TrTG”，因为此转葡糖苷酶通过在木霉属中表达而制备，如WO 09/114380一般所述)具有至少50％、优选至少55％，如至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
SEQ ID NO:1
Asqsllsttapsqpqftipasadvgaqlianiddpqaadaqsvcpgykaskvqhnsrgftaslqlagrpcnvygtdvesltlsveyqdsdrlniqilpthvdstnaswyflsenlvprpkaslnasvsqsdlfvswsnepsfnfkvirkatgdalfstegtvlvyenqfiefvtalpeeynlyglgehitqfrlqrnanltiypsddgtpidqnlygqhpfyldtryykgdrqngsyipvksseadasqdyislshgvflrnshgleillrsqkliwrtlgggidltfysgpapadvtrqyltstvglpamqqyntlgfhqcrwgynnwsdladvvanfekfeipleyiwtdidymhgyrnfdndqhrfsysegdeflsklhesgryyvpivdaalyipnpenasdayatydrgaaddvflknpdgslyigavwpgytvfpdwhhpkavdfwanelviwskkvafdgvwydmsevssfcvgscgtgnltlnpahpsfllpgepgdiiydypeafnitnateaasasagassqaaatatttstsvsylrttptpgvrnvehppyvinhdqeghdlsvhavspnathvdgveeydvhglyghqglnatyqgllevwshkrrpfiigrstfagsgkwaghwggdnyskwwsmyysisqalsfslfdipmfgadtcgfngnsdeelcnrwmqlsaffpfyrnhnelstipqepyrwasvieatksamriryailpyfytlfdlahttgstvmralswefpndptlaavetqfmvgpaimvvpvleplvntvkgvfpgvghgevwydwytqaavdakpgvnttisaplghipvyvrggnilpmqepalttrearqtpwallaalgsngtasgqlylddgesiypnatlhvdftasrsslrssaqgrwkernplanvtvlgvnkepsavtlngqavfpgsvtynstsqvlfvgglqnltkggawaenwvlew
编码这种蛋白质的核酸序列示于SEQ ID NO:2中。
SEQ ID NO:2
tccaccactgccccttcgcagccgcagtttaccattcctgcttccgcagatgtcggtgcgcagctgattgccaacatcgatgatcctcaggctgccgacgcgcagtcggtttgtccgggctacaaggcttcaaaagtgcagcacaattcacgtggattcactgccagtcttcagctcgcgggcaggccatgtaacgtatacggcacagatgttgagtccttgacactgtctgtggagtaccaggattcggatcgactgaatattcagattctccccactcatgttgactccacaaacgcttcttggtactttctttcggaaaacctggtccccagacccaaggcttccctcaatgcatctgtatcccagagcgacctttttgtgtcatggtcaaatgagccgtcgttcaatttcaaggtgatccgaaaggctacaggcgacgcgcttttcagtacagaaggcactgtgctcgtatatgagaatcagttcatcgaatttgtgaccgcgctccctgaagaatataacttgtatggccttggggagcatatcacgcaattccgcctccagagaaatgctaatctgaccatatatccttcggatgatggaacacctattgaccagtgagtactgatatcccgcccgtatcttctggttctactcttgaaacttactcgtcctagaaacctctacggccaacatcccttctatctggatacaagatattacaaaggagataggcagaatgggtcttatattcccgtcaaaagcagcgaggctgatgcctcgcaagattatatctccctctctcatggcgtgtttctgaggaactctcatggacttgagatactcctccggtctcaaaaattgatctggcggaccctaggtggaggaatcgatctcaccttctactcaggccccgccccggccgatgttaccaggcaatatcttaccagcactgtgggattaccggccatgcagcaatacaacactcttggattccaccaatgtcgttggggctacaacaactggtcggatctggcggacgttgttgcgaactttgagaagtttgagatcccgttggaatatatctggtgcgtattgtactggtttatggtatctcaaaacagtctaacaggcacttaggaccgatattgactacatgcacggatatcgcaactttgacaacgatcaacatcgcttttcctacagtgagggcgatgaatttctcagcaagctacatgagagtggacgctactatgtacccattgttgatgcggcgctctacattcctaatcccgaaaatgcctctgatgcgtaagtgtctagtgacaaattatattactgcctgtatgctaattagcgatacagatacgctacgtatgacagaggagctgcggacgacgtcttcctcaagaatcccgatggtagcctctatattggagccgtttggccaggatatacagtcttccccgattggcatcatcccaaggcagttgacttctgggctaacgagcttgttatctggtcgaagaaagtggcgttcgatggtgtgtggtacgacatgtctgaagtttcatccttctgtgtcgggagctgtggcacaggtaacctgactctgaacccggcacacccatcgtttcttctccccggtgagcctggtgatatcatatatgattacccagaggctttcaatatcaccaacgctacagaggcggcgtcagcttcggcgggagcttccagtcaggctgcagcaaccgcgaccaccacgtcgacttcggtatcatatctgcggacaacgcccacgcctggtgtccgcaatgttgagcacccaccctatgtgatcaaccatgaccaagaaggccatgatctcagtgtccatgcggtgtcgccgaatgcaacgcatgttgatggtgttgaggagtatgatgtgcacggtctctacggacatcaaggattgaacgctacctaccaaggtctgcttgaggtctggtctcataagcggcggccatttattattggccgctcaaccttcgctggctctggcaaatgggcaggccactggggcggcgacaactattccaaatggtggtccatgtactactccatctcgcaagccctctccttctcacttttcggcattccgatgtttggtgcggacacctgtgggtttaacggaaactccgatgaggagctctgcaaccgatggatgcaactgtccgcattcttcccattctaccgaaaccacaatgagctctccacaatcccacaggagccttatcggtgggcttctgttattgaagcaaccaagtccgccatgagaattcggtacgccatcctaccttacttttatacgttgtttgacctggcccacaccacgggctccactgtaatgcgcgcactttcctgggaattccctaatgacccaacattggctgcggttgagactcaattcatggttgggccggccatcatggtggtcccggtattggagcctctggtcaatacggtcaagggcgtattcccaggagttggacatggcgaagtgtggtacgattggtacacccaggctgcagttgatgcgaagcccggggtcaacacgaccatttcggcaccattgggccacatcccagtttatgtacgaggtggaaacatcttgccgatgcaagagccggcattgaccactcgtgaagcccggcaaaccccgtgggctttgctagctgcactaggaagcaatggaaccgcgtcggggcagctctatctcgatgatggagagagcatctaccccaatgccaccctccatgtggacttcacggcatcgcggtcaagcctgcgctcgtcggctcaaggaagatggaaagagaggaacccgcttgctaatgtgacggtgctcggagtgaacaaggagccctctgcggtgaccctgaatggacaggccgtatttcccgggtctgtcacgtacaattctacgtcccaggttctctttgttggggggctgcaaaacttgacgaagggcggcgcatgggcggaaaactgggtattggaatgg
在一些实施方案中，转糖苷酶来源于曲霉属(Aspergillus)物种，尤其是选自黑曲霉(Aspergillus niger)(本文中称为“黑曲霉TG”)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、土曲霉(Aspergillus terreus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、烟曲霉(Aspergullus fumigatus)和棒曲霉(Aspergillus clavatus)的曲霉属物种，或与来源于曲霉属物种的转葡糖苷酶具有至少50％、优选至少55％，如至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。在一个实施方案中，转糖苷酶为黑曲霉或与其具有至少50％、优选至少55％，如至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。转糖苷酶可例如通过切割信号序列或通过糖基化进行翻译后修饰。
如本文所用，术语“泡沫减少”是指根据实施例6所述的一般条件所评估，相对于空白泡沫高度条件，12小时后泡沫至少降低1厘米。在一些实施方案中，相对于不含转糖苷酶的对照发酵，所述泡沫减少包括降低至少1cm、2cm、3cm、4cm或5cm。
如本文所用，术语“粘度降低”是指根据实施例8所述的一般条件所评估，相对于对照组，在12小时之后测得的粘度(mpas)降低。在一些实施方案中，相对于不含转糖苷酶的对照发酵，粘度降低包括降低至少1％、5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％或60％。
如本文所用，术语“纯葡萄糖”是指至少95％的葡萄糖。
如本文所用，术语“纯蔗糖”是指至少95％的蔗糖。
如本文所用，术语“原料”是指可被发酵微生物利用以制备发酵产物的任何碳源。示例性原料包括纯葡萄糖、纯蔗糖、颗粒状淀粉、液化淀粉，以及多种纤维素材料中的任一种。
如本文所用，“发酵微生物”是指适用于所需发酵工艺中以制备发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌生物体。发酵生物可为己糖和/或戊糖发酵生物，或它们的组合。己糖和戊糖发酵生物均为本领域所熟知。合适的发酵微生物能够进行发酵，即，将糖(诸如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或低聚糖)直接或间接转化为所需发酵产物。制备乙醇的细菌和真菌发酵生物的示例在Lin等人，2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642中有所描述。
如本文所用，“发酵产物”是指由发酵产生的任何物质。发酵产物可为但不限于：醇(例如阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、丙三醇、甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、甘油、山梨糖醇和木糖醇)；烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃(例如环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)；烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))；异戊二烯；酮(例如丙酮)；有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；1,3-丙二醇和聚酮。发酵产物还可以是作为高价值产物的蛋白质。
除了本文中这些明确举例示出的生物体，本领域的技术人员应理解，可使用下列生物体来制备相应的发酵产物。例如，可使用选自棒状杆菌(coryneform)、肠杆菌(Entobacteriaceae)和芽孢杆菌(Bacillus)，以及谷氨酸棒状杆菌、有效棒状杆菌(Corynebacterium efficiens)、帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)、产氨棒状杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和大肠杆菌(E.Coli)的细菌制备赖氨酸。可使用谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌制备MSG。乳酸可通过基于细菌的工艺(包括史氏芽孢杆菌(Bacillus Smithii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus Coagulans)、热噬淀粉芽孢杆菌(BacillusThermoamylovorans)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacilus stearothemophilis))以及基于酵母的工艺(包括假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Shizosaccharomyes)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、伊萨酵母属(Issachenkia)或汉逊酵母属(Hansenula))来制备。
详细描述
材料
用于L-赖氨酸发酵的微生物
发酵生物的示例包括购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)的黄色短杆菌20879和谷氨酸棒状杆菌10178。
用于L-谷氨酸发酵的微生物
发酵生物的示例包括购自CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)的谷氨酸棒状杆菌物种10238。
用于L-乳酸发酵的微生物
发酵生物的示例包括购自CGMCC(中国普通微生物菌种保藏管理中心)的鼠李糖乳杆菌。
微生物培养条件
琼脂种子制备
用于本发明的赖氨酸发酵微生物琼脂板培养基包含：葡萄糖5g/L、NaCl 5g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、琼脂20g/L，pH 7.0；
用于本发明的谷氨酸微生物琼脂板培养基包含：葡萄糖5g/L、NaCl5g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、琼脂20g/L，pH 7.0；
用于本发明的乳酸微生物琼脂板培养基包含：酪蛋白10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、Tween 80 1.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g、琼脂20g、蒸馏水1.0L，pH 6.8。
将琼脂板培养基在121℃下灭菌20min(立式加热压力蒸汽灭菌器，LDZM-80KCS，上海申安医疗器械厂)，然后将其分配至平板上，待硬化后，在室温下培养24h，用于污染试验。将细菌转移至净化工作台(Ecso超净工作台(Ecso Laminar Flow cabinet))上的琼脂板中，并在BINDER培养箱中培养24h。
发酵种子制备
用于本发明的赖氨酸发酵微生物种子培养基包含：葡萄糖25g/L、CSLP(玉米浆粉末)24g/L、(NH4)2SO4 5g/L、KH2PO4 1g、MgSO4·7H2O0.5g/L、CaCO3 15g/L，pH 7.0。根据上文配方制备1L种子培养基，并调节pH，然后向每个500mL三角烧瓶中分配60mL以更好地溶解氧，然后在121℃下灭菌保持20min，冷却至室温后，将生物质从琼脂板转移至烧瓶中，然后在130rpm、30℃下于NBS旋转振荡器中培养8至10h，保持OD高于0.8，通过显微镜检查菌株以确保细菌形状呈“V形”且不受污染。
用于本发明的谷氨酸发酵微生物种子培养基包含：葡萄糖25g/L、CSLP 24g/L、K2HPO4 1.5g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、尿素5g/L，pH 7.3。根据上文配方制备1L种子培养基，并调节pH，然后向每个500mL三角烧瓶中分配60mL以更好地溶解氧，然后在121℃下灭菌保持20min，冷却至室温后，将生物质从琼脂板转移至烧瓶中，然后在130rpm、32℃下于NBS旋转振荡器中培养5至6h，保持OD高于0.9，通过显微镜检查菌株以确保细菌形状呈“V形”且不受污染。
用于本发明的乳酸发酵微生物种子培养基包含：酪蛋白10.0g、牛肉膏10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、Tween 80 1.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O 0.05g，pH6.8。根据上文配方制备1L种子培养基，并调节pH，然后向每个300mL烧瓶中分配100mL，然后在121℃下灭菌保持20min，冷却至室温后，将生物质从琼脂板转移至烧瓶中，然后在150rpm、37℃下于NBS旋转振荡器中培养14至18h，保持OD高于0.5，通过显微镜检查菌株以确保无污染。
发酵培养基制备
7L发酵罐中的赖氨酸发酵微生物发酵营养培养基包含：初始葡萄糖80g/L、CSLP 15g/L、(NH4)2SO4 15g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeSO4·7H2O 9.9mg/L、MnSO4·H2O 6.15mg/L、维生素B1(VB1)100μg/L、生物素(VH)100μg/L、消泡剂THIX-298 0.05g/L。对于赖氨酸发酵，初始工作体积为3.5L(营养液2.75L、初始葡萄糖0.4L、种子液0.35L)，营养液制备：称取粉末CSL(玉米浆)52.5g、(NH4)2SO4 52.5g、KH2PO4 3.5g、MgSO4·7H2O 1.75g、FeSO4·7H2O 7mg、MnSO4·H2O 7mg、VB1 350μg、VH 350μg、消泡剂0.175g，溶于2.75L水中，然后加入发酵罐。初始葡萄糖制备：称取240g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为400mL，然后加入一个烧瓶中。高浓度葡萄糖制备(用于在发酵工艺中给料)：称取400g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为500mL，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。消泡剂制备：称取20g消泡剂，溶于80g水中，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。准备一个空烧瓶(供NH3·H2O在发酵工艺中调节pH之用)，并使用管子将烧瓶连接至发酵罐。校准pH电极(METTLER TOLEDO,3030)并将溶解氧电极(METTLER TOLEDO)极化8h。固定发酵罐，确保所有烧瓶与发酵罐放置在一起，所有培养基应在121℃下灭菌保持20min。重复上述所有步骤，制备另一7L发酵罐的发酵培养基。灭菌后，应向发酵罐中泵入无菌空气以防止污染；将初始葡萄糖泵送至发酵罐，并将NH3·H2O快速加入空烧瓶中，然后调节pH至6.5；打开水龙头，并将温度自动控制在30℃。将搅拌速度设置为200rpm，等待约半小时使所有参数适中，将DO电极设置为100％；向发酵罐中加入350mL种子液，其中一个发酵罐含酶，另一发酵罐不含酶，开始发酵，将种子加入发酵罐之后，DO显著降低，故应增加搅拌速度和曝气量以使DO维持在15％至30％；在发酵过程中，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖和赖氨酸，如果葡萄糖浓度低于30g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖，以将葡萄糖浓度维持在约30g/L至40g/L。
7L发酵罐中的谷氨酸发酵微生物发酵营养培养基包含：初始葡萄糖90至100g/L、CSLP 4g/L、MgSO4·7H2O 0.8g/L、K2HPO4 2g/L、FeSO4·7H2O22mg/L、MnSO4·H2O 22mg/L、维生素B1(VB1)0.2mg/L、消泡剂THIX-2980.1g/L。对于谷氨酸发酵，初始工作体积可为2.5至2.7L，添加的葡萄糖可为200mL至500mL。例如，对于谷氨酸发酵，初始工作体积为2.5L(营养液1.8L、初始葡萄糖0.4L、种子液0.30L)，营养液制备：称取粉末CSL10.0g、MgSO4·7H2O 2.0g、KH2PO4 5g、FeSO4·7H2O 55mg、MnSO4·H2O55mg、VB1 500μg、消泡剂0.25g，溶于1.8L水中，然后加入发酵罐。初始葡萄糖制备：称取250g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为400mL，然后加入一个烧瓶中。770g/L高浓度葡萄糖制备(用于在发酵工艺中给料)：称取385g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为500mL，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。消泡剂制备：称取40g消泡剂，溶于160g水中，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。准备一个空烧瓶(供NH3·H2O在发酵工艺中调节pH之用)，并使用管子将烧瓶连接至发酵罐。校准pH电极(METTLER TOLEDO,3030)并将溶解氧电极(METTLERTOLEDO)极化8h。固定发酵罐，确保所有烧瓶与发酵罐放置在一起，所有培养基应在121℃下灭菌保持20min。重复上述所有步骤，制备另一7L发酵罐的发酵培养基。灭菌后，应向发酵罐中泵入无菌空气以防止污染；将初始葡萄糖泵送至发酵罐，并将NH3·H2O快速加入空烧瓶中，然后调节pH至7.0-7.1；打开水龙头，并将温度自动控制在30℃。将搅拌速度设置为200rpm，等待约半小时使所有参数适中，将DO电极设置为100％；向发酵罐中加入300mL种子液，其中一个发酵罐含酶，另一发酵罐不含酶，开始发酵，将种子加入发酵罐之后，DO显著降低，故应增加搅拌速度和曝气量以使DO维持在30％至50％。在发酵过程中，每三或四小时使发酵温度升高1℃，4至6h后，温度达到38℃，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖和谷氨酸，如果葡萄糖浓度低于20g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖，以将葡萄糖浓度维持在约20g/L至30g/L。
1L发酵罐中的乳酸发酵微生物发酵营养培养基包含：初始糖80g/L、CSLP 40g/L、酪蛋白10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物10g/L、Tween 801.5g/L、MnS04·H2O 0.3g/L、碳酸钙20g/L，pH 6.5。对于乳酸发酵，初始工作体积为0.6L(营养液0.5L，初始葡萄糖0.05L，种子液0.05至0.10L)，营养液制备：称取粉末玉米浆20g、酪蛋白5.0g、牛肉膏5.0g、酵母提取物5.0g、Tween 80 0.75g、MnSO4·H2O 0.15g、碳酸钙10g，pH 6.5；初始葡萄糖制备：称取40g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为50mL，然后加入一个烧瓶中。高浓度葡萄糖制备(用于在发酵工艺中给料)：称取100g葡萄糖，溶于水中，使得总体积为150mL，然后加入一个使用管子连接至发酵罐的烧瓶中。准备一个空烧瓶或装有50mL蒸馏水的烧瓶(供NH3·H2O在发酵工艺中调节pH之用)，并使用管子将烧瓶连接至发酵罐。校准pH电极(METTLER TOLEDO,3030)并将溶解氧电极(METTLER TOLEDO)极化8h。固定发酵罐，确保所有烧瓶与发酵罐放置在一起，所有培养基应在121℃下灭菌保持20min。重复上述所有步骤，制备另一1L发酵罐的发酵培养基。灭菌后，应向发酵罐中泵入无菌空气以防止污染；将初始葡萄糖泵送至发酵罐，并将NH3·H2O快速加入空烧瓶中，然后调节pH至6.5；打开水龙头，并将温度自动控制在40℃至45℃。将搅拌速度设置为200rpm，等待约半小时使所有参数适中，然后向发酵罐中加入50mL种子液，其中一个发酵罐含酶，另一发酵罐不含酶，开始发酵。在发酵过程中，通过添加额外的NH3·H2O或稀释的NH3·H2O自动调节pH。每三或四小时取一次样品，通过HPLC分析以测定糖和乳酸含量。
如本文所用，CSLP是指广泛用于微生物发酵的喷雾干燥玉米浆粉末，购自Roquette Co.,Ltd。葡萄糖浆为购自西王集团有限公司的液体葡萄糖。HPAED分析结果表明葡萄糖超过85％，以mg/L表示。消泡剂THIX-298购自山东省烟台恒鑫化工科技有限公司。7L发酵罐购自KOBIOTECH CO.,LTD。1L发酵罐购自APPLITECH CO.,LTD。除非另外指明，否则其他化学品购自国药有限公司；牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白、琼脂为BR级，其余均为AR级。
酶
转葡糖苷酶L-2000(DuPont Industrial Biosciences的产品，2013年)：经纯化的D-葡糖基转移酶(转葡糖苷酶，EC 2.4.1.24)，不含葡糖淀粉酶活性。通过受控的发酵过程，使用经基因修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株制备转葡糖苷酶L-2000。
转葡糖苷酶L“Amano”(由Amano Pharmaceutical Co.,Ltd生产)：黑曲霉葡糖基转移酶。此酶为α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)，能够从分子的非还原端水解其底物以释放葡萄糖分子。同样，在高底物浓度下，此酶能够进行糖基转移反应，而不是底物的水解。由于这种糖基转移能力，此酶还被称为转葡糖苷酶。
BG(Genencor International,Inc)：用于快速降低粘度的降粘酶、高活性β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，由经修饰的木霉属宿主制得，其中相对于野生型，所述经修饰的木霉属宿主缺失CBH1和CBH2(纤维二糖水解酶I和II)，并且EGII(内切葡聚糖酶，一种β葡聚糖酶)被过度表达至少50％，如例如WO2A118257中所提出。
TrGA(Genencor International,Inc)：由里氏木霉的非病原性、非产毒型菌株制备的葡糖淀粉酶，所述里氏木霉经基因修饰以过度表达天然里氏木霉葡糖淀粉酶(参见例如美国专利7,413,887)。
DUET(Genencor International,Inc)：由经基因修饰的里氏木霉菌株制备，其不仅包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶，还包含木聚糖酶和其他半纤维素酶，如在2013年可从Danisco USInc、DuPont Industrial Biosciences商购获得。
方法
通过HPAED测定含糖量
在Dionex ICS-5000离子色谱仪(Sunnyvale,CA,USA)上进行糖分析。此离子色谱仪由GP50梯度泵、ED 40电化学检测器(包括由金电极和pH-Ag/AgCl参考电极组成的脉冲安培检测池)构成。在配备有保护柱(3mm×50mm)的CarboPakTM PA200色谱柱(3mm×250mm)上进行分离。CarboPakTM PA200色谱柱中的流速为0.5mL/min，柱温为30℃。进样量为25μL。CarboPakTM PA200色谱柱所用的梯度为：0-5min，100mM NaOH，0-40mM NaAc；5-60min，100mM NaOH，40-500mM NaAc；60-70min，100mM NaOH。脉冲安培检测用作检测器，并使用以下脉冲电位和持续时间：E1＝0.1V，t1＝400ms；E2＝-2V，t2＝20ms；E3＝0.6V，t3＝10ms；E4＝-0.1V，t4＝70ms。使用Chromeleon 6.8工作站进行数据采集和积分。
通过分光光度计测定发酵生物质
在SHIMADZU UV-1700分光光度计上进行生物质分析。用1mol/L盐酸将发酵液稀释25倍，然后在562nm处测定赖氨酸的OD(光密度)值或在620nm处测定谷氨酸的OD值。
通过SBA40C生物传感器测定残余的葡萄糖和赖氨酸/谷氨酸含量
在SBA-40C生物传感器(山东省科学院生物研究所)上测定残余的葡萄糖和赖氨酸的收率。用纯化水将发酵液稀释100倍，在分析样品之前需进行校准。注入数次25μL标准样品(100mg/dL葡萄糖和100mg/dL赖氨酸储备溶液)，以完成校准。注入25μL样品，并记录屏幕上显示的数据。每次校准后，可分析10个样品。如果样品数超过10个，则执行重新校准步骤。
通过HPLC(高压液相色谱)测定乳酸含量：
HPLC方法采用Agilent 1100色谱柱，柱规格：BIO-RAD AminexHPX-87H或Rezex ROA-有机酸。分析方法：ESTD。具体分析过程：流动相：0.005mol/L H2SO4。取样品，稀释10倍，并用0.45μm滤膜过滤。其他HPLC参数：进样体积：20μL；泵流量：0.6mL/min；柱温箱温度：60℃；RID，光学单元温度：35℃。
通过HAAKE VT550测定发酵液粘度
在DC30-K10冷冻循环器水浴中，用配备有FL-10轴的HAAKEVT550粘度计进行粘度分析(所述装置均来自Thermo Scientific)。称取100克发酵液，置于HAAKE管中，然后使用FL-10轴，以固定剪切速率10[1/s]、固定温度30℃运行10min。当此过程停止时，将发酵液倒出，并清洗HAAKE管，以便运行另一批分析。粘度数据由HAAKE工作站记录。
不溶性固体自然沉降观察
将发酵液倒入烧杯中，用包裹物盖住，并置于4至8℃冷藏室中保持18h，然后拍照。
实施例1：
使用糖浆作为底物并采用黄色短杆菌时，含转葡糖苷酶活性的市售产 品对赖氨酸发酵影响的比较
在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、30℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约10h，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，待温度冷却至30℃后，向发酵罐中加入80g/L初始葡萄糖，并用氢氧化铵将培养基的pH调节至6.5。然后向此发酵培养基中加入0.75g TrTG L-2000(Genencor International,Inc.的产品)和TransglucosidaseTML“Amano”(由Amano Pharmaceutical Co.,Ltd.,Japan生产)以及300mL种子液(10％v/v)。将温度保持在30℃，并通过加入氢氧化铵将pH控制在6.8至7.0，通过调节曝气量和搅拌速度，将DO保持在10％至25％。在发酵过程中，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖，通过添加高浓度的葡萄糖使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)，并分别在8h和32h时加入0.75g TrTG和AMANO TG。
表1：使用葡萄糖浆作为底物时，转葡糖苷酶对赖氨酸发酵收率、发 酵结束时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的影响
表1和图1的结果表明，与空白相比，额外的TrTG L2000导致赖氨酸·HCl收率提高、残余葡萄糖减少、发酵液粘度降低并且沉淀加快。此外，如TrTG L2000所示，与空白相比，AMANO TG导致赖氨酸·HCl收率提高、残余葡萄糖减少并且沉淀加快，但AMANO TG导致发酵液粘度高于空白。
实施例2
使用纯葡萄糖作为底物并采用黄色短杆菌时，TrTG L2000对赖氨酸发 酵的影响
在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、30℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约10h，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，待温度冷却至30℃后，向发酵罐中加入80g/L初始葡萄糖，并用氢氧化铵将培养基的pH调节至6.5。然后向此发酵培养基中加入0.75g TrTG L-2000(Genencor International,Inc.的产品)以及300mL种子液(10％v/v)。将温度保持在30℃，并通过加入氢氧化铵将pH控制在6.8至7.0，通过调节曝气量和搅拌速度，将DO保持在10％至25％。在发酵过程中，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖，通过添加高浓度的葡萄糖使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)，并分别在8h和32h时加入0.75g TrTG L2000。
表2：使用纯葡萄糖作为底物时，TrTG L2000对赖氨酸发酵收率、发 酵结束时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的影响
表2和图2表明，与空白相比，额外的TrTG L2000导致赖氨酸·HCl收率提高、残余葡萄糖减少、发酵液粘度降低并且沉淀加快。
实施例3使用糖浆作为底物并采用黄色短杆菌时，TrGA对赖氨酸产量 的影响
本实验评估TG或来自木霉属生产菌株的残余物是否可能引起改善。在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、30℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约10h，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，待温度冷却至30℃后，向发酵罐中加入80g/L初始葡萄糖，并用氢氧化铵将培养基的pH调节至6.5。通过加入氢氧化铵将发酵pH控制在6.8至7.0，通过调节曝气量和搅拌速度，将DO保持在10％至25％。在发酵过程中，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖，并通过添加葡萄糖浆(500g/400mL)使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)。在发酵开始时，加入0.715g TrGA，并在发酵8h时再添加0.715g，因此总TrGA为2.4Kg/MT葡萄糖干固形物。发酵结束后，测定赖氨酸产量、残糖、发酵液粘度和沉淀(表3，图3)。
表3：使用葡萄糖浆作为底物时，TrGA对赖氨酸发酵收率、发酵结束 时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的影响
结果表明，在赖氨酸发酵过程中，额外的TrGA提高了发酵液粘度并使残余葡萄糖增加，但降低了赖氨酸×HCl的产量。与空白相比，赖氨酸产量较低，因此表明赖氨酸产量降低。不受理论的约束，此观察结果支持了以下假设：TrTG起着改善赖氨酸发酵的作用，而来自木霉属表达宿主的残余物可能没有这种作用。
实施例4使用纯葡萄糖作为底物并采用黄色短杆菌时， OPTIMASH TM BG对赖氨酸产量的影响
在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、30℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约10h，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至30℃，初始葡萄糖为80g/L，通过加入氢氧化铵将pH控制在6.8至7.0，并通过调节曝气量和搅拌速度将DO保持在10％至25％。在发酵过程中，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖，并通过添加葡萄糖溶液(500g/400mL)使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)。在发酵开始、发酵16h和发酵32h时分别添加1.12g、0.8g、0.8g OPTIMASH BG，添加的OPTIMASH BG总剂量为4Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后，测定赖氨酸产量、残糖和发酵液粘度。
表4：使用纯葡萄糖作为底物时，OPTIMASH BG对赖氨酸发酵收 率、发酵结束时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的影响
结果表明，在赖氨酸发酵过程中，额外的OPTIMASH BG可能略微降低了发酵液粘度并使残余葡萄糖减少，但显著提高了赖氨酸×HCl的产量。
实施例5使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌10178时，转 葡糖苷酶对赖氨酸产量的影响
在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、30℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约10h，并保持OD高于0.8。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至30℃，初始葡萄糖为100g/L，通过加入氢氧化铵将pH控制在6.8至7.0，并通过调节曝气量和搅拌速度将DO保持在10％至25％。在发酵过程中，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖，并通过添加葡萄糖溶液(800g/1000mL)使其维持于合适的浓度(30g/L至40g/L)。在发酵开始、发酵15h、23h、32h和36h时分别添加1.4g、0.8g、0.8g、0.8g和0.8g转葡糖苷酶L-2000(GenencorInternational,Inc.的产品)。转葡糖苷酶L-2000的总剂量为4Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后，测定赖氨酸产量、残糖、发酵液粘度和发酵液颜色。
表5：使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌10178菌株时， TrTG对赖氨酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的影响
结果表明，尽管颜色随额外转葡糖苷酶L-2000的添加而改变，但是该酶并未影响赖氨酸×HCl的产量。
实施例6使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238时， 转葡糖苷酶对谷氨酸产量的影响
在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、32℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约5至6h，并保持OD高于0.9。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至30℃。初始葡萄糖为100g/L，通过加入氢氧化铵将发酵pH控制在7.0至7.1，并通过调节曝气量和搅拌速度，将DO保持在20％至40％。在发酵过程中，每三或四小时使发酵温度升高1℃，4至6h之后，温度达到38℃，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖和谷氨酸，如果葡萄糖浓度低于20g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖以将葡萄糖浓度维持在约20g/L至30g/L。在发酵开始(0h)，发酵8h、16h、21h时分别添加0.9525g、0.9525g、0.3175g和0.3175g转葡糖苷酶L-2000(Genencor International,Inc.的产品)。转葡糖苷酶L-2000的总剂量为4Kg/MT葡萄糖干固形物，在发酵过程中拍照记录发泡水平的变化，发酵之后，记录谷氨酸产量、残糖、消泡剂消耗量、发酵液粘度和发酵液颜色。
表6：使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株 时，TrTG对谷氨酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的 影响
表7：使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株 时，TrTG对消泡剂消耗量的影响
这些结果表明，在谷氨酸发酵过程中添加额外的TrTG会降低发酵液粘度，减少残余的葡萄糖，并显著提高谷氨酸的产量，同时减少泡沫形成并使消泡剂消耗量至少减少50％。
实施例7使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238时， ACCELLERASE TM DUET对谷氨酸产量的影响
在500mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于130rpm、32℃及工作体积为60mL/500mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，使用三角烧瓶培养约5至6h，并保持OD高于0.9。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至30℃，初始葡萄糖为92.5g/L，通过加入氢氧化铵将pH控制在7.0至7.1，并通过调节曝气量和搅拌速度将DO保持在30％至50％。在发酵过程中，每三或四小时使发酵温度升高1℃，4至6h之后，温度达到38℃，每三或四小时取一次样品以测定葡萄糖和谷氨酸，如果葡萄糖浓度低于20g/L，则开始添加高浓度的葡萄糖以将葡萄糖浓度维持在约20g/L至30g/L。在发酵开始(0h)、发酵8h、16h时分别添加0.808g、0.808g和0.202g ACCELLERASE DUET(DuPontIndustrial Biosciences的产品，2013年)。ACCELLERASE DUET的总剂量为4.5Kg/MT葡萄糖干固形物，在发酵过程中拍照记录发泡水平的变化，发酵之后，记录谷氨酸产量、残糖、消泡剂消耗量、发酵液粘度和发酵液颜色。
表8：使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株 时，ACCELLERASE TM DUET对谷氨酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖 以及发酵液粘度的影响
表9：使用纯葡萄糖作为底物并采用谷氨酸棒状杆菌SP 10238菌株 时，ACCELLERASE对消泡剂消耗量的影响
结果表明，在谷氨酸发酵过程中添加额外的ACCELLERASE DUET会显著降低发酵液粘度，略微减少残余的葡萄糖，并略微提高谷氨酸的产量，同时减少泡沫形成并使消泡剂消耗量减少30％。
实施例8：使用纯蔗糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌时，转葡糖苷酶 对乳酸产量的影响
在300mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于150rpm、37℃及工作体积为100mL/300mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，培养约14至18h，并保持OD高于0.5。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至40℃，初始蔗糖为80g/L(40g/500mL)，通过加入氢氧化铵将pH控制在6.5，每三或四小时取一次样品以测定蔗糖和乳酸，并在发酵20h至32h期间添加150mL高浓度蔗糖(100g/150mL)。在发酵开始(0h)、发酵20h、21h时分别添加0.145g、0.145g和0.140g TrTG。TrTG的总剂量为3.07Kg/MT蔗糖干固形物，发酵后分析乳酸产量、发酵液粘度。
表10：使用纯蔗糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌菌株时，TrTG对乳 酸发酵收率、发酵结束时的残余蔗糖以及发酵液粘度的影响
结果表明，在乳酸发酵过程中添加额外的TrTG会显著降低发酵液粘度，并提高乳酸的产量。
实施例9：使用纯葡萄糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌时，转葡糖苷 酶对乳酸产量的影响
在300mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于150rpm、37℃及工作体积为100mL/300mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，培养约14至18h，并保持OD高于0.5。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至40℃，初始葡萄糖为80g/L(40g/500mL)，通过加入氢氧化铵将pH控制在6.5，每三或四小时取一次样品以测定蔗糖和乳酸，并在发酵4h至22h期间添加150mL高浓度葡萄糖(100g/150mL)。在发酵开始(0h)、发酵10h、22h时分别添加0.150g、0.150g和0.300g TrTG。TrTG的总剂量为4.28Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后分析乳酸产量、残糖、发酵液粘度。
表11：使用纯葡萄糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌菌株时，TrTG对 乳酸发酵收率、发酵结束时的残余葡萄糖以及发酵液粘度的影响
结果表明，在乳酸发酵过程中添加额外的TrTG会显著降低发酵液粘度，减少残余的葡萄糖并提高乳酸的产量。
实施例10使用纯葡萄糖作为底物并采用鼠李糖乳杆菌时，OPTIMASH BG对乳酸产量的影响
在300mL烧瓶中，将从琼脂板收集的细菌生物质转移到种子培养基中。然后置于150rpm、37℃及工作体积为100mL/300mL烧瓶条件下的NBS旋转振荡器中培养，培养约14至18h，并保持OD高于0.5。将发酵培养基在121℃下灭菌12min，然后使温度冷却至45℃，初始葡萄糖为80g/L(40g/500mL)，通过加入氢氧化铵将pH控制在6.5，每三或四小时取一次样品以测定蔗糖和乳酸，并在发酵6h至22h期间添加150mL高浓度葡萄糖(100g/150mL)。在发酵开始(0h)、发酵22h时分别添加0.150g、0.220gOPTIMASH BG。OPTIMASH BG的总剂量为3.70Kg/MT葡萄糖干固形物，发酵后分析乳酸产量、残糖、发酵液粘度。
结果表明，在乳酸发酵过程中添加额外的OPTIMASH BG会显著降低发酵液粘度，减少残余的葡萄糖并提高乳酸的产量。

Claims (35)

1.一种制备发酵产物的方法，所述方法包括：
在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并且其中所述发酵产物的收率比不含所述转糖苷酶的对照发酵高。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括回收所述发酵产物。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发酵生物为黄色短 杆菌(Brevibacterium flavum)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) 10238或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶包含SEQID NO:1或与SEQ ID NO:180％、85％、90％、95％、98％、99％相同的任何序列。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述转糖苷酶在木霉属中产生。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原料包含液化淀粉、颗粒状淀粉、纯葡萄糖、纯蔗糖或糖浆。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括减少所述发酵液中的泡沫和/或降低所述发酵液的粘度。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TrTG以1Kg/MT至6Kg/MT、2Kg/MT至5Kg/MT或2Kg/MT至4Kg/MT存在。
10.一种筛选发酵益处以识别有益的转糖苷酶的方法，所述方法包括：
在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并且其中所述发酵产物的收率比不含所述转糖苷酶的对照发酵高；
以及由此识别所述有益的转糖苷酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述发酵产物为赖氨酸、乳酸或谷氨酸。
12.一种筛选发酵益处以识别有益的转糖苷酶的方法，所述方法包括：
在发酵液中用发酵微生物发酵原料以制备发酵产物，其中所述发酵包含转糖苷酶，并且其中与不含所述转糖苷酶的对照反应相比，所述发酵的所述发酵液中包括减少所述发酵液中的泡沫和/或降低所述发酵液的粘度；
以及由此识别所述有益的转糖苷酶。
13.一种制备赖氨酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含TrTG，其中所述赖氨酸的收率比不含所述TrTG的对照发酵高，并且其中所述发酵液的粘度与不含所述TrTG的对照发酵相比降低。
14.一种制备赖氨酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含黑曲霉(A.Niger)TG，其中所述赖氨酸的收率比不含所述黑曲霉(A.Niger)TG的对照发酵高。
15.一种制备赖氨酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含转葡糖苷酶，其中所述赖氨酸的收率比不含所述转葡糖苷酶的对照发酵高。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述原料包含纯葡萄糖或糖浆。
17.一种制备赖氨酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵原料以制备赖氨酸，其中所述发酵包含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，其中所述赖氨酸的收率比不含所述β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵高。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，还包括减少泡沫和/或降低粘度。
19.一种制备谷氨酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SP10238发酵原料以制备谷氨酸，其中所述发酵包含TrTG，其中所述发酵液的粘度与不含所述TrTG的对照发酵相比降低，并且其中所述发酵液中的泡沫与不含所述TrTG的对照发酵相比减少。
20.一种制备谷氨酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SP10238发酵原料以制备谷氨酸，其中所述发酵包含外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和木聚糖酶，其中所述发酵液的粘度与不含所述外切葡聚糖酶、所述内切葡聚糖酶、所述β-葡糖苷酶和所述木聚糖酶的对照发酵相比降低，并且其中所述发酵液的粘度与不含所述外切葡聚糖酶、所述内切葡聚糖酶、所述β-葡糖苷酶和所述木聚糖酶的对照发酵相比降低。
21.一种制备乳酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵原料以制备乳酸，其中所述发酵包含TrTG，其中所述乳酸的收率比不含所述TrTG的对照发酵高，并且其中所述发酵液的粘度与不含所述TrTG的对照发酵相比降低。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述原料包含纯葡萄糖或糖浆。
23.一种制备乳酸的方法，所述方法包括：
在发酵液中用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵原料以制备乳酸，其中所述发酵包含β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体，其中所述乳酸的收率比不含所述β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵高，并且其中所述发酵液的粘度与不含所述β葡聚糖酶、木聚糖酶和纤维素酶复合体的对照发酵相比降低。
24.转糖苷酶在发酵中用于提高发酵微生物所产生的发酵产物的收率的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述转糖苷酶为TrTG或与TrTG98％相同的酶。
26.根据权利要求24或25所述的用途，其中所述发酵制备选自赖氨酸、柠檬酸或谷氨酸的发酵产物。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的用途，其中所述发酵微生物选自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SP 10238、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178。
28.转糖苷酶在发酵中用于降低由于发酵微生物的发酵液的粘度的用途。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述转糖苷酶为TrTG或与TrTG98％相同的酶。
30.根据权利要求28或29所述的用途，其中所述发酵制备选自赖氨酸、柠檬酸或谷氨酸的发酵产物。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的用途，其中所述发酵微生物选自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SP 10238、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178。
32.转糖苷酶在发酵中用于减少由于发酵微生物的发酵液的发泡的用途。
33.根据权利要求32所述的用途，其中所述转糖苷酶为TrTG或与TrTG98％相同的酶。
34.根据权利要求32或33所述的用途，其中所述发酵制备选自赖氨酸、柠檬酸或谷氨酸的发酵产物。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的用途，其中所述发酵微生物选自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)SP 10238、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)10178。
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