CN107488603A

CN107488603A - 一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌及构建方法和应用

Info

Publication number: CN107488603A
Application number: CN201710977382.7A
Authority: CN
Inventors: 邓童心; 邱蔚然; 周长林; 季晨明; 莫违; 邱志云
Original assignee: Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本发明涉及一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌及构建方法和应用，该菌株是将酿酒酵母来源的编码磷酸胆碱胞苷转移酶的基因cct克隆到pYES2.0‑Kanmx载体上，构建重组质粒pYES2.0‑Kanmx‑cct，然后将其转接酿酒酵母S.cerevisiae HG中，获得本发明所述酵母基因工程菌。该菌株的固形物对可发酵性糖的得率为50%‑56%，可应用于以5’‑胞苷酸和磷酸胆碱为原料，生物转化制造胞磷胆碱产品，反应7h摩尔转化率可高达73%。在生产培养该菌株的发酵体系中，产率高。将该菌株应用于生产胞磷胆碱，具有成本低、制造能耗低、反应周期短等优点。

Description

一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌及构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌及构建方法和应用。

背景技术

胞二磷胆碱（CDP-C）属于核酸类生化药物，中国药典2005年版定名为胞磷胆碱，它的化学名称为胆碱胞嘧啶核苷-5’-二磷酸酯单钠盐，白色结晶性粉末。胞磷胆碱是生物合成卵磷脂的中间体，通过改善磷脂的代谢，从而改善脑组织的代谢和调节脑血管的张力，是脑外科、精神内科中治疗脑意识障碍的主要用药，其在脑外伤、脑手术所致的意识障碍，以及对一些慢性病如偏瘫、运动性瘫痪、帕金森氏病、中枢性眩晕等方面，都有独特的疗效，具有极好的应用前景。

胞磷胆碱的原料药目前国内产量较少，相当一部分依赖进口。国内生产中都存在酵母转化率低、产品纯度低和生产规模小等问题。生物合成胞磷胆碱因其污染小、步骤少和价格低廉等优势，在文献专利报道中最为广泛。

中国专利申请CN201510184705.8专利系一株表达胆碱激酶及磷酸胆碱胞苷转移酶的基因工程菌的及其构建方法与应用。其缺陷是大肠杆菌的培养过程中会释放刺激性气味，并且菌体不能再利用。这对于操作人员劳动保护，工作环境及三废治理都会带来难题。又如：日本专利丸山明彦等CN1074938A及桥本信一等WO0309 5660A利用双菌（大肠杆菌和枯草杆菌）发酵，其优点是利用廉价的乳清酸或尿嘧啶为原料，发酵生物转化生产胞磷胆碱，其缺点是转化率低（50%），工艺复杂，并且菌体三废处理有难度，而且国内胞苷酸价格已大幅下降，其原料的价格优势也已不复存在。又如：中国专利CN100564537C系利用部分啤酒厂的废弃酵母生物转化生产胞磷胆碱，其优点是酵母为综合利用，成本较低。但缺点是不适合大规模生产，每批酵母质量很难控制，而且酵母存放和处理环境对生物转化率有很大的影响。又如：中国专利CN103436455A的缺陷是其酵母固形物对可发酵性糖的得率约为25%-30%，相对菌体成本较高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种磷酸胆碱胞苷转移酶酶活高，且菌种产量高的过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌及构建方法和应用。

实现本发明目的的具体技术方案是：

一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌，特点是：在出发菌株导入了克隆有编码磷酰胆碱胞苷转移酶cct基因的重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct；

所述cct基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1~1277bp，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码424个氨基酸和一个终止密码子；

所述出发菌株为S. cerevisiae HG或S. cerevisiae D202，最优选为S. cerevisiae HG；

所述的表达质粒为pYES2.0-Kanmx；

其中，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pYES2.0-Kanmx的多克隆位点处，其表达质粒的启动子为GAL1。

一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌的构建方法，该方法包括如下步骤：

（1）搜索Genbank数据库，得到酿酒酵母来源的编码磷酸胆碱胞苷转移酶的cct基因核苷酸序列SEQ ID NO：1；

（2）根据cct基因序列信息，设计合成SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列引物cct-S和cct-A；

（3）以步骤（2）得到的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列引物cct-S和cct-A为引物，经过PCA（快速聚合酶链式组装法）得SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列cct基因；

（4）将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pYES2.0-Kanmx中，得到重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct；

（5）将步骤（4）得到的重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct转化出发菌株S. cerevisiae HG，即得到所述过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌。

一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌在制备胞磷胆碱中的应用。基因工程菌通过风干或冻存，大大增加基因工程菌细胞膜通透性，可直接利用基因工程菌中过表达的磷酸胆碱胞苷转移酶（CCT酶）和胆碱激酶等酶系作为生物催化剂，采用胞苷单磷酸（CMP）和磷酸胆碱（CP）为底物，葡萄糖供能，进行生物转化，可得到胞磷胆碱。后经过一系列分离提纯，最后精制成原料药。因基因工程菌内部有其他各种胆碱激酶等各种酶系，能够直接应用于胞磷胆碱的生物转化。本发明所述基因工程菌培养发酵过程干净无污染，生物转化过程方便快捷，可以大大降低生产成本，提高生产效率。

本发明的有益效果：

（1）本发明通过构建重组表达质粒pYES2.0-Kanmx-cct，该质粒中含有编码磷酸胆碱胞苷转移酶的cct基因，将该质粒转化酿酒酵母宿主菌，得到S.c HG/pYES2.0-Kanmx-cct基因工程菌。该基因工程菌菌能够有效提高生物转化反应中的转化关键酶CCT的酶活，胞磷胆碱的生物转化率从出发菌株的38%提高至73%。

（2）本发明构建的基因工程菌，产率高，其固形物对可发酵性糖的得率为50%-56%，发酵菌浓从出发菌株的45g/L增加到89g/L，生物量可达24g/L。

（3）本发明具有绿色环保、成本低、反应能耗低、反应周期短等优点，能够达到胞磷胆碱大批量生产的要求。

附图说明

图1为本发明重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct的质粒图谱；

图2为本发明重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct核酸电泳及酶切验证结果图。

具体实施方式

除另外指明，以下各实施例中所使用的生物材料、载体、菌种、试剂等均可通过常规商购途径获得，其中涉及的生物基因工程操作等，均为本领域内的常规操作。

以下实施例中所用的引物如表1所示。

表1 引物名称及其核苷酸序列

	引物名称	序列	酶切位点
				SEQ ID NO：2	cct-S	ccatggttcgaattataaggg	Kpn I
SEQ ID NO：3	cct-A	ggatccactagtaacggccgccagt	BamH I

实施例1：重组菌的构建

根据Genbank数据库中已有的酿酒酵母编码磷酸胆碱胞苷转移酶基因（SEQ ID NO：1），设计合成引物cct-S和cct-A（SEQ ID NO：2~3），均由金斯瑞科技（南京）有限公司进行基因全合成。

得到长度为1277bp片段，进行核酸电泳纯化该片段。

将该片段回收后与pYES2.0-Kanmx载体相连（保存于中国药科大学微生物教研室），连接酶切产物构建得pYES2.0-Kanmx-cct重组质粒，测得总序列长度为8224bp见附图1。

采用Kpn I和BamH I双酶切pYES2.0-Kanmx-cct重组质粒，进行酶切琼脂糖凝胶电泳验证，核酸电泳结果见附图2。

将获得的重组质粒通过热激法转化酿酒酵母S. cerevisiae HG，具体操作如下：

（1）重悬活化的S. cerevisiae HG菌体细胞于终体积500µL的100 mmol/L 醋酸锂溶液中，即为S. cerevisiae HG的感受态细胞；

（2）取50µLS. cerevisiae HG感受态细胞于1.5 mL EP管中，2500 rpm离心1min，弃上清；

（3）按照下列顺序依次小心加入“转化混合液”中的各个成分：PEG (50% W/V)240 µL、1.0 mol/L 醋酸锂36µL、单链鲑鱼精DNA (2.0 mg/mL)25µL、质粒DNA和水50µL (约5µg)；

（4）剧烈震荡装有上述转化液的EP管，使转化液与感受态细胞充分混匀。30℃恒温水浴保温30 min后，立刻于42℃水浴锅中热激25 min；

（5）5000 rpm 离心15 s，去除转化混合液，用1 mL无菌ddH₂O重悬EP管中的菌体沉淀，吸取200µL上述重悬液涂于含有100 µg/mL G418的YPD抗性平板，于30℃恒温培养箱中倒置培养，所得单菌落即为基因工程菌S.c HG/pYES2.0-Kanmx-cct，编号为QZ-016。

实施例2：基因工程菌的富集表达

（1）将基因工程菌QZ-016从G418的YPD抗性平板接种到5mL YPD液体培养基中，培养至OD₆₀₀=0.6。

（2）向上述培养基中加入终浓度为2%的D-半乳糖，诱导16h，得到一级种子培养液。

（3）将步骤（2）得到的种子培养液接种到100mL CMP-YPD液体培养基中，摇床培养16h后加入终浓度为2%的D-半乳糖，诱导8h，得到二级种子培养液。

（4）将步骤（3）得到的种子培养液接种到500mL YPD液体培养基中，摇床培养16h后加入终浓度为2%的D-半乳糖，诱导8h，得到三级种子培养液。

（5）将步骤（4）得到的种子培养液接种到18L YPD发酵培养基中，发酵16h后加入终浓度为2%的D-半乳糖，诱导8h，得到富集的基因工程菌QZ-016。

其中：

步骤（1）（4）（5）中所述的YPD培养基，其组成如下：40g/L葡萄糖、20g/L酵母浸膏、0.3%磷酸氢二氨，由KOH调pH 7.0，溶剂为水；步骤（3）所述的CMP-YPD培养基，是在YPD培养基的额外加入CMP 3.23g/L；

步骤（2）（3）（4）中所述的培养，其接种量为5%，培养温度为30℃，培养时间为24h，转速为150rpm；

步骤（5）中所述的发酵，其接种量为5%，培养温度为30℃，培养时间为24h，转速为400rpm，通气6L/min；

发酵罐所得18L菌液，10000rpm离心15min，共得1.6kg基因工程菌湿菌体，菌浓89g/L。

对照例1：出发菌株S. cerevisiae HG的发酵培养：

（1）将出发菌株S. cerevisiae HG从非抗性平板接种到5mL YPD液体培养基中，培养至OD₆₀₀=0.6；

（2）将步骤（1）得到的种子培养液接种到100mL CMP-YPD液体培养基中，摇床培养24h，得到一级种子培养液。

（3）将步骤（2）得到的种子培养液接种到500mL YPD液体培养基中，摇床培养24h，得到二级种子培养液。

（4）将步骤（3）得到的种子培养液接种到18L YPD发酵培养基中，发酵24h，得到富集的出发菌株S. cerevisiae HG；其中：

步骤（3）（4）中所述的YPD培养基，其组成如下：40g/L葡萄糖、20g/L酵母浸膏、0.3%磷酸氢二氨，由KOH调pH 7.0，溶剂为水。（2）所述的CMP-YPD培养基，是在YPD培养基的额外加入CMP 3.23g/L。

步骤（2）（3）（4）中所述的培养，其接种量为5%，培养温度为30℃，培养时间为24h，转速为160rpm。

步骤（4）中所述的发酵，其接种量为5%，培养温度为30℃，培养时间为24h，转速为400rpm，通气6L/min。

上述发酵罐所得18L菌液，10000rpm离心15min，共得0.82kg HG酵母湿菌体，菌浓45g/L。

实施例3：酵母菌株的风干备用：

上述发酵所得基因工程菌湿菌体，收集菌体于40℃真空干燥箱干燥。每2h翻动打磨一次，直至得到粉末状的均匀颗粒，置于干燥器中备用。

实施例4：酵母菌株的速冻备用：

上述发酵所得基因工程菌湿菌体，收集菌体于-40℃冻存30天以上备用。

实施例5：风干酵母的生物转化：

（1）生物转化体系共20mL，包括：烘干酵母10%(2g)，CMP 27.8mmol/L、CP 100mmol/L、葡萄糖250mmol/L，硫酸镁12mmol/L，磷酸钾缓冲液（pH7.5）200mmol/L。将以上体系混匀并定容至20mL，放入恒温振荡器中后开始计时。摇床参数设定为32℃，180 rpm，反应第3h补2%葡萄糖，5h补1%葡萄糖。

（2）CDP-C反应转化率的测定方法参见邱蔚然、王维育等《胞苷二磷酸胆碱的简易快速测定方法》，《医药工业》1985年16卷2期。

经检测，烘干基因工程菌QZ-016酵母的4h转化率为47.35%，7h转化率为73.10%，反应体系中胞磷胆碱的7h终浓度为20.322mmol/L（10.4g/L）。

实施例6：冻存酵母的生物转化：

（1）生物转化体系共20mL，包括：冻存酵母40%(8g)，CMP 27.8mmol/L、CP 100mmol/L、葡萄糖250mmol/L，硫酸镁12mmol/L、磷酸钾缓冲液（pH7.5）200mmol/L。将以上体系混匀并定容至20mL，放入恒温振荡器中后开始计时。摇床参数设定为32℃，180 rpm，反应第3h补2%葡萄糖，5h补1%葡萄糖。

（2）CDP-C反应转化率的测定方法同上。

经检测，冻存基因工程菌QZ-016酵母的4h转化率为54.67%，7h转化率为64.90%，反应体系中胞磷胆碱的7h终浓度为18.042mmol/L（9.2g/L）。

对照例2：出发菌株S. cerevisiae HG冻存酵母的生物转化：

按照实施例6的方法，使用对照例1的方法得到出发菌株S. cerevisiae HG的冻存酵母，4h转化率为30.41%，7h转化率为38.32%，反应体系中CDP-C的7h终浓度为10.653mmol/L（5.44g/L）。

序列表

<110>南通秋之友生物科技有限公司

<120>一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌及构建方法和应用

<210>1

<211>1277

<212>DNA

<213>磷酰胆碱胞苷转移酶基因序列

<400> 1

ggtaccatgg caaacccaac aacagggaag tcctcgatta gggctaagct 50

ttctaactca tcgctatcaa acctatttaa aaaaaataaa aataaaagac 100

agcgtgagga aacggaagag caggacaatg aggataagga tgagagtaag 150

aaccaggatg aaaataagga cacacagctc actccccgca agcgtcgccg 200

gttgacgaag gagtttgaag agaaggaggc tcgttacacc aacgagttgc 250

ccaaggaact gcgcaagtat cgtcctaaag gtttcagatt caatttgcct 300

ccaacggata gacccatca ggatatatgc agatggtgtt tttgatcttt 350

tccatcttgg ccacatgaag caactggaac agtgtaaccc aatgtaacac 400

tgatagttgg tgtgcctagc gacaaaatca ctcacaaact aaaaggtttg 450

actgtgctga ccgataagca gcgttgtgaa actttaacgc actgcagatg 500

ggttgacgaa gtcgtgccca acgctccctgg tgtgtcaccc cagaatttct 550

actagaacac aagattgact acgtggcaca tgacgatatt ccttacgtta 600

gcgccgacag cgacgatatc tacaagccaa taaaggagat gggaaaattc 650

ttgactaccc aaagaaccaa tggtgtctct acaagtgata ttatcacaaa 700

gatcatcaga gattatgaca aatatttgat gagaaacttt gcaaggggtg 750

ctaccagaca ggagctgaac gtttcttggt tgaagaaaaa cgaactggag 800

ttcaaaaaac acatcaatga attcaggtca tatttcaaga aaaaccagac 850

aaatttgaat aacgcctcca gagacttgta cttcgaagtc cgtgaaatct 900

tgctaaagaa aacgttgggc aaaaaactct actccaagtt aataggcaat 950

gaattaaaga aacaaaatca acgacaaaga aaacagaatt ttttggatga 1000

tccgtttact aggaagctaa tcagggaggc ctctccggct acagagtttg 1050

ccaacgaatt tacgggcgaa aactctaccg ctaaatcacc ggatgacaat 1100

ggaaatcttt tcagtcagga agatgatgaa gacacaaatt ctaacaacac 1150

gaatacaaat tcagattcag attcaaacac taactcaacg cctcccagtg 1200

aagatgacga cgacaacgac aggttaactt tggaaaacct aacacagaag 1250

aagaaacaat cagcgaactg aggatcc 1277

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>cct-S

<400> 2

ccatg gttcg aatta taagg g

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>cct-A

<400> 3

ggatc cacta gtaac ggccg ccagt

<210>4

<211>424

<212>PRT

<213>磷酸胆碱胞苷转移酶

<400> 4

Met Ala Asn Pro Thr Thr Gly Lys Ser Ser Ile Arg Ala Lys Leu Ser 16

Asn Ser Ser Leu Ser Asn Leu Phe Lys Lys Asn Lys Asn Lys Arg Gln 32

Arg Glu Glu Thr Glu Glu Gln Asp Asn Glu Asp Lys Asp Glu Ser Lys 48

Asn Gln Asp Glu Asn Lys Asp Thr Gln Leu Thr Pro Arg Lys Arg Arg 64

Arg Leu Thr Lys Glu Phe Glu Glu Lys Glu Ala Arg Tyr Thr Asn Glu 80

Leu Pro Lys Glu Leu Arg Lys Tyr Arg Pro Lys Gly Phe Arg Phe Asn 96

Leu Pro Pro Thr Asp Arg Pro Ile Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Val Phe 112

Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Lys Gln Leu Glu Gln Cys Lys Lys 128

Ala Phe Pro Asn Val Thr Leu Ile Val Gly Val Pro Ser Asp Lys Ile 144

Thr His Lys Leu Lys Gly Leu Thr Val Leu Thr Asp Lys Gln Arg Cys 160

Glu Thr Leu Thr His Cys Arg Trp Val Asp Glu Val Val Pro Asn Ala 176

Pro Trp Cys Val Thr Pro Glu Phe Leu Leu Glu His Lys Ile Asp Tyr 192

Val Ala His Asp Asp Ile Pro Tyr Val Ser Ala Asp Ser Asp Asp Ile 208

Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Met Gly Lys Phe Leu Thr Thr Gln Arg Thr 224

Asn Gly Val Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp Tyr 240

Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Thr Arg Gln Glu 256

Leu Asn Val Ser Trp Leu Lys Lys Asn Glu Leu Glu Phe Lys Lys His 272

Ile Asn Glu Phe Arg Ser Tyr Phe Lys Lys Asn Gln Thr Asn Leu Asn 288

Asn Ala Ser Arg Asp Leu Tyr Phe Glu Val Arg Glu Ile Leu Leu Lys 304

Lys Thr Leu Gly Lys Lys Leu Tyr Ser Lys Leu Ile Gly Asn Glu Leu 320

Lys Lys Gln Asn Gln Arg Gln Arg Lys Gln Asn Phe Leu Asp Asp Pro 336

Phe Thr Arg Lys Leu Ile Arg Glu Ala Ser Pro Ala Thr Glu Phe Ala 352

Asn Glu Phe Thr Gly Glu Asn Ser Thr Ala Lys Ser Pro Asp Asp Asn 368

Gly Asn Leu Phe Ser Gln Glu Asp Asp Glu Asp Thr Asn Ser Asn Asn 384

Thr Asn Thr Asn Ser Asp Ser Asp Ser Asn Thr Asn Ser Thr Pro Pro 400

Ser Glu Asp Asp Asp Asp Asn Asp Arg Leu Thr Leu Glu Asn Leu Thr 416

Gln Lys Lys Lys Gln Ser Ala Asn 424

Claims

1.一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌，其特征在于，在出发菌株导入了克隆有编码磷酰胆碱胞苷转移酶cct基因的重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct；

所述cct基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1中1-1277bp，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码424个氨基酸和一个终止密码子；

所述出发菌株为S. cerevisiae HG；

所述表达质粒为pYES2.0-Kanmx；

其中，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒的多克隆位点处，其表达质粒的启动子为GAL1。

2.一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

步骤1：搜索Genbank数据库，得到酿酒酵母来源的编码磷酸胆碱胞苷转移酶的cct基因核苷酸序列SEQ ID NO：1；

步骤2：根据cct基因序列信息，设计合成SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列引物cct-S和cct-A；

步骤3：以步骤2得到的SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列引物cct-S和cct-A为引物，经过PCA即快速聚合酶链式组装法得SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列cct基因；

步骤4：将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列克隆到表达质粒pYES2.0-Kanmx中，得到重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct；

步骤5：将步骤4得到的重组质粒pYES2.0-Kanmx-cct转化出发菌株S. cerevisiae HG，即得到所述过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌。

3.一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶酿酒酵母基因工程菌在制备胞磷胆碱中的应用。