CN102492673B - 一种柠檬明串珠菌发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种柠檬明串珠菌发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用，属于食品生物技术领域。本发明利用一株交替糖蔗糖酶产生菌柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)SK24.002进行斜面、种子、发酵三级培养，从发酵液与菌体细胞分离纯化得到一种交替糖蔗糖酶酶粉。本发明提供的利用柠檬明串珠菌SK24.002生产交替糖蔗糖酶的方法，其发酵时间短、费用低，安全性能可靠，可以进行液体深层发酵以及高密度细胞培养，适合于大规模生产。本发明所产交替糖蔗糖酶酶活达到10U/mg以上。其发酵产品无毒，可以直接用于生产许多有益生元功效的新型功能性碳水化合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种柠檬明串珠菌SK24.002发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用，属于食品生物技术领域。
背景技术
现今社会，人类生活节奏加快、社会竞争激烈、饮食结构改变、环境污染等，都严重威胁着人类的健康，使得大多数的人群都处于亚健康状态。目前，广大公众对自身健康状况日益关注，有越来越多的人选择使用食物来改变这种状况，从“治已病”为主前移到“治未病”和养生保健，从“被动医疗”转向“主动健康”。为了顺应现代食品科技发展的方向并满足消费者的健康需求，低血糖、低热量的功能性碳水化合物已成为21世纪健康食品的发展潮流。
葡聚糖蔗糖酶（glucansucrase，GS，EC.2.4.1.-），又称葡糖基转移酶，是催化葡糖基特异性转移的酶，属于淀粉水解酶GH70家族，反应类型主要有三类：
（1）水解反应：sucrose+H2O→glucose+frucose
（2）聚合反应：sucrose+glucann→glucann+1+frucose
（3）受体反应：sucrose+disaccharide/trisaccharide→oligosaccharides+frucose
交替糖蔗糖酶（Alternansucrase）是一种新型的葡聚糖蔗糖酶，主要由植物细胞或微生物细胞产生，在糖代谢过程中参与蔗糖的转移与利用。目前，交替糖蔗糖酶的研究机构主要集中在欧美国家，相关报道仅局限于酶分子核酸序列与生物学性质研究，国内在此领域研究并不多见。
本发明人深入调查和研究了现有技术并对各种交替糖蔗糖酶生产方法进行了研究，最终我们发现柠檬明串珠菌发酵生产交替糖蔗糖酶的方法并能生物合成新型的功能性碳水化合物。基于上述发现提出了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种柠檬明串珠菌SK24.002发酵生产交替糖蔗糖酶的方法及应用，属于食品生物技术领域。
本发明使用的柠檬明串珠菌是本发明人等先前从我国传统发酵泡菜中分离得到，其分类名为柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK 24.002，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2011398，保藏日期2011年11月18日。
本发明的技术方案：一种用柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK24.002发酵生产交替糖蔗糖酶的方法，步骤为：
（1）以柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK24.002为出发菌株，进行斜面、种子、发酵三级培养；
斜面培养（g/L）：葡萄糖1~5 ，酵母粉5~10，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，一水合硫酸锰0.01~0.015，Vc 0.03~0.05，琼脂20，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min。培养条件：培养温度30~37℃，培养时间10~18h。
种子培养（g/L）：葡萄糖5~10，酵母粉10~20，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，一水合硫酸锰0.01~0.015，Vc 0.03~0.05，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min。培养条件： 100mL三角瓶装液40mL，将斜面培养后的斜面培养基按体积百分比5%~10%接入种子培养基中，培养温度30~37℃，摇瓶转速160rpm，培养时间8~12h。
发酵培养（g/L）：蔗糖20~40，酵母粉10~20，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，吐温80 5~10mL/L，Vc 0.03~0.05，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min。培养条件：将种子培养后的种子培养基按体积百分比5%~10%接入发酵培养基中，培养温度30~37℃，摇瓶转速160rpm，培养时间12~24h。
（2）从发酵液中分离纯化得到交替糖蔗糖酶酶粉；
将步骤（1）制得的发酵液经离心或板框过滤分离发酵上清液与微生物菌体，其中发酵上清液经超滤去盐和杂蛋白，再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀1；微生物菌体悬浮于8M、pH5.4的脲-醋酸钠缓冲液中，25℃下振摇1~4h，离心得到上清液，透析处理后再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀2，最后将上述两步骤所得沉淀合并冷冻干燥得到交替糖蔗糖酶酶粉。
所得产品交替糖蔗糖酶酶活力达到10U/mg以上，可应用于生物合成新型具有益生元功效的新型碳水化合物，其催化底物受体包括蔗糖、乳糖、塔格糖、阿洛酮糖、双果糖酐、麦芽糖醇、龙胆糖、异麦芽酮糖、蜜二糖、棉籽糖等中的一种或多种。
本发明中交替糖蔗糖酶的活力是以生物催化产生果糖的量定义的。1U为每min产生1μmol果糖的量。酶活测定方法：反应产生的果糖采用DNS（3,5二硝基水杨酸）方法测定。
本发明的有益效果：柠檬明串珠菌最初来源于传统的发酵泡菜，安全性高，且其本身为益生菌。通过液体发酵，发酵时间短，成本低，产量高。发酵产物交替糖蔗糖酶安全可靠，可直接用于合成多种具有益生元功效的新型碳水化合物。
生物材料样品保藏：柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK 24.002，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2011398，保藏日期2011年11月18日。
具体实施方式
下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实例。
实施例 1：柠檬明串珠菌发酵产酶
斜面培养：葡萄糖1 g，酵母粉5g，无水氯化钙0.025g，磷酸氢二钾10g，七水合硫酸镁0.3g，一水合硫酸锰0.01g，Vc 0.05g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至6.9。30℃下培养12h。
种子培养：葡萄糖10 g，酵母粉15g，无水氯化钙0.025g，磷酸氢二钾10g，七水合硫酸镁0.3g，一水合硫酸锰0.01g，Vc 0.05g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至6.9。100mL三角瓶装液40mL，斜面培养基按5%（v/v）接入种子培养基中，用牛皮纸包住，30℃下160rpm，摇床12h。
发酵培养：蔗糖20 g，酵母粉15g，无水氯化钙0.025g，磷酸氢二钾10g，七水合硫酸镁0.3g，吐温80 10mL/L，Vc 0.05g，蒸馏水定容至1000mL，调节pH6.9。种子培养基按5%（v/v）接入发酵培养基中，30℃，160rpm，培养17h。测定发酵液的酶活为0.8U/mL。
实施例2 交替糖蔗糖酶酶粉的制备
将发酵液在10000g，4℃下离心10min收集上清液和菌体细胞，上清液用分子截留量为30KDa的超滤膜超滤，去除盐与杂蛋白，再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀1；菌体细胞用pH5.4的醋酸钠缓冲溶液清洗两次，加入10mL pH5.4，8M的脲-醋酸钠缓冲溶液25℃下振摇3h，经分子截留量为10KDa的透析袋除去残留的脲，用50%的聚乙二醇沉淀使最终聚乙二醇的浓度达到20%，离心得到沉淀2；沉淀1和沉淀2直接冷到干燥，即得交替糖蔗糖酶酶粉，酶活力达到18U/mg。
实施例3 交替糖蔗糖酶的应用
将获得的交替糖蔗糖酶酶粉溶解于pH5.4的醋酸钠缓冲溶液中，使其活力达到8U/mL，以10%的蔗糖为底物，30℃下进行酶反应48h，煮沸灭酶后，离心获得上清液，冷冻干燥得到新型葡聚糖，产量达32 mg/mL，经NMR测定其结构为-[α-Glcp(1→3)-α-Glcp(1→6)]-n，能被双歧杆菌、乳杆菌等肠道益生菌高效增殖。
本文所描述的具体实施例仅作为对本发明精神和部分实验做举例说明。本发明所涉领域的技术人员可以对所描述的具体实施案例做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
Claims (3)
1.一种用柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）SK24.002，保藏号CCTCC NO：M 2011398，发酵生产交替糖蔗糖酶的方法，其特征在于：
（1）以CCTCC NO：M 2011398为出发菌株，进行斜面、种子、发酵三级培养；
斜面培养基以g/L计：葡萄糖1~5，酵母粉5~10，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，一水合硫酸锰0.01~0.015，Vc 0.03~0.05，琼脂20，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min；培养条件：培养温度30~37℃，培养时间10~18h；
种子培养基以g/L计：葡萄糖5~10，酵母粉10~20，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，一水合硫酸锰0.01~0.015，Vc 0.03~0.05，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min；培养条件：100mL三角瓶装液40mL，将斜面培养后的斜面培养基按体积百分比5%~10%接入种子培养基中，培养温度30~37℃，摇瓶转速160rpm，培养时间8~12h；
发酵培养基以g/L计：蔗糖20~40，酵母粉10~20，无水氯化钙0.02~0.025，磷酸氢二钾10~15，七水合硫酸镁0.2~0.5，吐温80 5~10mL/L，Vc 0.03~0.05，pH6.8~7.0，121℃灭菌20min；培养条件：将种子培养后的种子培养基按体积百分比5%~10%接入发酵培养基中，培养温度30~37℃，摇瓶转速160rpm，培养时间12~24h；
（2）从发酵液中分离纯化得到交替糖蔗糖酶酶粉；
将步骤（1）制得的发酵液经离心或板框过滤分离发酵上清液与微生物菌体，其中发酵上清液用分子截留量为30KDa的超滤膜经超滤去盐和杂蛋白，透过液再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀1；微生物菌体悬浮于8M、pH5.4的脲-醋酸钠缓冲液中，25℃下振摇1~4h，离心得到上清液，透析处理后再用50%的聚乙二醇沉淀，离心得到沉淀2，最后将上述两步骤所得沉淀合并冷冻干燥得到交替糖蔗糖酶酶粉。
2.用权利要求1所述方法生产的产品交替糖蔗糖酶酶粉，其特征在于该产品交替糖蔗糖酶酶活力达到10U/mg以上，1U为每min产生1μmol果糖的量。
3.用权利要求1所述方法生产的产品交替糖蔗糖酶酶粉的应用，其特征在于产品交替糖蔗糖酶酶粉应用于生物合成具有益生元功效的碳水化合物，催化底物受体为蔗糖。
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