CN110804575A - 一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌及应用，该菌株已于2019年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M 2019971。所述柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1‑1是从广西壮族地区传统食物生榨米粉中筛选出的具有产菊粉酶能力的乳酸菌菌株1‑1，以菊粉为碳源、牛肉膏为氮源等组成发酵培养基进行发酵生产酸性菊粉酶，该菌株在发酵培养基上生长良好，耐酸性强，该菌株所产酸性菊粉酶在pH 4.0条件下，1h后存活率为96％，发酵后经检测具有降解菊粉和果聚糖类物质以及制备高果糖浆的能力。

Description

一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌及应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及功能性乳酸菌开发及其制品生产开发领域。具体涉及一株产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌，本发明还包括该柠檬明串珠菌的应用。
背景技术
目前工业生产中菊粉的主要来源为菊芋，菊芋价格低廉、产量较高，属于非粮作物等特点，使其成为生物炼制关注的焦点。根据菊粉酶作用于底物的方式不同可分为外切菊粉酶和内切菊粉酶，外切菊粉酶作用于果聚糖非还原末端的果糖苷键，逐一切下果糖，最终产物为果糖和少量的葡萄糖；内切菊粉酶是随机作用于菊粉内部的果糖苷键，产物主要为低聚果糖。现在工业生产中制备果糖浆，主要是通过以淀粉为原料利用酶解法生产，但是该反应步骤多、工艺复杂、生产成本较高。而利用菊粉酶水解菊粉，水解产物主要为果糖和少量的葡萄糖，此法转化率高、工艺简单。目前工业上生产低聚果糖的方法有酸解法和酶解法。酸解法终产物得率低、纯化较困难、不利于发挥其功能性作用。酶解法一种是由蔗糖经转果糖基反应而生成，反应不易控制，且蔗糖和葡萄糖副产品多；另一种是以菊粉为原料经内切菊粉酶水解生成低聚果糖，主要产物为低聚果糖和少量的果糖。因此将菊粉酶应用于生产高果糖浆、低聚果糖成为大量学者研究的方向。
大量文献报道，在酸性条件下对菊粉进行降解，可以有效防止副产物的产生，提高菊粉等果聚糖基原料降解产物的得率。因此，大力开发新型高效酸性菊粉酶，开发菊粉等果聚糖基原料的酸性酶解工艺，具有重要的应用前景和经济价值。
自然界中可以产生菊粉酶的微生物有很多，如细菌、真菌和酵母菌，目前研究较多的是曲霉属(Aspegillius sp.)、青霉属(Penicillium sp.)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)，但鲜见食源食品级微生物来源酸性菊粉酶的研究报道。2002年，Paludan-Muller等人首次报道了一株产弱酸性菊粉酶的Lactobacillus pentosus，这也是目前唯一的一个乳酸菌来源的食源酸性菊粉酶(ChristinePaludan-Muller,Lone Gram,Fergal P.Rattray.Purification and Characterisation of an ExtracellularFructan b-fructosidase from a Lactobacillus pentosus Strain Isolated fromFermented Fish.Systematic and Applied Microbiology,2002,25(1):13-20.)。
生榨米粉是广西壮族特色的一种传统发酵食物，其中蕴含着丰富的乳酸菌资源。本发明对本实验室前期构建的广西特色生榨米粉来源乳酸菌库进行高通量筛选，筛选出新型产酸性菊粉酶乳酸菌，将其应用于食品领域，特别是用于生产制备酸性菊粉酶，以及用于降解果聚糖类物质，例如菊粉、生产高果糖浆等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum1-1及其应用。该菌株具有生产酸性菊粉酶基因和制备果糖的能力。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1，于2019年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M 2019971，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心，邮编：430072。
所述柠檬明串珠菌CCTCC NO：M 2019971，是来自本实验室前期从广西南宁壮族传统食物生榨米粉中分离获得。
所述柠檬明串珠菌CCTCC NO：M 2019971，在MRS固体培养基上生长良好，菌落为乳白色，表面光滑，边缘齐整，不透明。
所述柠檬明串珠菌CCTCC NO：M 2019971，采用细菌通用引物16S rDNA的27F/1492R对其基因组DNA为进行PCR扩增并测序，获得1476bp的基因序列，如SEQUENCE LISTING所示。将该基因序列输入NCBI进行比对，其与柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum strainCBA3623相似率达99.59％，可初步鉴定该菌株为柠檬明串珠菌Lactobacillus citreum。
上述菌株在生产菊粉酶中的应用也在本发明的保护范围之内。
一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1的生产方法，包括如下步骤：
(1)种子培养
将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1划线至MRS固体培养基，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；
(2)发酵培养
挑取在固体培养基中正常生长的单菌落划线至固体发酵培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落。
挑取固体发酵培养基上正常生长的单菌落，接种到液体发酵培养基中，于30℃，静置发酵1-2天，得到发酵液。
(3)制备酸性菊粉酶
吸取发酵液10mL，在4℃，10000r/min条件下，离心5min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入0.2mol/L、pH 5.0的醋酸缓冲溶液400μL重悬沉淀，后加入100mg/ml的溶菌酶200μL，于30℃静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃下高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。
本发明方法制备得到的酸性菊粉酶最适反应温度为35℃，且在20-45℃范围内保温30min仍具有50％以上活力；最适pH为4.0，在pH 3.5-pH 10.0之间酶都具有65％以上的活力，pH范围较广泛。
其中，菊粉酶的酶活定义如下：在最适温度、最适pH条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，即为1个酶活力单位(U)。
本发明的另一个目的是提供柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1的发酵液在降解果聚糖类物质中的应用，优选的是菊粉类物质，所述应用包括在菊粉果糖和菊粉高果糖浆中的应用。
本发明所述柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1发酵生产的酸性菊粉酶在降解果聚糖类物质中的应用，优选的是菊粉类物质，所述应用包括在菊粉果糖和菊粉高果糖浆中的应用，均在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果是：
(1)提供的生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌，是以菊粉为碳源、牛肉膏为氮源等组成的发酵培养基，在pH 6.6-6.8，于30℃条件下静置发酵生产酸菊粉酶，发酵液及酶同时具有菊粉酶活性和转化酶活性。
(2)提供的柠檬明串珠菌酸性菊粉酶最适pH为4.0，在pH 3.5-pH 10.0广泛范围内具有较高的稳定性，特别适合于酸性条件下水解果聚糖类物质，例如菊粉等工业用途。
附图说明
图1为柠檬明串珠菌CCTCC NO：M 2019971的菌落形态图
图2为实施例3中酸性菊粉酶最适反应温度
图3为实施例3中酸性菊粉酶温度稳定性
图4为实施例4中酸性菊粉酶最适pH
图5为实施例4中酸性菊粉酶pH稳定性
图6为实施例9中酸性菊粉酶水解菊粉产物TLC图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种产菊粉酶菌株的筛选和鉴定
(1)产菊粉酶的乳酸菌初步筛选
将本实验室前期从广西壮族传统生榨米粉中筛选出的柠檬明串珠菌1-1、植物乳杆菌1-2、植物乳杆菌1-3、植物乳杆菌3-2、植物乳杆菌4-3、植物乳杆菌6-3、发酵乳杆菌9-4以及实验室保存的保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、戊糖片球菌、干酪乳杆菌划线至MRS固体培养基上，于30℃培养直至出现单菌落；
将上述固体培养基中正常生长的单菌落分别划线至以菊粉为唯一碳源的固体发酵培养基中，于30℃培养直至出现单菌落；
(2)含酸性菊粉酶基因乳酸菌二次筛选
挑取固体发酵培养基中正常生长的单菌落接种至液体发酵培养基中，于30℃，静置发酵1-2天，将制备的发酵液破胞得到酸性菊粉酶，测定各菌株所产菊粉酶活性，选出其中菊粉酶活最高的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1。
在上述实验中，酸性菊粉酶的制备：将在固体发酵培养基中正常生长的单菌落接种于以菊粉为唯一碳源的液体发酵培养基中，于30℃静置培养1-2天，得到发酵液。吸取发酵液10mL，在4℃，10000r/min条件下，离心2min，弃去上清液，保留沉淀。向沉淀中加入0.2mol/L、pH 5.0的醋酸缓冲溶液400μL重悬沉淀，后加入100mg/ml的溶菌酶200μL，于30℃静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃下高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。
在上述实验中，酶活测定：取100μL酸性菊粉酶分别加入0.5％用pH 5.0、0.2M醋酸缓冲液配制的200μL菊粉溶液和0.5％用pH 5.0、0.2M醋酸缓冲液配制的200μL蔗糖溶液，于30℃水浴中反应30min后，立即沸水浴5min终止反应，在反应液中加入300μl DNS，于沸水浴中7min，待迅速冷却后于540nm处测定生成的还原糖量，以在沸水浴中加热灭活的酶液作为空白对照。
在上述实验中酶活定义：在最适温度、最适pH条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量，即为1个酶活力单位(U)。其中一个菊粉酶活力(I)单位定义为每分钟催化菊粉转化为1μmol果糖所需的酶量，一个转化酶活力(S)单位定义为每分钟催化蔗糖转化为1μmol果糖所需的酶量。
实施例2
利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1发酵生产酸性菊粉酶
用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1进行发酵生产酸性菊粉酶，以接种量1％(v/v)将菌株接种至液体发酵培养基中，在30℃条件下静置发酵1-2天，破胞测其酶活。其中，其中一个菊粉酶活力(I)单位定义为每分钟催化菊粉转化为1μmol果糖所需的酶量，一个转化酶活力(S)单位定义为每分钟催化蔗糖转化为1μmol果糖所需的酶量。
蛋白含量的测定：使用康为BCA蛋白定量试剂盒测定酸性菊粉酶蛋白含量，计算酶比活力。按照BCA蛋白定量试剂盒的操作说明，稀释标准品并配制BCA工作液。用醋酸缓冲溶液将样液稀释5倍，按试剂盒步骤测定酸性菊粉酶蛋白总含量，同时做好记录，根据测定数据绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
表1酸性菊粉酶酶活、转化酶活、蛋白总含量及比酶活力结果
Figure BDA0002313802270000051
实施例3
柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1产酸性菊粉酶最适反应温度和温度稳定性
酸性菊粉酶的制备方法同实例一。取100μl酸性菊粉酶加入0.5％用pH 5.0、0.2M醋酸缓冲液配制的200μL菊粉溶液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃和80℃下反应30min后立即沸水浴5min以终止反应，然后DNS法测定酶活，以测定结果最高酶活为100％，计算各测定组的相对酶活。每个温度设置3个平行样品。
将100μl酸性菊粉酶在以上温度保温30min后加入0.5％用pH 5.0、0.2M醋酸缓冲液配制的200μL菊粉溶液在30℃下反应30min，然后用DNS法测定酶活，以测定结果最高酶活为100％。每个温度设置3个平行样品。
通过比较酶活大小确定柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1最适反应温度为35℃，且在20-45℃范围内都具有60％以上的酶活力，但在50℃保温30min酶活快速下降，酶活不足原酶活的20％。
实施例4
柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1产酸性菊粉酶最适反应pH和pH稳定性
酸性菊粉酶的制备方法同实施例一。配制不同pH的缓冲液，pH3.5、4.0、4.5、5.0为醋酸缓冲液，5.5、6.0、6.5、7.5为磷酸缓冲液，8.0、8.5、9为Tris-Hcl缓冲液，9.5、10.0、10.5、11为碳酸缓冲液。将100μL酸性菊粉酶与200μL以上述不同pH配制的菊粉溶液在30℃下反应30min后立即放入沸水终止反应，再用DNS法测酶活，以测定结果最高酶活为100％，计算各测定组的相对酶活。每个pH设置3个平行样品。
将50μL酸性菊粉酶与50μL不同pH的缓冲液混合，于4℃放置1h后，加入200μL菊粉溶液在30℃下反应30min后立即放入沸水终止反应，再用DNS法测酶活，以测定结果最高酶活为100％，计算各测定组的相对酶活。每个pH设置3个平行样品。
通过比较酶活大小确定柠檬明串珠菌1-1最适反应pH为4.0，且在pH 3.5-10.0之间都有65％以上的酶活力，具有较宽的pH耐受范围，但在pH 10.5后酶活力下降，酶活不足原酶活的50％。
实施例5
利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1发酵液降解果聚糖类物质。
将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1在30℃条件下静置发酵1-2天，制备发酵液，利用发酵液降解果聚糖类物质。以2％菊糖型果聚糖为底物，将100μl发酵液与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的发酵液作为空白对照，用DNS法检测到产物中还原糖浓度为310μmol/l，证明柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1发酵液具备降解果聚糖类物质的能力。
实施例6
利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1发酵液降解菊粉。
将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1在30℃条件下静置发酵1-2天，制备发酵液，利用发酵液降解菊粉。以2％菊粉为底物，将100μl发酵液与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的发酵液作为空白对照，用DNS法检测到产物中还原糖浓度为307μmol/l，证明柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1发酵液具备降解菊粉的能力。
实施例7
利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1所产酸性菊粉酶降解果聚糖类物质。
酸性菊粉酶的制备方法同实例一，利用酸性菊粉酶降解果聚糖类物质。以2％菊糖型果聚糖为底物，将100μl酸性菊粉酶与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的酶作为空白对照，用DNS法检测到产物中还原糖浓度为658μmol/l，证明柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1所产酸性菊粉酶具备降解果聚糖类物质的能力。
实施例8
利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1所产酸性菊粉酶降解菊粉。
酸性菊粉酶的制备方法同实例一，利用酸性菊粉酶降解菊粉。以2％菊粉为底物，将100μl酸性菊粉酶与200μl底物混合，在35℃下反应1h，以在沸水浴中加热灭活的酶作为空白对照，用DNS法检测到产物中还原糖浓度为698μmol/l，证明柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum 1-1所产酸性菊粉酶具备降解菊粉的能力。
实施例9
利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1所产酸性菊粉酶制备高果糖浆。
酸性菊粉酶的制备方法同实例一。将酸性菊粉酶于4℃冰浴中，以饱和度为40％硫酸铵盐析后4℃离心以除去杂蛋白，有少量的沉淀，且只有少许菊粉酶活力，说明大部分菊粉酶还保留在发酵液中，以饱和度为80％硫酸铵继续盐析时，上清液中几乎没有酶活，说明大部分目的蛋白已被沉淀出来，用缓冲液溶解目的蛋白，得到初纯酶液。
利用初纯酶液水解菊粉制备高果糖浆。以2％菊粉为底物，将100μl初纯酶液与200μl底物混合，在35℃下反应10h，然后用薄层色谱法(TLC)检测水解产物，其中展开剂为正丁醇、异丙醇、醋酸、水按7:5:1:2(体积比)混合，显色剂为2％二苯胺丙酮溶液、2％苯胺丙酮溶液、85％磷酸按5:5:1的比例混合。薄层色谱结果显示菊糖几乎100％被水解成单糖，证明利用柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1所产酸性菊粉酶能够用于制备高果糖浆。
本发明不限于上述技术方案，对本发明的任何改进，包括对该技术方案进行多种简单变形，均落在本发明的保护范围内。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中描述的各个具体技术特征，在不矛盾情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可任意进行组合，只要不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> Leuconostoc citreum 1-1(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
gcggggcggg tgctatacat gcaagtcgaa cgcgcagcga gaggtgcttg cacctttcaa 60
gcgagtggcg aacgggtgag taacacgtgg ataacctgcc tcaaggctgg ggataacatt 120
tggaaacaga tgctaatacc gaataaaact tagtatcgca tgatatcaag ttaaaaggcg 180
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aatcgcggat cagcacgccg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccatggga gtttgtaatg cccaaagccg gtggcctaac cttcgggagg gagccgtcta 1440
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<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Leuconostoc citreum 1-1(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
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<210> 3
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<213> Leuconostoc citreum 1-1(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
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Claims (10)

1.一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1，其特征在于，该菌株已于2019年11月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019971。
2.权利要求1所述的一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoccitreum1-1，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1所述的一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum1-1的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子培养
将柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum 1-1划线至MRS固体培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；
(2)发酵培养
将MRS固体培养基中的单菌落划线至固体发酵培养基中，于30℃条件下静置培养直至出现单菌落；
挑取固体发酵培养基上正常生长的单菌落，接种到液体发酵培养基中，在温度为30℃的条件下，静置发酵1-2天，得到发酵液；
(3)制备酸性菊粉酶
吸取发酵液10mL，在4℃，10000r/min条件下，离心5min，弃去上清液，保留沉淀，向沉淀中加入0.2mol/L、pH 5.0的醋酸缓冲溶液400μL重悬沉淀，后加入100mg/ml的溶菌酶200μL，于30℃静置2h，再加入0.12g石英砂，随后在-30℃下高通量组织研磨器研磨240s，破胞结束后，在4℃、13000r/min条件下离心30min，取上清液，即为酸性菊粉酶。
4.权利要求3所述的一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum1-1的生产方法，其特征在于，
步骤(1)中所述的MRS固体培养基配方如下：
牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-80 1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；
20％葡萄糖储备液：用超纯水配制葡萄糖溶液200g/L，121℃高压灭菌20min；
使用时加入终浓度为2％的葡萄糖储备液。
步骤(2)中所述的固体发酵培养基配方如下：
牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-80 1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；
20％菊糖储备液：用超纯水配制葡萄糖溶液200g/L，121℃高压灭菌20min，
步骤(2)中所述的液体发酵培养基配方如下：
牛肉膏10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2.0g，乙酸钠5.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL，pH 6.6-6.8，121℃高压灭菌15min；
20％菊糖储备液：用超纯水配制菊糖溶液200g/L，121℃高压灭菌20min；
使用时加入终浓度为2％的菊粉溶液。
5.权利要求1所述的一株用于生产酸性菊粉酶的柠檬明串珠菌Leuconostoc citreum1-1在生产菊粉酶中的应用。
6.权利要求3的方法生产得到的所述发酵液在降解果聚糖类物质中的应用。
7.权利要求3的方法生产得到的所述发酵液在降解菊粉中的应用。
8.权利要求3的方法生产得到的所述酸性菊粉酶在降解果聚糖类物质中的应用。
9.权利要求3的方法生产得到的所述酸性菊粉酶在降解菊粉中应用。
10.权利要求3的方法生产得到的所述酸性菊粉酶在高果糖浆生产中的应用。
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