CN109536422A - 一种乳酸菌的有氧高密度培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及乳酸菌高密度培养技术领域，特别涉及一种乳酸菌在有氧条件下的高密度培养方法。本发明是将乳酸菌接种到含有氧抑制剂的培养基中，在通入空气的条件下进行分批发酵培养或分批补料发酵培养，通过在乳酸菌培养基成分中添加微生物和动物中提取的氧抑制剂的方法来达到抑制有害代谢物，提高乳酸菌有氧培养的细胞密度和活菌体数量的目的。本发明添加的游动放线菌细胞提取物以及牛肝细胞提取物，能使乳酸菌有氧培养过程中活性氧的产生大大减少或消除，大大减少或清除活性氧对乳酸菌的毒害作用，实现乳酸菌有氧条件下的高密度培养。

Description

一种乳酸菌的有氧高密度培养方法
【技术领域】
本发明属于乳酸菌高密度发酵培养技术领域，特别涉及一种乳酸菌在有氧条件下的高密度培养方法。
【背景技术】
乳酸菌是一类能够发酵糖类产生主要产物为乳酸的革兰氏阳性细菌，一些乳酸菌是人和动物的肠道益生菌，在食品、人和动物保健、青贮饲料等领域有着广泛的应用，具有改善食品风味、提高营养价值的功能；具有调节肠道菌群、减少肠道对胆固醇的吸收、降低胆固醇等功能；具有抗菌、防肿瘤、提高免疫力等功能。
乳酸菌的高密度培养是指利用一定的培养技术和装置来提高菌体的发酵密度，达到活菌密度比普通培养显著提高的效果，乳酸菌的高密度培养是制备高活性发酵剂的核心。高活性乳酸菌冻干发酵剂具有使用量小，发酵活力强，操作使用方便，简化生产工艺等优点。影响乳酸菌高密度培养的因素主要有培养基的组成、培养温度、pH值等，一般通过优化培养基碳氮的比例、培养温度、培养液pH值来提高菌体发酵密度。大多数的乳酸菌为厌氧性或兼性厌氧性，抗氧胁迫机制不完善，环境中存在的以及菌株自身代谢过程生成的活性氧严重威胁菌株的存活，所以一般乳酸菌的高密度培养都在无氧条件下进行。乳酸菌在有氧条件下培养的菌体密度(OD600)比无氧条件下培养的高，但菌体活性(活菌体数量)比无氧条件下低得多，在发酵培养后期活菌体数量往往呈现直线下降的趋势。
因此，现有的乳酸菌有氧条件下高密度培养技术需要解决发酵培养过程中活性氧的产生和毒害问题，一是减少活性氧的产生；二是活性氧产生后及时清除，减少对菌体的毒害。
现有技术中常用Fe3+螯合剂做为有氧抑制剂，减少Fe3+催化活性氧的产生，然而仅添加铁离子螯合剂对乳酸菌并不能有效起到保护作用。
【发明内容】
本发明的目的是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种乳酸菌在有氧条件下的高密度培养方法，本方法能大大减少或清除乳酸菌发酵培养过程中活性氧的产生和毒害，显著提高乳酸菌发酵剂的生产效率。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，将乳酸菌接种到添加有氧抑制剂的培养基中，在通入空气的条件下进行分批发酵培养或分批补料发酵培养。
进一步的，所述乳酸菌为兼性厌氧乳酸菌，具体为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、德式乳杆菌乳酸亚种、鼠李糖乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌中的一种或多种。
进一步的，所述的乳酸菌在发酵培养中通入空气的量为0.1vvm-2.0vvm。乳酸菌在发酵培养中需要通入一定量的空气，使培养基中含有适宜量的溶解氧供菌体生长代谢用。
进一步的，所述在培养基成分中添加的氧抑制剂为游动放线菌细胞提取物和/或牛肝细胞提取物。由于在乳酸菌发酵培养过程中通入空气，培养基中有溶解氧，乳酸菌在利用溶解氧进行新陈代谢过程中产生了多量的活性氧，但厌氧性的乳酸菌和兼性厌氧的乳酸菌，其本身的抗氧胁迫机制不完善，环境中产生的活性氧对菌体有很大的毒害作用，因此乳酸菌在有氧条件下的高密度培养需要在培养基中加入以上氧抑制剂，以达到减少活性氧对菌体的毒害的目的。
进一步的，所述的游动放线菌细胞提取物的制备方法为：将游动放线菌接种于常规放线菌液体培养基，于25-30℃、转速为200r/min的摇床中发酵培养7-9天，离心，将菌体沉淀物用上清液体积0.2-0.3倍的乙醇充分悬浮，在超声破碎仪上破碎15-20分钟，离心，收集上清液即为游动放线菌细胞提取物。该提取物可不需再灭菌即可用无菌操作方法加入到已接种的乳酸菌发酵罐中。
进一步的，所述的牛肝细胞提取物的制备方法为：新鲜牛肝切碎，加入预冷到2-5℃的2-3倍体积的pH7.0磷酸缓冲液，用组织匀浆机搅碎为匀浆，室温静置4-5小时，离心，收集上清液；沉淀物再用预冷到2-5℃的2-3倍体积的pH7.0磷酸缓冲液重复提取一次，合并两次提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩8-10倍，将浓缩液过滤除菌，即为牛肝细胞提取物。该牛肝细胞提取物用无菌操作方法加入到已接种的乳酸菌发酵罐中。
进一步的，所述氧抑制剂的组成如下：乳酸菌发酵培养基体积0.1％-2.0％的游动放线菌细胞提取物和/或乳酸菌发酵培养基体积0.1％-2.0％的牛肝细胞提取物。
进一步的，所述分批发酵培养是将乳酸菌接种到培养基后，用无菌操作方法加入氧抑制剂，发酵过程通入空气，并保持37℃，搅拌100r/m，发酵至pH下降至6.8后，自动流加体积分数10％的氨水调节pH＝6.8±0.2。
进一步的，所述分批补料发酵培养是将乳酸菌接种到培养基后，用无菌操作方法加入氧抑制剂，发酵过程通入空气，并保持37℃，搅拌100r/m，发酵至pH下降至6.8后，自动流加体积分数10％的氨水调节pH＝6.8±0.2；并且在发酵数小时后补充碳源，如在第7h和第9h分别补加葡萄糖。
有益效果：
本发明的方法能简单、高效地提高乳酸菌有氧培养的细胞密度和活菌体数量。本发明是在有氧的条件下高密度培养乳酸菌，在通空气条件下进行发酵培养乳酸菌，有氧条件使菌体密度大大增加；经发明人研究发现，在培养基成分中添加自制的氧抑制剂：游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物，可使乳酸菌有氧培养过程中活性氧的产生大大减少或消除，同时还能将菌体受到活性氧的毒害作用大大减小或清除，活菌体数量得以增加及保持；乳酸菌在含有氧抑制剂和通入空气的条件下配合分批发酵培养和分批补料发酵培养，能够显著提高细胞密度和活菌体数量，达到在有氧的条件下高密度培养乳酸菌的目的。
本发明不仅适用于乳酸菌分批发酵培养，即乳酸菌接种到含有所述的氧抑制剂培养基中，在所述的通气量条件下，发酵到菌体生长的对数末期时终止发酵，收获活菌体，也适用于乳酸菌分批补料发酵培养，即乳酸菌接种到含有所述的氧抑制剂培养基中，在所述的通气量条件下，发酵到菌体生长的对数末期碳源将耗尽时，继续补入碳源使对数期延长，可进一步收获更高密度的活菌体。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，包括如下步骤：
(1)氧抑制剂的制备：
A、游动放线菌细胞提取物的制备：将游动放线菌接种于常规放线菌液体培养基，于28℃，转速为200r/min的摇床中发酵培养7-9天，10000r/min离心20分钟，将菌体沉淀物用上清液体积0.2倍的65％乙醇充分悬浮，在超声破碎仪上破碎20分钟，10000r/min离心20分钟，收集上清液即为游动放线菌细胞提取物。
B、牛肝细胞提取物的制备：新鲜牛肝切碎，加入预冷到2℃的2倍体积的pH7.0磷酸缓冲液，用组织匀浆机搅碎为匀浆，室温静置5小时，10000r/min离心30分钟，收集上清液；沉淀物再用预冷到2℃的2倍体积的pH7.0磷酸缓冲液重复提取一次，合并两次提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩8倍，将浓缩液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，即为牛肝细胞提取物。
上述的游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物可单独使用，也可组合使用。
(2)培养基准备：
培养基由以下成分组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，吐温80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，以上成分溶解，用氢氧化钠调pH至7.0，121℃灭菌20min。
MgSO4.7H2O 0.2g/L，MnSO4.H2O 0.05g/L，无水葡萄糖5g/L，以上三种单独灭菌，接种时无菌操作加入发酵罐中。
(3)乳酸菌的高密度培养：
氧抑制剂的添加分为6组，分别在接种植物乳杆菌后用无菌操作方法加入发酵罐中：
第1组无添加氧抑制剂作为空白组；
第2组添加游动放线菌细胞提取物，加入量为培养基体积的0.2％；
第3组添加牛肝细胞提取物，加入量为培养基体积的0.2％；
第4组添加游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物，两者加入量均为培养基体积的0.2％；
第5组添加终浓度为2mmol/L的无机铁离子螯合剂焦磷酸钠作为对照；
第6组添加终浓度为2mmol/L的有机铁离子螯合剂邻二氮杂菲O-phe作为对照；
发酵过程保持37℃，搅拌100r/m，通气量0.1vvm，发酵至pH下降至6.8后，自动流加体积分数10％的氨水调节pH＝6.8±0.2，每隔3小时取样测定活菌数，如表1所示。
表1乳酸菌有氧发酵培养的活菌数(单位：cfu/mL)
3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h
第1组 2.7×10<sup>7</sup> 2.2×10<sup>8</sup> 5.2×10<sup>8</sup> 2.5×10<sup>9</sup> 7.1×10<sup>7</sup> 6.3×10<sup>5</sup> 0
第2组 2.1×10<sup>7</sup> 3.2×10<sup>8</sup> 8.7×10<sup>8</sup> 1.6×10<sup>9</sup> 2.3×10<sup>9</sup> 2.0×10<sup>9</sup> 5.9×10<sup>8</sup>
第3组 8.1×10<sup>6</sup> 1.2×10<sup>8</sup> 3.2×10<sup>8</sup> 7.9×10<sup>8</sup> 1.7×10<sup>9</sup> 1.0×10<sup>9</sup> 1.0×10<sup>9</sup>
第4组 6.0×10<sup>6</sup> 4.0×10<sup>7</sup> 2.0×10<sup>8</sup> 3.2×10<sup>8</sup> 8.5×10<sup>8</sup> 8.3×10<sup>8</sup> 7.9×10<sup>8</sup>
第5组 2.3×10<sup>7</sup> 2.0×10<sup>8</sup> 7.1×10<sup>8</sup> 1.9×10<sup>9</sup> 1.0×10<sup>9</sup> 1.1×10<sup>8</sup> 0
第6组 2.0×10<sup>7</sup> 4.8×10<sup>6</sup> 0 0 0 0 0
由表1可知，在有氧发酵培养条件下，各组乳酸菌基本是在第15小时达到活菌体数量的峰值。由于有氧发酵培养过程中活性氧的产生并带来显著的毒害作用，未添加氧抑制剂的对照组的活菌体数量在达到峰值后迅速下降，6小时后已几乎检测不到活菌体；添加游动放线菌细胞提取物作为氧抑制剂的第2组的活菌体数量达到峰值6小时后可保持25.6％，添加牛肝细胞提取物作为氧抑制剂的第3组的活菌体数量达到峰值6小时后可保持58.8％，同时添加游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物作为氧抑制剂的第4组的活菌体数量达到峰值6小时后可保持92.9％。由此可见，联合使用游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物氧抑制剂对有氧条件下发酵培养的乳酸菌具有显著的保护作用。
由对照组的数据可知，添加了无机铁离子螯合剂的第5组的活菌体数量达到峰值9小时后已几乎检测不到活菌体；添加了有机铁离子螯合剂的第6组在第9小时已几乎检测不到活菌体。由此可见，在乳酸菌的发酵培养过程中，加入铁离子螯合剂以阻止芬顿反应，对于减少活性氧的毒害方面的作用相对于本发明加入游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物作为氧抑制剂来说，效果较差。
实施例2：
一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，包括如下步骤：
(1)氧抑制剂的制备，同实施例1；
(2)培养基准备，同实施例1；
(3)乳酸菌的高密度培养：
氧抑制剂的添加分为3组，分别在接种嗜酸乳杆菌后用无菌操作方法加入发酵罐中：
第1组无添加氧抑制剂作为无氧发酵培养对照；
第2组添加游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物，两者加入量均为培养基体积的0.2％；
第3组添加游动放线菌细胞提取物和牛肝细胞提取物，两者加入量均为培养基体积的0.2％。
各组发酵过程保持37℃，搅拌100r/m；通气方面，第1组不通气，作为静置培养对照组，第2组和第3组通气量2.0vvm；各组均在发酵至pH下降至6.8后，自动流加体积分数10％的氨水调节pH＝6.8±0.2；此外，第3组在第7h和第9h分别补加1.75g和3.5g葡萄糖。各组均每隔3小时取样测定活菌数，如表2所示。
表2乳酸菌静置发酵培养、有氧分批发酵培养、有氧分批补料培养的活菌数(单位：cfu/mL)
3h 6h 9h 12h 15h 18h
第1组 1.0×10<sup>8</sup> 2.9×10<sup>8</sup> 1.4×10<sup>9</sup> 1.2×10<sup>9</sup> 1.2×10<sup>9</sup> 1.2×10<sup>9</sup>
第2组 1.1×10<sup>8</sup> 3.3×10<sup>8</sup> 2.3×10<sup>9</sup> 1.9×10<sup>9</sup> 1.9×10<sup>9</sup> 1.8×10<sup>9</sup>
第3组 1.1×10<sup>8</sup> 3.3×10<sup>8</sup> 8.3×10<sup>9</sup> 1.2×10<sup>10</sup> 1.2×10<sup>10</sup> 1.1×10<sup>10</sup>
由表2的数据可知，乳酸菌添加氧抑制剂后，有氧分批发酵培养18小时，活菌体数量为1.8×109cfu/mL，是传统无氧发酵培养的1.5倍，第3组采用分批补料培养，培养到第18小时，活菌体数量达到1.1×1010cfu/mL，是传统无氧发酵培养的9.2倍。由此可见，使用0.2％的游动放线菌细胞提取物和0.2％的牛肝细胞提取物作为氧抑制剂，配合有氧分批补料培养，能够显著提高活菌体数，效果相对最好。

Claims (9)

1.一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，将乳酸菌接种到含有氧抑制剂的培养基中，在通入空气的条件下进行分批发酵培养或分批补料发酵培养。
2.根据权利要求1所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述乳酸菌为兼性厌氧乳酸菌，具体为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、德式乳杆菌乳酸亚种、鼠李糖乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、戊糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述的乳酸菌在发酵培养中通入空气的量为0.1vvm-2.0vvm。
4.根据权利要求1所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述在培养基成分中添加的氧抑制剂为游动放线菌细胞提取物和/或牛肝细胞提取物。
5.根据权利要求4所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述的游动放线菌细胞提取物的制备方法为：将游动放线菌接种于常规放线菌液体培养基，于25-30℃、转速为200r/min的摇床中发酵培养7-9天，离心，将菌体沉淀物用上清液体积0.2-0.3倍的乙醇充分悬浮，在超声破碎仪上破碎15-20分钟，离心，收集上清液即为游动放线菌细胞提取物。
6.根据权利要求4所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述的牛肝细胞提取物的制备方法为：新鲜牛肝切碎，加入预冷到2-5℃的2-3倍体积的pH7.0磷酸缓冲液，用组织匀浆机搅碎为匀浆，室温静置4-5小时，离心，收集上清液；沉淀物再用预冷到2-5℃的2-3倍体积的pH7.0磷酸缓冲液重复提取一次，合并两次提取液，用截留分子量为10KD的超滤膜浓缩8-10倍，将浓缩液过滤除菌，即为牛肝细胞提取物。
7.根据权利要求4所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述氧抑制剂的组成如下：乳酸菌发酵培养基体积0.1％-2.0％的游动放线菌细胞提取物和/或乳酸菌发酵培养体积0.1％-2.0％的牛肝细胞提取物。
8.根据权利要求1所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述分批发酵培养是将乳酸菌接种到培养基后，用无菌操作方法加入氧抑制剂，发酵过程通入空气，并保持37℃，搅拌100r/m，发酵至pH下降至6.8后，自动流加体积分数10％的氨水调节pH＝6.8±0.2。
9.根据权利要求1所述一种乳酸菌的有氧高密度培养方法，其特征在于，所述分批补料发酵培养是将乳酸菌接种到培养基后，用无菌操作方法加入氧抑制剂，发酵过程通入空气，并保持37℃，搅拌100r/m，发酵至pH下降至6.8后，自动流加体积分数10％的氨水调节pH＝6.8±0.2；并且在发酵数小时后补充碳源。
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