CN111575337A - 一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，包括步骤（1）称取混合益生菌样品，加入无菌生理盐水，均质；（2）取样品匀液，加入无菌生理盐水，依次递增稀释至适宜稀释度；（3）吸取适宜稀释度的样品匀液于无菌培养皿内,将MRS琼脂培养基倾注入培养皿，混合均匀，35‑37℃有氧培养70‑72h，培养后计数平板上的所有菌落数即得。本发明采用有氧培养乳杆菌的方式，使计数培养基上仅乳杆菌生长，抑制双歧杆菌的生长，去除了双歧杆菌对乳杆菌数检测的干扰，从而能够准确的检测出混合益生菌产品中乳杆菌数，对混合益生菌中乳杆菌活菌数实现有效的检测和控制，此方法可以填补对含有双歧杆菌和乳杆菌的混合益生菌中乳杆菌数检测的空缺。
Description
技术领域
本发明属于保健品技术领域，具体涉及一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法。
背景技术
益生菌具有调节肠道菌群的平衡、抑制肠道致菌的感染、防治肿瘤、降低血清胆固醇水平、促进消化、提高机体免疫功能等健康功效，被广泛地应用于发酵制品和生物制品领域。益生菌数量是产品发挥益生功效的重要条件，在产品的安全性和功能性试验中也常以益生菌数量为评价指标。因此，益生菌数检测对企业质量控制和日常监督至关重要。
GB 4789.35-2010食品安全国家标准《食品微生物学检验乳酸菌检验》中有规定混合益生菌中乳杆菌的检验方法，该检验方法是在通过MRS培养基厌氧36℃±1℃培养48h±2h得到乳酸菌总数，改良MRS培养基厌氧36℃±1℃培养48h±2h得到双歧杆菌（改良MRS培养基为添加莫匹罗星锂盐的MRS培养基），然后用乳酸菌总数减去双歧杆菌计数即得乳杆菌计数。该检验方法存在会检验出负值和结果偏差大的缺陷，无法进行准确的检测。
目前益生菌的检验方法主要按GB 4789.35-2016 食品安全国家标准《食品微生物学检验乳酸菌检验》检验，该检验方法规定了单一乳杆菌的样品采用MRS培养基36℃±1℃厌氧培养72h±2h计数得到，但该检验方法没有规定混合益生菌中乳杆菌的检测和计数方法。
因此，有必要研究一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，以有效检测乳杆菌的数量，保证产品质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，该方法能够有效、准确的检测出混合益生菌产品中乳杆菌数，有利于实现对混合益生菌产品中乳杆菌数进行有效的检测和控制。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，所述混合益生菌产品含有双歧杆菌和乳杆菌，包括以下步骤：
（1）称取混合益生菌样品，加入无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，均质，得到样品匀液；
（2）取样品匀液，加入无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，依次递增稀释至适宜稀释度，得到适宜稀释度的样品匀液；
（3）吸取适宜稀释度的样品匀液于无菌培养皿内,将MRS琼脂培养基倾注入培养皿，混合均匀，35-37℃有氧培养70-72h，培养后计数平板上的所有菌落数即得到乳杆菌数。
优选的，所述步骤（1）的方法具体如下：称取混合益生菌样品25g，加入255mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，均质3-6min，得到样品匀液。
优选的，所述步骤（2）的方法具体如下：取样品匀液1mL，加入9mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，依次10倍递增稀释至适宜稀释度，得到适宜稀释度的样品匀液。
优选的，所述步骤（3）的方法具体如下：选择2-3个连续的适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度样品匀液吸取1mL于无菌培养皿内, 每个稀释度做两个平皿，将冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿至15mL，混合均匀，35-37℃有氧培养70-72h，从样品稀释到平板倾注应在15min内完成，培养后计数平板上的所有菌落数即得到乳杆菌数。
优选的，步骤（1）和（2）中，所述无菌生理盐水的质量浓度为0.85%。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，采用有氧培养乳杆菌的方式，使计数培养基上仅乳杆菌生长，抑制双歧杆菌的生长，去除了双歧杆菌对乳杆菌数检测的干扰，从而能够准确的检测出混合益生菌产品中乳杆菌数，对混合益生菌中乳杆菌活菌数实现有效的检测和控制，此方法可以填补对含有双歧杆菌和乳杆菌的混合益生菌中乳杆菌数检测的空缺。
本发明通过对乳杆菌检测方法进行准确度、精密度、专属性、定量限、线性、耐用性、重现性试验，试验结果均符合《中国药典 》2015版要求，证明乳杆菌有氧培养的检测方法科学有效。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1. 仪器
电子天平、洁净工作台、生化培养箱（36℃±1℃）、压力蒸汽灭菌器、旋涡震荡仪；匀浆仪。
2. 试剂和材料
2.1所用培养基和配套耗材：MRS培养基（北京陆桥）；MRS培养基（广州环凯）；MRS培养基（青岛海博）；无菌生理盐水，0.85%；磷酸盐缓冲液（贮存液：取34.0g磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱；稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于三角瓶中121℃高压灭菌15min）；一次性培养皿（φ90mm）；玻璃培养皿（φ90mm）；厌氧盒、厌氧产生剂、厌氧指示剂（日本三菱）；移液枪（1mL）； 移液枪（10mL）。
2.2样品及工作菌株
德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032 ：3 代菌株；
婴儿双歧杆菌 CICC 6069：3 代菌株；
混合益生菌粉：含有双歧杆菌和乳杆菌。
实验方法
3.1双歧杆菌检验
制备双歧杆菌菌悬液，取婴儿双歧杆菌 CICC 6069 储备菌株，加入 50 mL MRS 肉汤中，经 36℃±1℃厌氧培养 24 小时，菌液浓度约为 108CFU/mL，备用。
取 1mL 工作菌液，加入 9mL 无菌生理盐水中，逐级稀释至每毫升含活菌数在1-100CFU/mL，作为供试液，吸取供试液 1mL 置于4个无菌培养皿中，每个皿倾注15-20mLMRS培养基，摇匀，待凝固后，两个平皿倒置直接放入培养箱中，有氧培养；另外两个平皿倒置装入厌氧盒中，再将厌氧盒放入生化培养箱，36℃±1℃培养 72h±2h，进行菌落计数。
3.2乳杆菌检验
制备乳杆菌菌悬液，取德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032 储备菌株，加入50 mLMRS 肉汤中，经 36℃±1℃厌氧培养 24 小时，菌液浓度约为108CFU/mL，备用。
取 1mL 工作菌液，加入 9mL 无菌生理盐水中，逐级稀释至每毫升含活菌数约1-100CFU/mL，作为供试液，吸取供试液 1mL 置于 4个无菌培养皿中，每个皿注入15-20mLMRS培养基，摇匀，待凝固后，两个平皿倒置直接放入培养箱中，有氧培养；另外两个平皿倒置装入厌氧盒中，再将厌氧盒放入生化培养箱，36℃±1℃培养 72h±2h，进行菌落计数。
4. 方法学验证
4.2空白实验
4.2.1实验方法：使用稀释液0.85%无菌生理盐水和磷酸盐缓冲液，做空白实验；
4.2.3实验结论：空白实验结果无菌生长，说明稀释液及实验操作过程没有杂菌干扰，实验结果准确有效。
4.3 专属性试验
4.3.1试验方法 分别取6份婴儿双歧杆菌 CICC 6069工作菌液和德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 032工作菌液，分别按3.1和3.2的方法检测、培养及结果计数。
4.3.2 试验结果如下表1所示：
表1 专属性实验结果
4.3.3 结论：从表中可以看出，德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032在有氧培养基和厌氧培养上都生长良好，婴儿双歧杆菌 CICC 6069在有氧条件下无菌落生长，在厌氧培养的条件下生长良好，说明使用有氧条件培养乳杆菌的检测方法适合乳杆菌的检测，抑制了双歧杆菌的生长，此有氧培养乳杆菌的检测方法对乳杆菌具有良好的专属性。
4.4准确度试验
4.4.1试验方法 取10份德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032工作菌液，分别按0.5mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL 5个取样量，按3.2的方法检测乳杆菌含菌量，相当于50%，80%，100%，120%，150%的含菌量进行回收实验，试验组为有氧培养，对照组为厌氧培养，通过试验组和对照组的平均菌落数比值，来计算实验的回收率。
其中，试验组、对照组菌落数为两个平行板平均值。
回收率计算方法：回收率=试验组/对照组×100%。
4.4.2 试验结论
经实验，通过试验组和对照组的平均菌落数比值来计算实验的回收率，乳杆菌平均回收率为92.3%，且单个结果均符合《中国药典 》2015版，回收率不低于70%的要求，因此，乳杆菌回收率实验符合规定。
4.5精密度试验
4.5.1 试验方法 取10份德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032工作菌液，分别按0.5mL、0.8mL、 1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL 5个取样量，按3.2的方法检测乳杆菌含菌量，试验组为有氧培养，对照组为厌氧培养，同时进行试验组和对照组相对标准偏差RSD(%)的结果计算。
4.5.2 试验结论
经实验，10份菌液5个菌浓度平均菌落数，乳杆菌试验组与对照组的RSD均小于<15%，符合《中国药典》2015版 第四部要求的精密度(RSD<15%)，实验数据稳定，表明该实验方法有较好的精密度。
4.6 定量限
4.6.1 试验方法 取5个底限含菌浓度的德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032工作菌液，每个菌液分别取1 mL、2 mL、 3 mL、4 mL、5 mL 5个取样量，按3.2的方法检测乳杆菌含菌量, 试验组为有氧培养，对照组为厌氧培养，并且计算其RSD(%)。
4.6.2 试验结论
经实验，5份底限含菌浓度的菌液，5份菌液的底限含菌浓度在小于10 CFU以内，5个菌浓度菌落平均值均在1-300CFU，乳杆菌试验组与对照组的RSD均小于<15%，符合《中国药典》2015版 第四部要求的精密度(RSD<15%)，实验数据稳定，表明该实验方法的定量限较好。
4.7 线性
4.7.1试验方法 取5份德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032工作菌液，分别按1 mL、2mL、3 mL、4 mL、5 mL 5个菌浓度检测，按3.2的方法检测乳杆菌含菌量，试验组为有氧培养，对照组为厌氧培养，根据以上实验数据，以菌液体积为横坐标，以试验组和对照组中菌落平均数为纵坐标进行线性回归分析，计算相关系数r 。试验组的相关系数不得低于0.95。
4.7.2试验结论
经实验，以菌液体积为横坐标，以试验组中菌落平均数为纵坐标进行线性回归分析，计算相关系数r。试验组的相关系数都大于0.95。符合《中国药典 》2015版，替代方法的相关系数不得低于0.95的要求，因此，表明该实验方法有较好的线性关系。
4.8 重现性
4.8.1试验方法 制备相同的德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032工作菌液，分别由两名实验员按不同时间、不同稀释液（磷酸盐缓冲液和无菌生理盐水）、相同稀释液不同培养基（陆桥、海博、环凯），按3.2的方法检测乳杆菌含菌量，试验组为有氧培养，对照组为厌氧培养，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD%)来评价两种方法的重现性差异。
4.8.2试验结论
经实验，对不同人员不同培养基相同菌液重复3次试验结果和不同稀释液相同菌液重复6次试验结果进行统计分析，以相对标准偏差RSD 来评价两种方法的重现性差异，乳杆菌试验组与对照组的RSD均小于<15%，符合《中国药典》2015版 第四部精密度(RSD<15%)的要求，实验数据稳定，表明该实验方法有较好的重现性。
4.9 耐受性
4.9.1试验方法 制备同一份德氏乳杆菌保加利亚亚种 CICC 6032工作菌液，国标要求15min内完成，试验通过改变检验完成时间来检测耐受性试验，试验分别按15min、30 min、45min三个完成时间来检测，每个时间做三次平行试验，按3.2的方法检测乳杆菌含菌量，试验组为有氧培养，对照组为厌氧培养，对检验结果进行统计分析，以相对标准偏差（RSD)来评价两种方法在不同时间内完成对检验结果的影响。
4.9.2试验结论
经实验，在不同时间内完成检验，乳杆菌试验组与对照组的RSD均小于<15%，符合《中国药典》2015版 第四部要求的精密度(RSD<15%)，实验数据稳定，表明该实验方法有较好的耐受性。
综上，本发明通过对乳杆菌检测方法进行准确度、精密度、专属性、定量限、线性、耐用性、重现性试验，每个验证试验都用厌氧培养做对照组，结果表明有氧培养乳杆菌可以达到和厌氧培养一样的效果，试验结果均符合《中国药典 》2015版要求，证明乳杆菌有氧培养的检测方法科学有效。
实施例1：
取24批混合益生菌样品（含有双歧杆菌和乳杆菌），每批样品称取25g混合益生菌粉置于匀浆杯或500mL离心管+玻璃珠中，准确加入225mL无菌生理盐水，均质5min，取1mL样品匀液，加入9mL无菌生理盐水中，做10倍递增稀释，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个平皿，稀释液移入平皿后，将冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀，36℃±1℃有氧培养72h±2h，培养后计数平板上的所有菌落数即得到乳杆菌，从样品稀释到平板倾注应在15min内完成，测试结果如表2所示。
对比例1：
对比例1参考国标方法进行乳杆菌检验、计数，国标方法主要参考GB 4789.35-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》的方法进行计数。
取24批混合益生菌样品（含有双歧杆菌和乳杆菌），每批样品称取25g混合益生菌粉置于匀浆杯或500mL离心管+玻璃珠中，准确加入225mL无菌生理盐水，均质5min，取1mL样品匀液，加入9mL无菌生理盐水中，做10倍递增稀释，选择2个~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个平皿，稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注入平皿约15mL,转动平皿使混合均匀，36 ℃±1 ℃厌氧培养72h±2h,培养后计数平板上的所有菌落数即得到双歧杆菌；将冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀，36℃±1℃厌氧培养72h±2h，培养后计数平板上的所有菌落数即得到乳酸菌总数；乳酸菌总数减去双歧杆菌计数即得乳杆菌计数。结果如表2所示：
表2 实施例与对比例的结果比较
由以上实验数据可以看出，在不同批次样品完成的乳杆菌检测，对比例1参考GB4789.35-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》的方法对乳杆菌计数，乳杆菌结果偏差大，有4批为负值和3批为0，检验RSD达到119.0 %，这与产品设计不相符；实施例1按本发明有氧培养计数乳杆菌的检验结果，检测结果值在1.0×109-1.7×109CFU/g，RSD达到13.9 %，RSD小于<15%，批次间检验偏差小，检测结果比较接近，检测结果更准确。表明按MRS有氧培养乳杆菌的检验方法对混合益生菌中乳杆菌活菌数检测起到质量控制的目的。
Claims (5)
1.一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，所述混合益生菌产品含有双歧杆菌和乳杆菌，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取混合益生菌样品，加入无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，均质，得到样品匀液；
（2）取样品匀液，加入无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，依次递增稀释至适宜稀释度，得到适宜稀释度的样品匀液；
（3）吸取适宜稀释度的样品匀液于无菌培养皿内，将MRS琼脂培养基倾注入培养皿，混合均匀，35-37℃有氧培养70-72h，培养后计数平板上的所有菌落数即得到乳杆菌数。
2.根据权利要求1所述的一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，其特征在于，所述步骤（1）的方法具体如下：
称取混合益生菌样品25g，加入255mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，均质3-6min，得到样品匀液。
3.根据权利要求1所述的一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，其特征在于，所述步骤（2）的方法具体如下：
取样品匀液1mL，加入9mL无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液，依次10倍递增稀释至适宜稀释度，得到适宜稀释度的样品匀液。
4.根据权利要求1所述的一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，其特征在于，所述步骤（3）的方法具体如下：
选择2-3个连续的适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度样品匀液吸取1mL于无菌培养皿内, 每个稀释度做两个平皿，将冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿至15-20mL，混合均匀，35-37℃有氧培养70-72h，从样品稀释到平板倾注应在15min内完成，培养后计数平板上的所有菌落数即得到乳杆菌数。
5.根据权利要求1所述的一种检测混合益生菌产品中乳杆菌数的方法，其特征在于，步骤（1）和（2）中，所述无菌生理盐水的质量浓度为0.85%。
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