CN110643673B - 一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法 - Google Patents

一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，包括如下步骤：1)取饲用复合微生态产品至无菌生理盐水中制成初始菌悬液，将初始菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；2)分别取三个稀释度的菌液于80℃水浴处理10min，冷却至室温待用；3)取步骤2)中的菌液涂布于pH＝5.0～5.5的MRS改良培养基平皿上，倒置于45～50℃培养箱内培养24～48h后对凝结芽孢杆菌芽孢计数。本发明利用芽孢杆菌类耐高温的特性，经高温条件处理减少乳酸菌类、酵母菌类、曲霉菌类等的干扰；再经过分析六种芽孢杆菌类的生长特性，筛选不同的培养条件进行区分芽孢杆菌类产品，从而实现对复合微生态产品中单一凝结芽孢杆菌芽孢的计数，操作简单、快速，计数准确性高。

Description

一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法。
背景技术
微生态产品已经广泛应用于饲料行业，现有饲料添加剂中包含34种微生态产品，包括芽孢杆菌属6种(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌)，肠球菌属3种(粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌)，双歧杆菌属6种(两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、动物双歧杆菌)，乳杆菌属10种(布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、德式乳杆菌乳酸亚种、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种)，片球菌属2种(乳酸片球菌、戊糖片球菌)，链球菌属1种(嗜热链球菌)，曲霉属2种(黑曲霉、米曲霉)，酵母菌2种(产朊假丝酵母、酿酒酵母)，丙酸杆菌属1种(产丙酸丙酸杆菌)，红假单胞菌属1种(沼泽红假单胞菌)；各类产品在动物体内发挥着不同的作用，因此市场上微生态产品多为复合产品。
然而，各种微生物生长特性存在不同的差异，相互间还存在检测干扰，现行的饲料中细菌总数的计数方法，仅仅能计算出细菌总数，并且通常存在较大的检测误差；若要分别对不同属的菌种进行计数，则需要结合生化检测，费时费力，并且复合产品中各单一产品的检测技术十分缺乏，目前无国标行标或团标可参考。
发明内容
本发明的目的是克服现有复合微生态产品中单一产品检测误差大。费时费力的问题。
为此，本发明提供了一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，包括如下步骤：
1)样品处理
取饲用复合微生态产品无菌生理盐水中制成初始菌悬液，将初始菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；
2)高温处理
分别取三个稀释度的菌液于80℃水浴处理10min，冷却至室温待用；
3)培养
取步骤2)中的菌液涂布于pH＝5.0～5.5的MRS改良培养基平皿上，倒置于45～50℃培养箱内培养24～48h后对凝结芽孢杆菌芽孢计数；
所述MRS改良培养基包括按质量百分比计的如下组分：酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨1％、牛肉膏粉1％、葡萄糖2％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.3％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.005％、吐温800.1％、琼脂粉2％，余量为水。
进一步的，所述无菌生理盐水为8.5g氯化钠溶于1000ml水中，并于121℃灭菌30min得到。
进一步的，所述步骤1)中饲用复合微生态产品的质量与无菌生理盐水的体积之比为1:9。
进一步的，所述MRS改良培养基于115℃灭菌30min。
进一步的，所述步骤3)中，选取肉眼观察到的平均菌落数在30～300个范围内的MRS改良培养基平皿，且同一梯度平行测定值相对误差不超过10％，作为菌落总数测定的范围对凝结芽孢杆菌芽孢计数。
进一步的，所述步骤3)中，对凝结芽孢杆菌芽孢计数方式如下：
当只有一个稀释度的平均菌落数在30～300个范围时，则凝结芽孢杆菌芽孢计数以该稀释度的MRS改良培养基平皿菌落数乘其稀释倍数；
当有两个稀释度的平均菌落数均在30～300个范围时，则求出两者菌落总数之比值，若其比值小于或等于2，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为两者菌落平均数，若其比值大于2，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为其中较小的菌落数。
进一步的，所述步骤3)中，MRS改良培养基平皿上平均菌落数不在30～300个范围内，对凝结芽孢杆菌芽孢计数方式如下：
当所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；
当所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数；
当所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数；
当所有稀释度均无菌生长，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为每克或每毫升小于10个。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供的这种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法利用芽孢杆菌类耐高温的特性，经高温条件处理减少乳酸菌类、酵母菌类、曲霉菌类等的干扰；再经过分析六种芽孢杆菌类的生长特性，筛选不同的培养条件进行区分芽孢杆菌类产品，从而实现对复合微生态产品中单一凝结芽孢杆菌芽孢的计数，操作简单、快速，且计数准确性高。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供了一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，包括如下步骤：
(1)样品处理
取饲用复合微生态产品无菌生理盐水中制成初始菌悬液，饲用复合微生态产品的质量与无菌生理盐水的体积之比为1:9，将初始菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；其中，无菌生理盐水为8.5g氯化钠溶于1000ml水中，并于121℃灭菌30min得到。
具体的实施方式，对于固态样品，样品处理过程如下：a、准确称取固态样品10.00±0.01g，加入已灭菌烘干的500mL三角瓶(装有30粒玻璃珠)；b、用100mL已灭菌量筒准确量取90.0mL0.85％无菌生理盐水，倒入三角瓶中，将三角瓶置于摇床中，150rpm，室温振荡30min，使菌粉与水混合均匀，制成10-1的初始菌悬液；c、用装有无菌枪头的1000μL移液器，准确吸取0.500mL10-1稀释液，用纸巾擦拭枪头外壁上的菌液，置于装有4.500mL无菌生理盐水的离心管中，枪头不能触碰离心管内壁和离心管中的液体，最后一滴菌液需靠壁，在振荡器上混匀，即成10-2稀释液；d、更换一支无菌枪头，用移液器准确吸取0.500mL10-2稀释液置于装有4.500mL无菌生理盐水的离心管中，更换纸巾擦拭枪头外壁上的菌液，枪头不能触碰离心管内壁和离心管中的液体，最后一滴菌液需靠壁，在振荡器上混匀，即成10-3稀释液；e、以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7等一系列稀释菌液；f、用于平板计数时，待测菌稀释度的选择根据样品确定，样品中所含的待测菌的数量越多，稀释度越高，反之则低。
对于液态样品，样品处理过程如下：a、用装有无菌枪头的1000μL移液器，准确吸取0.500mL菌液，用纸巾擦拭枪头外壁上的菌液，置于装有4.500mL无菌生理盐水的离心管中，枪头不能触碰离心管内壁和离心管中的液体，最后一滴菌液需靠壁，在振荡器上混匀，即成10-1稀释液；b、更换一支无菌枪头，用移液器准确吸取0.500mL10-1稀释液，更换纸巾擦拭枪头外壁上的菌液，置于装有4.500mL无菌生理盐水的离心管中，枪头不能触碰离心管内壁和离心管中的液体，最后一滴菌液需靠壁，在振荡器上混匀，即成10-2稀释液；c、以此类推，连续稀释，制成10-3、10-4、10-5等一系列稀释菌液；d、用于平板计数时，待测菌稀释度的选择根据样品确定，样品中所含的待测菌的数量越多，稀释度越高，反之则低。
(2)高温处理
根据样品含菌数，选取适合涂布三个稀释度的菌液于80℃水浴处理10min，冷却至室温待用。
34种复合微生态产品经过80℃水浴处理10min后乳酸菌类、酵母菌类、曲霉菌类、丙酸杆菌类、红假单胞菌类已失活，此条件处理后只需对6种芽孢杆菌(地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌)进行检测即可。
(3)培养
取步骤(2)中的菌液涂布于pH＝5.0～5.5的MRS改良培养基平皿上，倒置于45～50℃培养箱内培养24～48h后对凝结芽孢杆菌芽孢计数；所述MRS改良培养基包括按质量百分比计的如下组分：酵母浸粉0.5％、胰蛋白胨1％、牛肉膏粉1％、葡萄糖2％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.3％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.01％、硫酸锰0.005％、吐温800.1％、琼脂粉2％，余量为水；pH调至5.0～5.5，并于115℃灭菌30min。
具体的实施方式，首先，在超净工作台中，将固体MRS改良培养基熔化后以贴耳不烫为准，倒入无菌平皿中，每个平皿中大约倒15mL，倒完后平放在超净工作台台面上，待凝固后编号，收起；然后，在酒精无菌区域前，用装有无菌枪头的200μL移液器，准确吸取0.100mL稀释菌液，对号接种在不同稀释度编号的MRS改良培养基平皿上(每个样品设置3个稀释梯度，每个稀释梯度设3个平行)；再用无菌刮铲将菌液在固体培养基上涂抹均匀，每个稀释度用一个无菌刮铲(3个平行)；最后，将MRS改良培养基平皿倒置培养在45～50℃恒温培养箱中，培养24～48h计数。
对于MRS改良培养基平皿上菌落计数及报告结果如表1所示，具体过程如下：
首先选取平均菌落数在30～300个之间的平皿，同一梯度平行测定值相对误差不超过10％，作为菌落总数测定的范围。
当只有一个稀释度的平均菌落数在30～300个范围时，则凝结芽孢杆菌芽孢计数以该稀释度的MRS改良培养基平皿菌落数乘其稀释倍数，如表1中例1。
当有两个稀释度的平均菌落数均在30～300个范围时，则求出两者菌落总数之比值，若其比值小于或等于2，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为两者菌落平均数，若其比值大于2，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为其中较小的菌落数，如表1中例2和例3。
当所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数，如表1中例4。
当所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数，如表1中例5。
当所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数，如表1中例7。
当所有稀释度均无菌生长，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为每克或每毫升小于10个，如表1中例6。
菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表1报告方式栏)，在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
表1：平皿菌落计数及报告
按上述计数规则，具体计算通过下式，即为1mL或1g样品中的凝结芽孢杆菌芽孢数：
式中：N---样品中凝结芽孢杆菌活菌芽孢数，单位为cfu；
C---几个有效平板的平均有效活菌菌落数，单位为cfu；
m---样品的称样量，单位为克，g；
0.1---接种体积，单位为毫升，mL；
n---稀释倍数(称样量为10g时稀释倍数为稀释梯度的10倍，称样量为1g或液体样品时稀释倍数即为稀释梯度)。
实施例2：
本实施例考察不同培养条件对6种芽孢杆菌(即地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌)生长的影响。选用市场上标识1000亿地衣芽孢杆菌、2000亿枯草芽孢杆菌、200亿凝结芽孢杆菌、100亿侧孢芽孢杆菌、100亿短小芽孢杆菌、50亿迟缓芽孢杆菌单菌，分别在NA培养基、YPD培养基、pH＝5.0～5.5的MRS改良培养基及pH5.5的MRS加富培养基上培养，其结果如表2所示。
表2：单一微生态产品在不同培养条件下培养结果
注：表中“/”表示未进行此实验。
由表2可知，6种芽孢杆菌在NA培养基及YPD培养条件下均生长良好，但在pH＝5.0～5.5的MRS改良培养基上生长差异非常大，除了凝结芽孢杆菌，其他5种菌均不生长，因此，经MRS改良培养基培养后的菌种即为凝结芽孢杆菌芽孢。
选取以上6种芽孢杆菌产品按不同比例进行复配，复配3个样品中凝结芽孢杆菌占比如表3所示；采用pH＝5.0～5.5的MRS改良培养基，50℃培养48h，检测结果如表4所示。
表3：复合微生态产品组成
表4：复合微生态产品中凝结芽孢杆菌的检测结果
由表4可知，3种不同复合产品中凝结芽孢杆菌均检测正常，与单菌检测结果的相对误差均在12.0％以内，由此可知，该培养条件适合检测复合微生态产品中凝结芽孢杆菌。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样品处理
取饲用复合微生态产品至无菌生理盐水中制成初始菌悬液，将初始菌悬液用无菌生理盐水依次进行10倍梯度稀释；
2)高温处理
分别取三个稀释度的菌液于80℃水浴处理10min，冷却至室温待用；
3)培养
取步骤2)中的菌液涂布于pH=5.0～5.5的MRS改良培养基平皿上，倒置于50℃培养箱内培养24～48h后对凝结芽孢杆菌芽孢计数；
所述MRS改良培养基包括按质量百分比计的如下组分：酵母浸粉0.5%、胰蛋白胨1%、牛肉膏粉1%、葡萄糖2%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.3%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.01%、硫酸锰0.005%、吐温80 0.1%、琼脂粉2%，余量为水。
2.如权利要求1所述的饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，所述无菌生理盐水为8.5g氯化钠溶于1000ml水中，并于121℃灭菌30min得到。
3.如权利要求1所述的饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，所述步骤1)中饲用复合微生态产品的质量与无菌生理盐水的体积之比为1:9。
4.如权利要求1所述的饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，所述MRS改良培养基于115℃灭菌30min。
5.如权利要求1所述的饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，所述步骤3)中，选取肉眼观察到的平均菌落数在30～300个范围内的MRS改良培养基平皿，且同一梯度平行测定值相对误差不超过10%，作为菌落总数测定的范围对凝结芽孢杆菌芽孢计数。
6.如权利要求5所述的饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，所述步骤3)中，对凝结芽孢杆菌芽孢计数方式如下：
当只有一个稀释度的平均菌落数在30～300个范围时，则凝结芽孢杆菌芽孢计数以该稀释度的MRS改良培养基平皿菌落数乘其稀释倍数；
当有两个稀释度的平均菌落数均在30～300个范围时，则求出两者菌落总数之比值，若其比值小于或等于2，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为两者菌落平均数，若其比值大于2，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为其中较小的菌落数。
7.如权利要求1所述的饲用复合微生态产品中凝结芽孢杆菌芽孢的计数方法，其特征在于，所述步骤3)中，MRS改良培养基平皿上平均菌落数不在30～300个范围内，对凝结芽孢杆菌芽孢计数方式如下：
当所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；
当所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数；
当所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数；
当所有稀释度均无菌生长，则凝结芽孢杆菌芽孢计数为每克或每毫升小于10个。
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