CN113736689A - 一种凝结芽孢杆菌培养基及培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种凝结芽孢杆菌培养基及培育方法，每1000ml培养基包括如下组分：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、牛肉膏5g、无水氯化钙0.15g，一水合硫酸锰0.1g，氯化钠2.5g，L‑半胱氨酸盐酸盐0.5g，番茄粉0.5g，琼脂粉25g，调节pH至5.2，121℃灭菌30min，培养基灭菌后倒入平板，凝固后包好放入培养箱37℃保存，利用培养基对凝结芽孢杆菌进行培育，结果显示，上述培养基适合凝结芽孢杆菌的生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物培育技术领域，尤其涉及一种凝结芽孢杆菌培养基及培育方法。
背景技术
微生态制剂，也称为微生态调节剂，是根据微生态学原理，利用对宿主有益的正常微生物及其代谢产物和促生长物质所制成的制剂，通过抗菌、黏附定植及生物屏障等作用调整和保持微生态平衡，改善宿主的健康状态。微生态制剂的生理功能主要有：免疫调节作用、抗菌作用、营养作用、抗肿瘤作用、降血脂作用等等。微生态制剂包括益生菌、益生元和合生元。目前，临床所用的微生态制剂大多为益生菌制剂。临床常用的益生菌有乳酸杆菌、酪酸梭菌(丁酸梭菌)、婴儿双歧杆菌、屎肠球菌、粪链球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌等菌株。近年来，微生态制剂受到日益广泛的关注，在农业、饲料、食品和医药保健等领域都发挥着重要作用。
凝结芽孢杆菌是一类不仅可以产乳酸，而且可以形成芽孢的菌株，其具有抗逆性强，能耐高温，便于饲料生产加工中添加与应用的特点，然而与常用的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌相比，凝结芽孢杆菌的高密度发酵扩培与芽孢生成技术都比较困难，使得凝结芽孢杆菌培养后发酵液活菌数与芽孢率都比较低，最终导致凝结芽孢杆菌活菌制剂价格居高不下，未能得到很好的推广与应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝结芽孢杆菌培养基及培育方法，解决现有培养基对凝结芽孢杆菌培养效果差，无法大规模形成菌落，繁殖率低的问题。
一种凝结芽孢杆菌培养基，每1000ml培养基包括如下组分：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、牛肉膏5g、无水氯化钙0.15g，一水合硫酸锰 0.1g，氯化钠2.5g，L- 半胱氨酸盐酸盐0.5g，番茄粉0.5g，琼脂粉25g，调节pH至5.2，121℃灭菌30min，培养基灭菌后倒入平板，凝固后包好放入培养箱37℃保存。
一种凝结芽孢杆菌培养基培育方法，其特征在于包括以下步骤：
1）、精确称量1.000g凝结芽孢杆菌，称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使用；
2）、将样品在无菌操作条件下，加入装有100ml稀释液的三角瓶中，摇床220rpm振荡30min，做成10-2菌悬液；
3）、在无菌操作条件下将10-2菌悬液用移液器取1ml到装有50ml pH值测定培养基的三角瓶中；
4）、选取10-7菌悬液，吸取100微升培养基中，用涂布器涂开，涂布时需旋转平板角度3次，需要涂干，涂布3个平板，一个平板使用一个涂布器，将平板放入40oC培养箱中倒置培养45h，观察菌株的生长情况。
5）、将平板放入40oC培养箱中倒置培养20h，观察菌株的生长情况。
作为本发明的进一步改进，所述步骤3）中移液器吸取样品前要润洗枪头3次以上，加入样品后不冲洗枪头，样品接种3个重复。
作为本发明的进一步改进，所述步骤2）中稀释液为0.9%氯化钠和1‰的吐温80水溶液；
配制完成后，分装100ml稀释液至装有50g玻璃珠的250ml三角瓶中、分装9ml稀释液至18×180（15×150）的试管中，121℃灭菌30min。
有益效果：
本发明提供的培养基上凝结芽孢杆菌菌落较大而且数量最多，常用的细菌培养基如：NA、LB培养基的培养效果则不理想。
附图说明
图1是凝结芽孢杆菌菌剂在NA培养基的生长情况；
图2是凝结芽孢杆菌菌剂在LB培养基的生长情况；
图3是凝结芽孢杆菌菌剂在MRS培养基的生长情况；
图4是凝结芽孢杆菌菌剂在本申请培养基培养基的生长情况；
图5是凝结芽孢杆菌菌剂在NA+G培养基的生长情况；
图6是凝结芽孢杆菌菌剂在LB+G培养基的生长情况；
图7是凝结芽孢杆菌菌株在NA培养基的生长情况；
图8是凝结芽孢杆菌菌株在LB培养基的生长情况；
图9是凝结芽孢杆菌菌株在MRS培养基的生长情况；
图10是凝结芽孢杆菌菌株在本申请培养基培养基的生长情况；
图11是凝结芽孢杆菌菌株在NA+G培养基的生长情况；
图12是凝结芽孢杆菌菌株在LB+G培养基的生长情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、实验材料
1.1菌株
100亿凝结芽孢杆菌菌剂、凝结芽孢杆菌纯菌株
1.2稀释液
稀释液是用于稀释样品的溶液，本检测方法的稀释液为0.9%氯化钠和1‰的吐温80水溶液。配制完成后，分装100ml稀释液至装有50g玻璃珠的250ml三角瓶中、分装9ml稀释液至18×180（15×150）的试管中，121℃灭菌30min。
1.3培养基（每1000ml培养基含有）
NA培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏3g、氯化钠5g，琼脂15g，调节pH至7.3±0.1，121℃灭菌30min。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g、氯化钠10g，琼脂15g，调节pH至7.2，121℃灭菌30min。
MRS培养基：购自招远拓普生物（M1502B），使用时称取64.3g于1L蒸馏水或去离子水中加热至完全溶解，分装，121℃灭菌15min。
MRS改良培养基：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖5g（无需分开灭菌）、牛肉膏5g、无水氯化钙0.15g、一水合硫酸锰 0.1g、氯化钠2.5g、L- 半胱氨酸盐酸盐0.5g、番茄粉0.5g、琼脂粉25g。调节pH至5.2，121℃灭菌30min。
NA+G培养基：胰蛋白胨10g，牛肉膏3g、氯化钠5g，葡萄糖5g，琼脂15g，调节pH至7.3±0.1，121℃灭菌30min。
LB+G培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g、氯化钠10g，葡萄糖5g，琼脂15g，调节pH至7.2，121℃灭菌30min。
上述培养基灭菌后倒平板，凝固后包好放入培养箱37℃过夜培养，使用时筛除杂菌污染的平板。
2、实验方法
2.1凝结芽孢杆菌菌剂在不同培养基上的生长情况
（1）精确称量1.000g待测样品，注意称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使用。
（2）将样品在无菌操作条件下，加入装有100ml稀释液的三角瓶中，摇床220rpm振荡30min，做成10-2菌悬液。
（3）在无菌操作条件下将10-2菌悬液用移液器取1ml到装有50ml pH值测定培养基的三角瓶中。注意移液器吸取样品前要润洗枪头3次以上，加入样品后不冲洗枪头，样品接种3个重复，未接种的培养基作为空白。
（4）选取10-7菌悬液，吸取100微升至上述6种平板中，用涂布器涂开，涂布时需旋转平板角度3次，需要涂干，每种培养基涂布3个平板，一个平板使用一个涂布器。
（5）将平板放入40oC培养箱中倒置培养45h，观察菌株的生长情况。
2.2凝结芽孢杆菌菌株在不同培养基上的生长情况
（1）挑取活化后的凝结芽孢杆菌单菌落在上述6种培养基上进行四区划线法纯化。
（2）将平板放入40oC培养箱中倒置培养20h，观察菌株的生长情况。
实验结论：
1.图1-6可以看出，同一凝结芽孢杆菌菌剂在6种培养基上菌落大小和菌落数量差异较大，其中菌剂在MRS改良培养基上菌落较大和数量最多，常用的细菌培养基如：NA、LB培养基的培养效果则不理想。此外，凝结芽孢杆菌菌剂在额外添加葡萄糖的NA、LB培养基上的效果比未添加效果好，这可能与葡萄糖是微生物可利用的直接碳源。
2.从图7-12可以看出，凝结芽孢杆菌纯菌株在6种培养基上的培养情况和菌剂的培养情况基本一致。
3.从两组实验结果可以发现，无论是凝结芽孢杆菌芽孢还是营养体，都不适合用常规的芽孢杆菌培养基（NA、LB）培养，所以在检测和培养凝结芽孢杆菌时不能直接套用现有的芽孢杆菌检测标准中的培养基。另外，由于凝结芽孢杆菌产乳酸，也经常会出现用MRS培养基直接进行培养的情况，但是从以上结果来看， MRS的培养基的效果没有MRS改良培养基好，所以MRS改良培养基比MRS培养基更适合作为凝结芽孢杆菌的最是培养基。
其次：本发明公开实施例附图中，只涉及到与本公开实施例涉及到的结构，其他结构可参考通常设计，在不冲突情况下，本发明同一实施例及不同实施例可以相互组合；
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种凝结芽孢杆菌培养基，每1000ml培养基包括如下组分：胰蛋白胨10g、酵母膏5g、葡萄糖5g、牛肉膏5g、无水氯化钙0.15g，一水合硫酸锰 0.1g，氯化钠2.5g，L- 半胱氨酸盐酸盐0.5g，番茄粉0.5g，琼脂粉25g，调节pH至5.2，121℃灭菌30min，培养基灭菌后倒入平板，凝固后包好放入培养箱37℃保存。
2.一种凝结芽孢杆菌培养基培育方法，其特征在于包括以下步骤：
1）、精确称量1.000g凝结芽孢杆菌，称量时应该将称量勺过酒精灯火焰灭菌，称量纸不重复使用；
2）、将样品在无菌操作条件下，加入装有100ml稀释液的三角瓶中，摇床220rpm振荡30min，做成10-2菌悬液；
3）、在无菌操作条件下将10-2菌悬液用移液器取1ml到装有50ml pH值测定培养基的三角瓶中；
4）、选取10-7菌悬液，吸取100微升培养基中，用涂布器涂开，涂布时需旋转平板角度3次，需要涂干，涂布3个平板，一个平板使用一个涂布器，将平板放入40oC培养箱中倒置培养45h，观察菌株的生长情况。
5）、将平板放入40oC培养箱中倒置培养20h，观察菌株的生长情况。
3.根据权利要求2所述的一种凝结芽孢杆菌培养基培育方法，步骤3）中移液器吸取样品前要润洗枪头3次以上，加入样品后不冲洗枪头，样品接种3个重复。
4.根据权利要求2所述的一种凝结芽孢杆菌培养基培育方法，步骤2）中稀释液为0.9%氯化钠和1‰的吐温80水溶液；配制完成后，分装100ml稀释液至装有50g玻璃珠的250ml三角瓶中、分装9ml稀释液至18×180（15×150）的试管中，121℃灭菌30min。
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|---|---|---|---|---|
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2021
- 2021-08-02 CN CN202110878760.2A patent/CN113736689A/zh active Pending
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