CN104974966B - 一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法 - Google Patents

一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法 Download PDF

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Abstract

一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ZS‑007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015273；采用液体发酵工艺，发酵液中凝结芽孢杆菌活菌数1.52×1010cfu/mL以上、芽孢数1.38×1010cfu/mL以上、芽孢率90.8％以上。喷雾干燥获得的干菌粉中，活菌数8.0×1011cfu/g以上；干菌粉可与淀粉、葡萄糖等填充剂混合后得到凝结芽孢杆菌微生态制剂。本发明凝结芽孢杆菌具有高密度发酵和高菌体含量的特点，有利于降低产品成本，有助于产品市场推广，对于促进畜禽健康养殖具有积极意义。

Description

一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及制备得到的干菌粉。
背景技术
微生态制剂是经特殊工艺制成的微生物菌剂，含有对宿主有益的微生物。微生态制剂具有天然无毒、促进宿主健康的作用，在人体保健、动物健康领域应用日益广泛。
乳酸菌类和芽孢杆菌类微生态制剂是饲料工业使用最为广泛的两大品种。乳酸菌类主要包括乳酸菌、双歧杆菌等，芽孢杆菌类主要包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。
乳酸菌类微生态制剂通过产乳酸、改变肠道pH、调理肠道微环境发挥作用。此类微生态制剂抗逆性差，在加工过程中易失去活性。芽孢杆菌类微生态制剂能产生芽孢，可耐受高温、胃酸、胆碱等不良环境，抗逆性强，但其不具备乳酸菌类的肠道调理功能。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，革兰阳性菌，是一种产乳酸的芽孢杆菌。凝结芽孢杆菌特点在于：1，肠道厌氧环境下产乳酸，形成酸性环境，抑制病原微生物生长，有益于宿主健康；2，能以芽孢状态存在，耐高温、耐胃酸、耐胆碱、环境抗逆性强。可以说，凝结芽孢杆菌兼具乳酸菌类和芽孢杆菌类微生态制剂的优点。
由于良好的饲喂效果和加工性能，凝结芽孢杆菌已列入饲料添加剂名录，成为饲料微生态制剂行业的重要成员。
人们对凝结芽孢杆菌的关注日益增多，开展了大量研究工作。ZL200710122111.X公布了一种凝结芽孢杆菌饲料添加剂的制备，发酵液活菌数最高5.0×109cfu/mL。ZL200810235512.0公布了凝结芽胞杆菌CGMCC No.2602的液态发酵工艺。1T发酵罐中，发酵液总菌数6.0×109cfu/mL、芽孢数5.8×109cfu/mL、芽孢率96.7％。ZL 201110428027.7公布了一种凝结芽孢杆菌CICC No.20138的固态发酵工艺，菌体量1.16×1010cfu/g、芽孢率77.2％。ZL 201210464404.7公布了凝结芽胞杆菌CGMCC No.6681的反馈补料培养工艺，发酵液活菌数最高5.8×109cfu/mL。
尽管业界开展了大量研究工作，但市场上凝结芽孢杆菌的售价依然居高不下，产品推广有一定难度。究其原因，还是凝结芽孢杆菌产业化发酵水平低、加工过程菌体损失高、成品菌体含量低。这些不利因素直接造成产品价格高，影响凝结芽孢杆菌的普及应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法。本发明是新开发的凝结芽孢杆菌，具有高密度发酵和高菌体含量的特点，有利于降低产品成本，有助于产品市场推广，对于促进畜禽健康养殖具有积极意义。
本发明的技术方案如下：
本发明提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)已保存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCC M 2015273。具体是通过以下步骤来实现的：
1、凝结芽孢杆菌的筛选
从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品称取2g，加入98ml无菌生理盐水，80℃热处理10min后，在37℃摇床上120rpm条件下振荡20min，吸取上清液1ml加入LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。通过对菌株进行形态学观察、生理生化实验、16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种。
最终得到编号为ZS-007的菌种，鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
ZS-007于2015年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015273，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学。
2、凝结芽孢杆菌的产乳酸能力测试
将凝结芽孢杆菌ZS-007接种于产酸能力测试培养基中，并在37℃下静置培养进行产乳酸能力测试。所用产酸能力测试培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾2g/L，硫酸镁1g/L，硫酸锰0.5g/L。培养基用10％NaOH调节pH7.0后，121℃灭菌20min。
利用HPLC检测发酵液中的乳酸含量，结果见图1。从图1中可以看到乳酸含量在10g/L左右。
3、凝结芽孢杆菌高密度发酵
(1)菌种活化
将凝结芽孢杆菌菌种接种至营养琼脂斜面培养基上，25-37℃下培养24-48hr；然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，25-37℃下培养24-48hr。
营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成均为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4。
(2)摇瓶培养
将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养18-30hr。
摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。250mL摇瓶装液量为20mL，500mL摇瓶装液量为50mL。
培养条件：摇瓶转速200r/min，温度25-37℃。
(3)种子罐扩培
扩培菌种以用于后期发酵。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。种子罐体积10-1000L，装液量50-80％。
培养条件：搅拌转速180-250r/min，通气量0.5-1.0vvm，温度25-37℃，培养时间18-30hr。
(4)发酵罐发酵
以0.1％-10％的接种量将种子液接入发酵罐，发酵培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0。发酵罐体积1-50m3，装液量50-80％。
培养条件：搅拌转速100-200r/min，通气量0.5-0.8vvm，温度25-37℃，培养时间16-48hr。
取发酵液镜检时，当90％以上的菌体都形成芽孢时，即到发酵终点，得到最终发酵液。
采用平板涂布法测定最终发酵液活菌数和芽孢数，并计算芽孢率。其中，芽孢率为芽孢数与活菌数的比值。所用培养基为营养琼脂培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4。测定最终发酵液活菌数时，梯度稀释后测定；测定芽孢数时，取最终发酵液于80℃热处理10min，梯度稀释后测定。最终发酵液中活菌数1.5×1010cfu/mL以上、芽孢数1.4×1010cfu/mL以上、芽孢率90.8％以上。
4、干菌粉制备
最终发酵液离心后收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。操作条件为：进风温度210℃，出风温度100℃。干菌粉中活菌数8.0×1011cfu/g以上。
所得干菌粉可与淀粉、葡萄糖、以及其它符合标准的载体等填充剂混合后得到凝结芽孢杆菌微生态制剂。
本发明有益的技术效果在于：
本发明采用液体发酵工艺，发酵液中凝结芽孢杆菌活菌数1.52×1010cfu/mL以上、芽孢数1.38×1010cfu/mL以上、芽孢率90.8％以上。喷雾干燥获得的干菌粉中，活菌数8.0×1011cfu/g以上。干菌粉可与淀粉、葡萄糖等填充剂混合后得到凝结芽孢杆菌微生态制剂。
本发明生产工艺简单稳定，发酵液中活菌数高，可直接减少应用成本，有利于产品推广。这对于推动凝结芽孢杆菌微生态制剂的广泛应用具有意义。
附图说明
图1为本发明凝结芽孢杆菌的HPLC检测发酵液中的乳酸含量。
具体实施方式
实施例1：凝结芽孢杆菌的筛选
从江苏无锡马山某奶牛养殖场附近的土壤样品称取2g，加入98ml无菌生理盐水，80℃热处理10min后，在37℃摇床上120rpm条件下振荡20min，吸取上清液1ml加入LB培养基中稀释涂布进行菌株分离。通过对菌株进行形态学观察、生理生化实验、16S rDNA分析等手段有效而准确的确定菌种的属种。
最终得到编号为ZS-007的菌种，鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
ZS-007于2015年5月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2015273。
实施例2：1m3发酵罐制备
菌种活化：将实施例1得到的菌种接种至营养琼脂斜面培养基上，30℃下培养24hr后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，30℃下培养24hr。营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成均为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4。
摇瓶培养：将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养20hr。摇瓶培养基配方： 蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4，摇瓶装液量50mL/500mL三角瓶。培养条件：摇瓶转速200r/min，温度30℃。
发酵罐发酵：收集20瓶三角瓶液体作为种子接入1m3发酵罐。1m3发酵罐装液量65％。培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0。将培养好的种子接入发酵罐进行发酵。培养条件：搅拌转速200r/min，通气量0.8vvm，温度30℃，培养时间40-44hr。
发酵液中，活菌数1.52×1010cfu/g，芽孢数1.38×1010cfu/g，芽孢率90.8％。
实施例3：3m3发酵罐制备
菌种活化同实施例2。
摇瓶培养：将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养20hr。摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4，摇瓶装液量为20mL/250mL三角瓶。培养条件：摇瓶转速200r/min，温度30℃。
种子罐扩培：收集10瓶250mL摇瓶种子液用于种子罐接种。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。种子罐体积30L，装液量80％。培养条件：搅拌转速200r/min，通气量0.8vvm，温度30℃，培养时间20hr。
发酵罐发酵：3m3发酵罐装液量70％。培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0。将培养好的种子接入发酵罐进行发酵。培养条件：搅拌转速150r/min，通气量0.7vvm，温度35℃，培养时间36-42hr。
发酵液中，活菌数1.79×1010cfu/g，芽孢数1.72×1010cfu/g，芽孢率96.1％。
实施例4：30m3发酵罐和干菌粉制备
菌种活化同实施例2
摇瓶培养：将活化好的菌种接种至摇瓶中，振荡培养20hr。摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4，摇瓶装液量50mL/500mL三角瓶。培养条件：摇瓶转速200r/min，温度30℃。
种子罐扩培：收集20瓶500mL摇瓶种子液用于种子罐接种。种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4。种子罐体积500L， 装液量75％。培养条件：搅拌转速200r/min，通气量0.8vvm，温度30℃，培养时间20hr。
发酵罐发酵：30m3发酵罐装液量70％。培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0。将培养好的种子接入发酵罐进行发酵。培养条件：搅拌转速100r/min，通气量0.6vvm，温度35℃，培养时间40-45hr。
发酵液中，活菌数1.99×1010cfu/g，芽孢数1.92×1010cfu/g，芽孢率96.5％。
离心收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。操作条件为：进风温度210℃，出风温度100℃。干菌粉中活菌数8.32×1011cfu/g。
实施例5：干菌粉制备
采用实施例4中的发酵方法获得凝结芽胞杆菌发酵液，离心收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉。操作条件为：进风温度220℃，出风温度100℃。干菌粉中活菌数6.54×1011cfu/g。
对于本领域技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，这些改进或变换都属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (3)

1.一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)ZS-007，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015273。
2.一种权利要求1所述的凝结芽胞杆菌的高密度发酵方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)菌种活化
将凝结芽孢杆菌菌种接种至营养琼脂斜面培养基上，25-37℃下培养24-48hr；然后划线转接于营养琼脂茄子瓶斜面，25-37℃下培养24-48hr；营养琼脂斜面培养基及营养琼脂茄子瓶的组成均为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15-20g/L，pH7.2-7.4；
(2)摇瓶培养
将步骤(1)得到的菌种接种至摇瓶中，振荡培养18-30hr；摇瓶培养基配方：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4；250mL摇瓶装液量为20mL，500mL摇瓶装液量为50mL；培养条件：摇瓶转速200r/min，温度25-37℃；
(3)种子罐扩培
种子罐培养基组成：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，pH7.2-7.4；种子罐体积10-1000L，装液量50-80％；培养条件：搅拌转速180-250r/min，通气量0.5-1.0vvm，温度25-37℃，培养时间18-30hr；
(4)发酵罐发酵
以0.1％-10％的接种量将步骤(3)得到的种子液接入发酵罐，发酵培养基组成：葡萄糖25g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，初始pH7.0；发酵罐体积1-50m3，装液量50-80％；培养条件：搅拌转速100-200r/min，通气量0.5-0.8vvm，温度25-37℃，培养时间16-48hr；取发酵液镜检时，当90％以上的菌体都形成芽孢时，即到发酵终点，得到发酵液。
3.一种基于权利要求2所述的凝结芽胞杆菌的高密度发酵方法制备干菌粉的方法，其特征在于将步骤(4)得到的发酵液离心后收集湿菌泥，采用喷雾干燥工艺得到干菌粉；喷雾干燥条件为：进风温度210℃，出风温度100℃；干菌粉中活菌数8.0×1011cfu/g以上。
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