CN109207406A - 一种提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法及培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用乳酸盐和/或乳酸作为凝结芽孢杆菌生长的唯一或主要碳源促进其细胞形成芽孢的方法，该方法利用如下培养基培养凝结芽孢杆菌，对凝结芽孢杆菌进行好氧培养，培养基组成为：酵母膏10.0g/L；牛肉膏10.0g/L；蛋白胨10.0g/L；碳酸氢钠1.5g/L；磷酸二氢钾1.5g/L；七水硫酸镁1.0g/L；硫酸锰0.1g/L；氯化钙1.0g/L；去离子水1L；乳酸盐和/或乳酸含量为10‑30g/L。本发明在培养凝结芽孢杆菌过程中可以促进凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢，芽孢形成率高达90％以上。

Description

一种提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法及培养基
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用乳酸盐和/或乳酸作为凝结芽孢杆菌生长的唯一或主要碳源促进其细胞形成芽孢的方法。
背景技术
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)分类学上属于硬(或厚)壁菌门,芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性，端生芽孢，无鞭毛，可分解糖类，同型发酵产乳酸。凝结芽孢杆菌最适生长温度为45-50℃，最适pH为6.6-7.0，在人体肠道内能够发挥促进微生物菌群平衡、提高机体免疫力和抗病力等功效。凝结芽孢杆菌不仅可以分泌淀粉酶和蛋白酶，促进人和动物对营养物质的消化和吸收，而且还可以产生B族维生素、氨基酸和短链脂肪酸等生命活性物质，为人和动物提供营养物质。另外，凝结芽孢杆菌还能产生大量抑制有害菌生长的凝固素(Coagulin)和乳酸等抑菌物质，因此可以作为药物防治对人胃肠细菌性引起的炎症疾病。
作为一种典型的益生菌种，凝结芽孢杆菌已经在人类食品和药品以及动物用微生态制剂领域有越来越广泛的应用，需求量呈现迅猛的增长趋势。凝结芽孢杆菌以营养体细胞或芽孢形式2种形式存在，因为芽孢具备抗干燥、高温和成活率高等特点，因此目前市售凝结芽孢杆菌产品均以芽孢形式存在。尽管国内外在高密度发酵培养凝结芽孢杆菌和利用乙酸盐促进其细胞形成芽孢方面有一些研究文献，但在培养后期如何提高凝结芽孢杆菌芽孢形成率方面却鲜有文献报道。
现有技术中一般采用异养好氧方式培养凝结芽孢杆菌，所用有机碳源为葡萄糖、蔗糖、甘油和乙酸等，所用氮源有酵母膏、牛肉膏和铵等，采用摇床振荡或发酵罐搅拌通空气等方式提供氧气。凝结芽孢杆菌培养进入指数生长后期或稳定期的细胞不易形成芽孢，由于芽孢的形成率不高，不利于产业化生产。基于此，发明人进一步探索了不同碳源对凝结芽孢杆菌生长和促进其细胞形成芽孢的效应，获得了促进凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的技术与方法。
发明内容
本发明采用的凝结芽孢杆菌菌种为从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)购买的凝结芽孢杆菌菌株[Bacillus coagulans]，保藏编号为CGMCC NO.1.10823。
本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种培养基，可以采取如下技术方案达到：
乳酸盐和/或乳酸含量为10-30g/L。
作为优选的，所述乳酸盐和/或乳酸含量为20g/L。
作为优选的，所述培养基通过添加氢氧化钠溶液或浓盐酸溶液调节初始pH为6.0-8.0。
作为优选的，所述培养基通过添加氢氧化钠溶液或浓盐酸溶液调节初始pH为7.0。本发明的另一目的在于提供一种提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，可以采取如下技术方案达到：
一种提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，以乳酸盐和/或乳酸为唯一或主要碳源的液体培养基中，对凝结芽孢杆菌进行好氧培养，在凝结芽孢杆菌生长进入指数后期或稳定期时促进细胞形成芽孢的方法。
作为优选的，对所述凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢好氧培养过程中，控制摇床转速为100-300转/分。
作为优选的，所述控制摇床转速优选为200转/分。
作为优选的，对所述凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢培养的温度为40-50℃。
作为优选的，所述培养的温度优选为45℃。
作为优选的，所述以乳酸盐和/或乳酸作为唯一或主要碳源的液体培养基中好氧培养凝结芽孢杆菌72h，获得菌落形成单位(CFU)为5.00×109/mL，芽孢浓度为4.55×109/mL，芽孢形成率高达90％以上。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
第一、通过不同有机碳源培养凝结芽孢杆菌的实验，发现采用乳酸钠作为唯一或主要有机碳源，可以促进凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢，芽孢形成率高达90％以上。
第二、本发明的凝结芽孢杆菌有利于大规模发酵产业化培养，获得大量的凝结芽孢杆菌芽孢作为生物高技术产品。
第三、本发明所采用的培养基原料乳酸盐和或乳酸成本低廉，容易购买获得，使用方便。
第四、本发明获得大量凝结芽孢杆菌所采用的培养操做方式简单，只是将乳酸盐和/或乳酸作为凝结芽孢杆菌生长培养基的唯一或主要碳源。
附图说明
图1为本发明利用不同碳源的凝结芽孢杆菌的CFU生长曲线图。
图2为本发明以不同碳源培养凝结芽孢杆菌形成芽孢的变化曲线图。
图3为本发明以不同碳源培养凝结芽孢杆菌芽孢形成率的变化曲线图。
图4为本发明以不同乳酸钠浓度作为碳源对凝结芽孢杆菌芽孢形成的效应图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不构成的对本发明的任何限制。
设备和材料：
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他常规设备和材料如下：
洁净工作台、高压灭菌锅、均质器、电子天平(感量为0.1g)、恒温培养箱、水浴锅(80℃±1℃)、无菌均质袋、500ml三角瓶、1ml(0.01ml刻度)移液枪、10ml(0.1ml刻度)移液枪、培养皿、摇床、显微镜、培养基原料及去离子水。
本发明中以不同碳源的液体培养基对凝结芽孢杆菌进行好氧培养的方法按照以下方式进行：
一、凝结芽孢杆菌种子培养
本发明中，用于凝结芽孢杆菌种子培养的液体基础培养基以1L水计的组成如下表1：
酵母膏 10.0g/L；
牛肉膏 10.0g/L；
蛋白胨 10.0g/L；
碳酸氢钠 1.5g/L；
磷酸二氢钾 1.5g/L；
七水硫酸镁 1.0g/L；
硫酸锰 0.1g/L；
氯化钙 1.0g/L；
去离子水 1L；
表1凝结芽孢杆菌种子基础培养基
在本发明的一些实施例中，利用表1培养基培养凝结芽孢杆菌菌种的培养步骤如下：
1)按照表1配制培养基，添加20g/L的葡萄糖作为唯一或主要有机碳源，通过添加40g/L的氢氧化钠溶液或浓盐酸溶液调节初始pH 7.0。用500ml三角瓶装入配制好的液体培养基100ml，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。
2)在洁净工作台内，将购买的凝结芽孢杆菌种直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养。经72h培养凝结芽孢杆菌CFU达到5.00×109/mL左右，可以作为凝结芽孢杆菌种子液，采用上述方法可以重复制备出凝结芽孢杆菌种子液。
二、不同碳源对凝结芽孢杆菌生长及细胞形成芽孢的效应
本发明采用表1的基础培养基，分别添加了20g/L的蔗糖、葡萄糖、乳酸钠和乙酸钠作为唯一或主要碳源，或分别添加10g/L、20g/L和30g/L的乳酸钠，通过添加40克每升的氢氧化钠溶液或浓盐酸溶液调节初始pH为7.0。
1)用500ml三角瓶装入配制好的液体培养基100ml，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。
2)在洁净工作台内，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养。
3)从培养凝结芽孢杆菌初始开始，连续3天每天取样测定凝结芽孢杆菌的CFU和芽孢浓度，研究不同碳源对凝结芽孢杆菌生长和其细胞形成芽孢的效应。
4)图1显示，采用4种不同的糖和有机酸作为唯一或主要的有机碳源，凝结芽孢杆菌均可以快速生长，培养3d采用葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和乙酸钠作为唯一或主要碳源时，获得的凝结芽孢杆菌CFU分别为5.50×109/mL、5.30×109/mL、5.0×109/mL和4.50×109/mL，说明支持凝结芽孢杆菌生长的最好碳源为葡萄糖，最差的为乙酸钠。
5)图2显示，采用4种不同的糖和有机酸作为唯一或主要的有机碳源培养凝结芽孢杆菌3d，在葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和乙酸钠作为唯一或主要碳源时，获得的凝结芽孢杆菌芽孢浓度分别为3.50×109/mL、3.80×109/mL、4.55×109/mL和4.00×109/mL，说明支持凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的最好碳源为乳酸钠，其次为乙酸钠，最差的为葡萄糖。
6)图3显示，采用4种不同的糖和有机酸作为唯一或主要的有机碳源培养凝结芽孢杆菌3d，在葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和乙酸钠作为唯一或主要碳源时，获得的凝结芽孢杆菌芽孢形成率分别为63.6％、71.7％、91.0％和88.9％，再次说明支持凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的最好碳源为乳酸钠，其次为乙酸钠，最差的为葡萄糖。
7)图4显示，分别采用10g/L、20g/L和30g/L的乳酸钠作为唯一或主要的有机碳源培养凝结芽孢杆菌，3d时的芽孢浓度分别为4.10×109/mL、4.60×109/mL和4.30×109/mL，说明支持凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的乳酸钠优化初始浓度为20g/L最好。
本发明中凝结芽孢杆菌CFU和芽孢浓度采用以下方法测定：
1)凝结芽孢杆菌CFU测定:取培养物1毫升，经高温高压灭菌后的生理食盐水(0.9％氯化钠无菌水溶液(w/v))稀释一定倍数后，采用移液枪吸取0.1毫升稀释液直接均匀涂板于培养皿固体培养基(表1培养基，加20g/L葡萄糖和20g/L琼脂)表面，放入38℃培养箱内培养3天后计数生长出的菌落数，根据稀释倍数推算出凝结芽孢杆菌的CFU。
2)凝结芽孢杆菌芽孢浓度测定:取培养物1毫升在水浴锅内80℃下10分钟后(杀死细胞而芽孢可以耐受80℃高温)，经高温高压灭菌后的生理食盐水(0.9％氯化钠无菌水溶液(w/v))稀释一定倍数后，采用移液枪吸取0.1毫升稀释液直接均匀涂板于培养皿固体培养基(表1培养基，加20g/L葡萄糖和20g/L琼脂)表面，放入38℃培养箱内培养3天后计数生长出的菌落数，根据稀释倍数推算出凝结芽孢杆菌芽孢浓度。
3)凝结芽孢杆菌芽孢形成率：采用凝结芽孢杆菌芽孢浓度/凝结芽孢杆菌CFU×100％＝芽孢形成率。
应该了解的是，作为一种典型的芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌可以利用多种糖类和有机酸作为生长并形成芽孢的碳源，但不同糖和有机酸对凝结芽孢杆菌生长并形成芽孢存在差异，本发明通过不同有机碳源培养凝结芽孢杆菌的实验，发现采用乳酸钠作为唯一或主要有机碳源，可以促进凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢，芽孢形成率高达90％以上，在国内外尚未见有文献报道，在大规模产业化培养获得凝结芽孢杆菌芽孢方面具有重要的应用价值。
实施例1：
利用初始10g/L乳酸钠培养凝结芽孢杆菌
1.1凝结芽孢杆菌种子液的制备
采用表1的培养基，添加20g/L葡萄糖作为唯一或主要碳源，将配制的液体培养基分装到500毫升三角瓶中每瓶100毫升，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养3天后作为凝结芽孢杆菌种子。
1.2配制10g/L乳酸钠浓度培养凝结芽孢杆菌
采用表1的培养基，添加10g/L乳酸钠作为唯一或主要碳源，将配制的液体培养基分装到500毫升三角瓶中每瓶100毫升，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养。
1.3图4结果显示，采用10g/L乳酸钠作为唯一或主要碳源，培养3天后取样测定芽孢浓度为4.10×109/mL。
实施例2：
利用初始20g/L乳酸钠培养凝结芽孢杆菌
2.1凝结芽孢杆菌种子液的制备
采用表1的培养基，添加20g/L葡萄糖作为唯一或主要碳源，将配制的液体培养基分装到500毫升三角瓶中每瓶100毫升，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养3天后作为凝结芽孢杆菌种子。
2.2配制20g/L乳酸钠浓度培养凝结芽孢杆菌
采用表1的培养基，添加20g/L乳酸钠作为唯一或主要碳源，将配制的液体培养基分装到500毫升三角瓶中每瓶100毫升，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养。
2.3图4结果显示，采用20g/L乳酸钠作为唯一或主要碳源，培养3天后取样测定芽孢浓度为4.60×109/mL。
实施例3：
利用初始30g/L乳酸钠培养凝结芽孢杆菌
3.1凝结芽孢杆菌种子液的制备
采用表1的培养基，添加20g/L葡萄糖作为唯一或主要碳源，将配制的液体培养基分装到500毫升三角瓶中每瓶100毫升，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养3天后作为凝结芽孢杆菌种子。
3.2配制30g/L乳酸钠浓度培养凝结芽孢杆菌
采用表1的培养基，添加30g/L乳酸钠作为唯一或主要碳源，将配制的液体培养基分装到500毫升三角瓶中每瓶100毫升，经可通空气的封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min，用移液枪吸取0.5毫升凝结芽孢杆菌种子液直接接种于500ml三角瓶内的100ml液体培养基中，在温度45℃摇床转速200r/min下进行好氧培养。
3.3图4结果显示，采用30g/L乳酸钠作为唯一或主要碳源，培养3天后取样测定芽孢浓度为4.30×109/mL。
从图4可以看出，分别采用10g/L、20g/L和30g/L的乳酸钠作为唯一或主要的有机碳源培养凝结芽孢杆菌，3d时的芽孢浓度分别为4.10×109/mL、4.60×109/mL和4.30×109/mL，说明支持凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的乳酸钠优化初始浓度为20g/L。
以上所述，仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。

Claims (9)

1.一种培养基，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述乳酸盐和/或乳酸含量为20g/L。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基通过添加氢氧化钠溶液或浓盐酸溶液调节初始pH为6.0-8.0。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基通过添加氢氧化钠溶液或浓盐酸溶液调节初始pH为7.0。
5.一种提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，其特征在于，利用权利要求1-4任一项所述的培养基培养凝结芽孢杆菌，对凝结芽孢杆菌进行好氧培养。
6.根据权利要求5所述的提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢好氧培养过程中，控制摇床转速为100-300转/分。
7.根据权利要求6所述的提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，其特征在于，所述控制摇床转速为200转/分。
8.根据权利要求5所述的提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，其特征在于，对所述凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢培养的温度为40-50℃。
9.根据权利要求8所述的提高凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢的方法，其特征在于，对所述凝结芽孢杆菌细胞形成芽孢培养的温度为45℃。
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