CN115181686A - 一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，具体涉及枯草芽孢杆菌技术领域，包括以下步骤：种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用。本发明对种子活化培养、种子培养和发酵培养过程中，种子活化培养基制备后采用高压灭菌锅进行灭菌，种植培养基制备完成后采用100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min，发酵培养基制备后采用湿热灭菌法进行灭菌操作，整个培养制备过程采用全面的灭菌操作，制备过程中全程对杂菌进行处理杀菌操作，且本发明整体的制备过程明显改善菌体的生长培养情况。

Description

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌技术领域，更具体地说，本发明涉及一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺。

背景技术

芽孢是产芽孢类细菌在生长繁殖过程中产生的一种抗逆休眠体，一般会在培养基中的必需营养即将耗尽时产生，它并不是芽孢杆菌类细第一生中必须经历的一个阶段，更不是细菌繁殖的一种形式。在遇到一些特殊的环境时，就会在体内形成含水量比较低、抗逆性较强的芽孢。芽孢因其自身具备的多个特点在科研及生产生活等多方面都有应用，例如，由于芽孢对恶劣环境有很强的耐受力和抵抗力，在这样的环境里生命力持久很难被杀死，所以芽孢可以协助细菌度过外界环境对菌体生存不利的时期，使其得以存活下来。在实验室里，芽孢也是保存菌种的适宣材料，通过保存菌种的芽孢某些菌种的保存时间可达十年之久。另外，食品生产方面，在乳制品中抗生素残留检测所用的试剂盒中起到主要作用的就是芽孢。

枯草芽孢杆菌是一种好氧型菌，其菌体代谢活力强，在条件收变时能产芽孢自我保护的微生物，其代谢产物也有很高的酶活性，而且属于清洁型生物菌种，不污染大白然环境，也对人对动物无害，广泛应用于饲料以及水治理行业21。芽孢体和营养体菌体相比更容易保存，且的发率高，而在规代化机器制备芽孢菌剂过程中，可以较好的保存菌剂中菌体的活性，而菌剂中的芽孢数量更是影响菌剂实用性的重要闪素。芽孢的产生是在菌体培养环境变化较大，菌体存活受到抑制时产生的自我保护体。日前，生产过程中的主要问题是芽孢的产生率较低。

且枯草芽孢杆菌制备发育过程若是对杂菌的处置不够理想，可能存在明显的杂菌干扰，甚至出现杂菌影响枯草芽孢杆菌的发育过程，导致最终得到的枯草芽孢杆菌纯度不够，同时发育数量受到较大影响，且整体的制备流程不够完善，因此需要一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺来解决上述问题。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，本发明所要解决的技术问题是：草芽孢杆菌制备发育过程若是对杂菌的处置不够理想，可能存在明显的杂菌干扰，甚至出现杂菌影响枯草芽孢杆菌的发育过程，导致最终得到的枯草芽孢杆菌纯度不够，同时发育数量受到较大影响，且整体的制备流程不够完善的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

作为本发明的进一步方案：所述S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，牛肉膏或葡萄糖的用量为0.3％-0.5％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

作为本发明的进一步方案：所述S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

作为本发明的进一步方案：所述S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

作为本发明的进一步方案：所述S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，所述S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

本发明的有益效果在于：

1、本发明对种子活化培养、种子培养和发酵培养过程中，种子活化培养基制备后采用高压灭菌锅进行灭菌，种植培养基制备完成后采用100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min，发酵培养基制备后采用湿热灭菌法进行灭菌操作，整个培养制备过程采用全面的灭菌操作，制备过程中全程对杂菌进行处理杀菌操作，且本发明整体的制备过程明显改善菌体的生长培养情况。

2、本发明中采用牛肉膏作为碳源，且牛肉膏的最佳用量为0.4％，牛肉膏作为微生物生长的唯一碳源时，又兼能为微生物的生长提供氮源，在一定程度上保证菌体的生长情况优良。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，牛肉膏用量为0.3％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

实施例2：

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，牛肉膏用量为0.4％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

实施例3：

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，牛肉膏用量为0.5％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

实施例4：

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，葡萄糖用量为0.3％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

实施例5：

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，葡萄糖用量为0.4％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

实施例6：

一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用。

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，葡萄糖用量为0.5％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。

由实施例1-6可得下表：

选择牛肉膏与葡萄糖作为碳源时，整体的菌落发展情况，可明显看出牛肉膏作为碳源更为理想，其原因在于牛肉膏作为微生物生长的唯一碳源时，又兼能为微生物的生长提供氮源，因而牛肉膏作为双功能营养物优于葡萄糖作为微生物生长的唯一碳源，选择牛肉膏作为菌体生长培养基中的碳源，同时牛肉膏作为最佳碳源时，当牛肉膏的添加量为0.4％时，菌体生长最佳，达到3.8×10cfu/mL。

最后应说明的几点是：虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

S1、种子活化培养基制备，完成种子活化培养基制备后，对种子活化培养基进行消毒；

S2、种子活化，将菌种接种至种子活化培养基中进行活化处理，活化后的菌种储存在冰箱中备用；

S3、种子培养，种子培养基制备，种子培养基配方碳源材料、氮源材料、无机盐材料和水，将碳源材料、氮源材料、无机盐材料放入烧杯中混合均匀后，加入水进行搅拌，得到种子培养基，将种子培养基装入三角瓶中，并将活化后的菌种接种到种子培养基中，将三角瓶放入温控摇床中，在温度37℃、转速120r/min条件下培养24h，最后将得到的产物作为种子液备用；

S4、种子发酵培养，发酵培养基制备，发酵培养基配方为葡萄糖9.4g/L，酵母膏6.9g/L，氯化钠3g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁MgSO0.2g/L，硫酸锰10.2mg/L，碳酸钙0.2g/L，按比例称取葡萄糖，酵母膏，氯化钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰和碳酸钙放入三角瓶中，将其混合均匀后，向三角瓶中加入水，搅拌均匀即得到发酵培养基，将S3中得到的种子液以2％的接种量接种于发酵培养基中，装液量为100/250mL，同时在振荡器中130r/min，37℃下震荡培养48h。

2.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，其特征在于：所述S3中种子培养基的碳源材料为牛肉膏或葡萄糖，氮源材料为蛋白胨，无机盐材料为氯化钠，牛肉膏或葡萄糖的用量为0.3％-0.5％，蛋白胨的用量为0.8％，氯化钠的用量为0.4％，水的用量为1000mL，种子培养基在搅拌均匀后调整PH为7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，其特征在于：所述S1中种子活化培养基的配方为，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.8％，氯化钠0.4％，水1000mL，琼脂粉1％，将上述配方量的牛肉膏、蛋白胨和氯化钠放入烧杯中，并加入少量水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均与倒入少于培养基总体积的沸水中，加热的同时对其进行搅拌，待其溶化至透明状后继续加热5min即制成可溶性淀粉溶液，将可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，称取配方量的琼脂放入可溶性淀粉溶液中，在加热溶化，随后加入适量水至培养基总体积，即得到种子活化培养基。

4.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，其特征在于：所述S2中的种子活化过程具体为，将S1中配置好的种子活化培养基装入三角瓶中，装入量为三角瓶容量的1/2，并使用密封膜密封，将其放入高压灭菌锅中进行灭菌操作，灭菌过程保持125℃，时间为20min，随后在无菌环境下将菌种接种到已经制备好斜面活化培养基中，在37℃的恒温培养箱中活化培养48h，最后将活化后的菌种储存在冰箱中备用。

5.根据权利要求1所述的一种不易受杂菌感染的枯草芽孢杆菌培养制备工艺，其特征在于：所述S4中种子发酵培养基在完成制备后采用湿热灭菌法对其进行灭菌操作，所述S3中种子培养过程中种子培养基制备完成后对其进行灭菌操作，灭菌过程为将种子培养基100～130℃温度和紫外灯照射下消毒灭菌15～20min。