CN105039213A - 一种好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法。本发明是利用现代生物发酵技术，进行液体-固体联合发酵，通过液体高密度发酵，固体发酵，过程补料、低温烘干等易于工业化生产的生产工艺，培养生产芽孢数含量高的高活性降解亚硝态氮的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂；其每克微生物制剂含活菌数200～250亿个，芽孢率>80％，杂菌率0.5％～1％。本发明制剂用作养殖水体改良剂，能有效降低养殖水体亚硝酸盐含量，改善水质，保障水产养殖业的健康可持续发展需要。

Description

一种好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于水产养殖水质调控技术领域，具体涉及一种好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法。

背景技术

随着集约化水产养殖业的快速发展，养殖动物排泄和饵料过剩等原因造成水体中氨氮、亚硝酸盐等含量严重超标，水质恶化，进而导致病害频发，并严重影响了水产养殖业的健康可持续发展。微生物的反硝化作用对于改善水质，特别是降低亚硝酸盐有非常重要的作用。反硝化细菌是一类能利用亚硝酸盐为氮源、有机物碳为碳源，并能进行自身繁殖的微生物。目前国内水产养殖大多采用高度集约化养殖的模式，充足的氧气是保证高密度养殖的成功的关键，在水产的高密度养殖过程中必须连续地充氧以保证水中一定量的溶解氧，然而传统的反硝化细菌多为厌氧菌，反硝化作用只有在厌氧或缺氧条件下才能进行，氧气充足的条件下其对硝态氮和亚硝态氮的降解能力将受到极大的抑制，这样的造成了目前生物脱氮技术在水产养殖环境中效果差的问题。好氧反硝化细菌作为一种新型的脱氮细菌而备受关注。因此，高密度水产养殖环境中施用好氧反硝化微生物制剂转化养殖水体中的有毒和致癌物质亚硝酸盐为无毒的氮气将是一个十分绿色健康的选择，是目前非常热门的研究方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种活菌数多、芽孢数高、在氧气充足的水产养殖环境中具有高降解亚硝态氮活性的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂及其制备方法，该制备方法能够大幅度的降低生产成本，使得生物脱氮效果能够在水产养殖环境中充分的发挥。

本发明的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将浓度为2.0×10⁸cfu/mL～2.0×10⁹cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GIM1.7152种子培养液以3％～5％体积比的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率200～350rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，发酵8～14小时，使枯草芽孢杆菌GIM1.7152生长至对数生长期，制成一级种子液；

(2)将一级种子液以2％～10％体积比的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率150～250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，发酵12～30小时，使枯草芽孢杆菌GIM1.7152生长至对数生长期，制成二级种子液；

(3)将二级种子液以20～40ml/Kg麸皮固体培养基的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为：换气3～10次/h，温度30～40℃，湿度80％～90％条件下培养48～72h，培养期间翻动麸皮固体培养基，由此制备得到好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂；

所述的一级和二级发酵培养基都为：每升含有MgSO₄0.5～2.0g、KH₂PO₄1～5g、K₂HPO₄1～5g、NaCl5～10g、KNO₃1-10g、蛋白胨5～20g、牛肉膏3～15g和余量的水，pH7.2±0.3；

所述的麸皮固体培养基为：按质量分数100％计，包含麸皮48％～60％、硫酸铵0.1％～0.5％、氯化铵0.1％～0.5％、硝酸钠0.1～1.0％和余量的水。

所述的浓度为2.0×10⁸cfu/mL～2.0×10⁹cfu/mL的枯草芽孢杆菌GIM1.7152种子培养液优选是通过以下方法制备的：将枯草芽孢杆菌GIM1.7152菌种接种到LB琼脂培养基试管斜面，37℃培养16-24h；然后转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养20-30h，制成种子培养液。

所述的LB液体培养基属于现有技术中的常规培养基，其配方为：每升含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，余量为水，pH7.0～7.2。LB琼脂培养基是在LB液体培养基基础上加入琼脂20g。

所述的步骤(3)中的培养期间翻动麸皮固体培养基优选每隔3～5h翻动一次。

对上述好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂经45～60℃干燥处理，包装，经检测合格后制备得到商品化的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂。

本发明的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂是利用现代生物发酵技术，进行液体-固体联合发酵，通过液体高密度发酵，固体发酵，过程补料、低温烘干等易于工业化生产的生产工艺，培养生产芽孢数含量高的高活性降解亚硝态氮的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂。本发明优化了发酵培养基，将80％以上形成芽孢的菌体作为种子培养液接种到发酵培养基中，在合适的条件下进行一级和二级发酵，再以二级种子液接种到麸皮固体培养基中，控制其在合适条件下进行高密度的发酵，形成大量的芽孢，同时避免杂菌的影响。本发明有力的解决了现有技术中麸皮发酵过程中的杂菌过多、通风、散热不均、温度、湿度不恒定等问题，大大提高了枯草芽孢杆菌的活菌数和芽孢数，经检测，按照本发明方法制备得到的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂，其每克微生物制剂含活菌数200～250亿个，芽孢率>80％，杂菌率0.5％～1％。本发明制剂用作养殖水体改良剂，能有效降低养殖水体亚硝酸盐含量，改善水质，保障水产养殖业的健康可持续发展需要。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、菌种易于培养、原料来源方便廉价；

2、反应条件温和、反应步骤简单、工艺成本低；

3、生产菌株为好氧反硝化芽孢杆菌，适合水产养殖环境，可有效降解养殖水体亚硝酸盐含量，无残留，绿色，安全等。

附图说明

图1是实施例1中一级发酵中的好氧反硝化枯草芽孢杆菌生长曲线图。

图2是实施例1中二级发酵中的好氧反硝化枯草芽孢杆菌生长曲线图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中所用：

枯草芽孢杆菌的冻干种均为冻干保藏菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GIM1.7152，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GIMCC)，中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼，菌种保藏编号为GIM1.7152。

LB液体培养基属于现有技术中的常规培养基，其配方为：每升含有胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，余量为水，pH7.0～7.2。LB琼脂培养基是在LB液体培养基基础上加入琼脂20g。灭菌备用。

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基属于现有技术中的常规培养基，其配方为：每升含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂20g，余量为水，pH7.0～7.2。灭菌备用。

实施例1

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GIM1.7152的冻干种上挑取一环菌体接种至LB琼脂试管斜面培养基中，37℃培养16h；试管斜面种子转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养20h，形成种子培养液，其浓度为2.0×10⁸cfu/mL。

将种子培养液以3％(体积比)的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，自接种后每2h取样一次测600nm的吸光值，用未接种的培养基作为空白对照，制作枯草芽孢杆菌生长曲线图，如图1所示，由曲线可知枯草芽孢杆菌在8～12h菌数急剧增加，表明菌体已经到达对数生长期，取用发酵时间为8h的菌液制成一级种子液。将一级种子液以2％(体积比)的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率150rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，自接种后每2h取样一次测600nm的吸光值，用未接种的培养基作为空白对照，制作枯草芽孢杆菌生长曲线图，如图2所示，由曲线可知枯草芽孢杆菌在12～25h菌数急剧增加，表明菌体已经达到对数生长期，因此取用该时期的菌液得到二级种子液，本实施例中选取的是发酵时间为12h的菌液作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有MgSO₄0.5g，KH₂PO₄1g，K₂HPO₄1g，NaCl5g，KNO₃1g，蛋白胨5g，牛肉膏3g，余量为水，pH6.9；将上述物质混合均匀，再121℃高压灭菌20min备用。

接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积：25m²，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以20ml/Kg麸皮固体培养基的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为：换气3次/h，温度30℃，湿度为80～90％的条件下培养48h，培养期间每隔3h翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂。所述的麸皮固体培养基，每千克含有麸皮480g，硫酸铵1g，氯化铵1g，硝酸钠1g，水517g；其配置方法为将氯化铵、硫酸铵和硝酸钠先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀。

将本实施例制备得到的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂在卧式灭菌柜，压力为1.05～1.3Kg/cm³、温度为121～125℃条件下，灭菌30～40min，冷却至45～50℃分装浅盆，每盆5千克，用于后续检测和鉴定。

1平板菌落计数法计数

1.1称取本实施例的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂10g作为样品，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床200rpm振荡20min，静置20～30S，制成样品悬液。

1.2用1ml无菌吸管吸取1mL样品悬液，放入盛有9mL灭菌水的试管中，充分振摇使其混合均匀，即制成1：100稀释液。

1.3用1mL无菌吸管吸取1：100稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌水试管内，振摇试管，混合均匀，做成1：1000的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，分别制成10^-4、10^-5、10^-6……10^-9梯度稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

1.4选择2-3个适宜稀释度(一般取10^-6、10^-7、10^-8)，用灭菌100μL微量移液器，各取0.1mL稀释液接种于已制备好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平皿内，每个稀释度做3个平板，用无菌推棒均匀涂于整个表面。

1.5将平皿倒置于37℃±1℃恒温培养箱内培养48h±2h后，选取菌落数在30-300之间的平板计数。

2可疑菌落鉴定

2.1随机挑选5个菌落进行鉴定，包括菌落形态、菌体形状及芽孢生长情况显微镜观察，以及生理生化鉴定(接触酶、V-P试验、葡萄糖发酵、丙酸盐利用、硝酸盐还原试验等)；参见《伯杰细菌鉴定手册》，第八版(1984年出版)。

2.2鉴定结果

菌落形态：表面粗糙、不透明，边缘扩张，圆形或蔓延成波浪形，不规则形，菌落为污白色或微黄色。

革兰氏染色及镜检：革兰氏阳性，杆状；有芽孢，芽孢囊不明显膨大；芽孢椭圆形或柱形，中生或近中生。

生化鉴定：在7％NaCl中生长，不利用丙酸盐，接触酶阳性，V-P试验阳性，硝酸盐还原阳性，淀粉水解阳性，D-甘露醇产酸，厌氧不生长。

3菌落数的报告

3.1挑取菌落总数在30-300之间的平板计数，随机挑取5个可疑菌落鉴定后，根据以下公式计算得出每克样品中枯草芽孢杆菌数，公式为：

A＝B×C/5×f×10

式中：

A—测定的枯草芽孢杆菌菌落数，单位为cfu/g；

B—同一稀释度三次重复的可疑枯草芽孢杆菌平均菌落数；

C—5个鉴定的菌落中确认为枯草芽孢杆菌的菌落数；

f—稀释倍数；

10—转换因子。

3.2杂菌率(％)＝杂菌数/(有效活菌数+杂菌数)×100

将本实施例的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂进行检验发现，其每克含活菌数250亿个(芽孢率＞80％)，杂菌率1％。

3.3好氧反硝化作用强度的测定

将本实施例的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂用Giltay方法测定该菌的反硝化作用强度，第2天德汉氏小管内产气，且培养基颜色由绿色变为蓝色；第四天，硝酸盐降解率为95.6％，亚硝酸盐降解能力90.8％。

将此好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂经55～60℃真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。

实施例2

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GIM1.7152的冻干种上挑取一环菌体接种至LB琼脂试管斜面培养基中，37℃培养20h；试管斜面种子转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养25h左右，形成种子培养液，其浓度为1.1×10⁹cfu/mL。

将种子培养液以4％(体积比)的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率300rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，发酵时间为10h，制成一级种子液。将一级种子液以6％(体积比)的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，发酵时间为20h，经检测菌体已经达到对数生长期，由此得到二级种子液，本实施例中选取的是发酵时间为20h的菌液作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有MgSO₄1.2g，KH₂PO₄3g，K₂HPO₄3g，NaCl7.5g，KNO₃5.5g，蛋白胨12.5g，牛肉膏9g，余量为水，pH7.2；将上述物质混合均匀，再121℃高压灭菌20min。

接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积：25m²，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以30ml/Kg麸皮固体培养基的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为：换气6次/h，温度35℃，湿度为80～90％的条件下培养60h，培养期间每隔4h翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂。所述的麸皮固体培养基，每千克含有麸皮540g，硫酸铵3g，氯化铵3g，硝酸钠5g，水449g；其配置方法为将氯化铵、硫酸铵和硝酸钠先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀。

将本实施例制备得到的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂在卧式灭菌柜，压力为1.05～1.3Kg/cm³、温度为121～125℃条件下，灭菌30～40min，冷却至45～50℃分装浅盆，每盆5千克，用于后续检测和鉴定。

按照实施例1的方法，将本实施例的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂进行检验发现，其每克含活菌数220亿个(芽孢率＞80％)，杂菌率0.8％。

将此好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂经45～60℃真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。

为了验证在水产养殖中的应用效果，将上述所得的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂按500克/亩·米水深用量全池泼洒虾塘，使用之前用红糖和好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂按2:1重量比称好，然后加二者总重60倍水浸泡6h以上，上午10点泼洒。养殖池塘水深1m，面积10亩，pH：7.5-8.0，亚硝态氮浓度为0.3mg/L，使用第3天，亚硝态氮浓度为0.08mg/L，亚硝态氮降解率为73.33％。

实施例3

从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GIM1.7152的冻干种上挑取一环菌体接种至LB琼脂试管斜面培养基中，37℃培养24h；试管斜面种子转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养30h左右，形成种子培养液，其浓度为2.0×10⁹cfu/mL。

将种子培养液以5％(体积比)的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率350rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，发酵时间为14h，经检测菌体已经达到对数生长期，制成一级种子液。将一级种子液以10％(体积比)的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，发酵时间为30h，经检测菌体已经达到对数生长期，由此得到二级种子液，本实施例中选取的是发酵时间为30h的菌液作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有MgSO₄2.0g，KH₂PO₄5g，K₂HPO₄5g，NaCl10g，KNO₃10g，蛋白胨20g，牛肉膏15g，余量为水，pH7.5；将上述物质混合均匀，再121℃高压灭菌20min。

接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积：25m²，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以40ml/Kg麸皮固体培养基的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为：换气10次/h，温度40℃，湿度为80～90％的条件下培养72h，培养期间每隔5h翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂。所述的麸皮固体培养基，每千克含有麸皮600g，硫酸铵5g，氯化铵5g，硝酸钠10g，水380g。其配置方法为将氯化铵、硫酸铵和硝酸钠先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀。

将本实施例制备得到的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂在卧式灭菌柜，压力为1.05～1.3Kg/cm³、温度为121～125℃条件下，灭菌30～40min，冷却至45～50℃分装浅盆，每盆5千克，用于后续检测和鉴定。

按照实施例1的方法，将本实施例的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂进行检验发现，其每克含活菌数200亿个(芽孢率＞80％)，杂菌率0.5％。

将此好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂经45～60℃真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。

为了验证在水产养殖中的应用效果，将上述所得的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂按500克/亩·米水深用量全池泼洒加州鲈养殖池塘，使用之前用红糖和好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂按2:1重量比称好，然后加二者总重60倍水活化6h以上，上午10点泼洒。养殖池塘水深1.5m，面积3亩，pH：7.5-8.0，亚硝态氮浓度为0.28mg/L，使用第3天，亚硝态氮浓度为0.13mg/L，亚硝态氮降解率为53.57％。

Claims (4)

1.一种好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将浓度为2.0×10⁸cfu/mL～2.0×10⁹cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GIM1.7152种子培养液以3％～5％体积比的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率200～350rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，使枯草芽孢杆菌GIM1.7152生长至对数生长期，制成一级种子液；

(2)将一级种子液以2％～10％体积比的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率150～250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度80～90％，使枯草芽孢杆菌GIM1.7152生长至对数生长期，制成二级种子液；

(3)将二级种子液以20～40ml/Kg麸皮固体培养基的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为：换气3～10次/h，温度30～40℃，湿度80％～90％条件下培养48～72h，培养期间翻动麸皮固体培养基，由此制备得到好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂；

所述的一级和二级发酵培养基都为：每升含有MgSO₄0.5～2.0g、KH₂PO₄1～5g、K₂HPO₄1～5g、NaCl5～10g、KNO₃1-10g、蛋白胨5～20g、牛肉膏3～15g和余量的水，pH7.2±0.3；

所述的麸皮固体培养基为：按质量分数100％计，包含麸皮48％～60％、硫酸铵0.1％～0.5％、氯化铵0.1％～0.5％、硝酸钠0.1～1.0％和余量的水。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的浓度为2.0×10⁸cfu/mL～2.0×10⁹cfu/mL的枯草芽孢杆菌GIM1.7152种子培养液是通过以下方法制备的：将枯草芽孢杆菌GIM1.7152菌种接种到LB琼脂培养基试管斜面，37℃培养16-24h，然后转接到LB液体培养基中，37℃振荡培养20-30h，制成种子培养液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的培养期间翻动麸皮固体培养基为每隔3～5h翻动一次。

4.一种按照权利要求1、2或3所述的制备方法制备得到的好氧反硝化枯草芽孢杆菌制剂。