CN102334606B - 一种产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法。它是将种子培养液经过一级和二级发酵，再转接到麸皮固体培养基中，在合适的条件下发酵，而制得的。本发明优化了发酵培养基，将80％以上形成芽孢的菌体作为种子培养液接种到发酵培养基中，在合适的条件下进行一级和二级发酵，再以二级种子液接种到麸皮固体培养基中，控制其在合适条件下进行高密度的发酵，形成大量的芽孢，同时避免杂菌的影响。本发明有利的解决了现有技术中麸皮发酵过程中的杂菌过多、通风、散热不均、温度、湿度不恒定等问题，大大提高了枯草芽孢杆菌的活菌数，经检测，按照本发明方法制备得到的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂，其每克微生物制剂含活菌数200～250亿个活菌，芽孢率＞80％，杂菌率0.5％～2％。

Description

一种产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及一种产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的芽孢杆菌之一，其已被越来越多地研制成饲用微生物制剂。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，能够在厌氧条件下产生L-乳酸。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用。

因此在饲料中添加能够产L-乳酸的枯草芽孢杆菌是一个十分绿色健康的选择。

目前制备枯草芽孢杆菌微生物制剂一般采用敞开式麸皮固态的传统发酵工艺，采用自然风，自然温度、湿度，其制备的枯草芽孢杆菌微生物制剂中，杂菌率高，活菌数波动大。

发明内容：

本发明的目的是提供一种杂菌率低、活菌数高的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法。

本发明的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)：将活化的、80％以上菌体形成芽孢的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转入无菌水中，形成种子培养液，其浓度为5.0×10⁸cfu/ml～2.0×10⁹cfu/ml；

(2)：将种子培养液以3％～5％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率200～350rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间为8～16个小时，制成一级种子液；

(3)：将一级种子液以2～10％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，搅拌速率150～250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间12～30h，使枯草芽孢杆菌生长至对数生长期，制成二级种子液；

(4)：在无菌环境中，将二级种子液以3～5％的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为：3～10换气次数/小时，温度30～40℃，湿度80％～90％条件下培养60～72小时，培养期间翻动麸皮固体培养基，由此制备得到产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂；

所述的一级和二级发酵培养基都为：每升含有MgSO₄0.4～1.0g、KH₂PO₄0.5～3g、K₂HPO₄0.5～3g、NaCl3～10g、蛋白胨5～20g、牛肉膏3～10g，余量为水，pH7.2±0.3；

所述的麸皮固体培养基为：按总质量分数100％计，由麸皮48％～60％、硫酸铵0.1％～0.5％、氯化铵0.1％～0.5％和水39％～51％组成。

所述的将活化的、80％以上形成芽孢的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转入无菌水中，优选是将枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基试管斜面，37℃培养12～16小时，然后再接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基茄子瓶斜面，37℃培养至80％以上菌体形成芽孢时，再转入无菌水中，一般在37℃培养24～30小时就可达到。

所述的步骤(4)中的培养期间翻动麸皮固体培养基优选每隔3～5小时翻动一次。

经过本发明制备方法制备得到的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂经55～60℃干燥处理后，即可包装，经成品检测合格后，作为商品出售。

本发明的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基属于现有技术中的常规培养基，其配方为：每升含有蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂15g～20g，余量为水，pH7.2～7.4。

本发明的有益效果如下：

本发明优化了发酵培养基，将80％以上形成芽孢的菌体作为种子培养液接种到发酵培养基中，在合适的条件下进行一级和二级发酵，再以二级种子液接种到麸皮固体培养基中，控制其在合适条件下进行高密度的发酵，形成大量的芽孢，同时避免杂菌的影响。本发明有利的解决了现有技术中麸皮发酵过程中的杂菌过多、通风、散热不均、温度、湿度不恒定等问题，大大提高了枯草芽孢杆菌的活菌数，经检测，按照本发明方法制备得到的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂，其每克微生物制剂含活菌数200～250亿个活菌，芽孢率＞80％，杂菌率0.5％～2％。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是现有技术中经常使用的菌株，其在好多专利文献和非专利文献中公开了，如非专利文献(许国焕，吴月嫦，付天玺等，微生物制剂对奥尼罗非鱼生长及饲料表观消化率的影响，中国饲料，2008.21：26-28)，该菌株本申请人也持有，并保证自申请日起20年内向公众提供。

附图说明：

图1是实施例1中一级发酵中的枯草芽孢杆菌生长曲线图；

图2是实施例1中二级发酵中的枯草芽孢杆菌生长曲线图。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

从枯草芽孢杆菌的冻干种上挑取一环菌体接种至牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面培养基中，37℃培养16小时；再将试管斜面种子转接到牛肉膏蛋白胨琼脂茄子瓶斜面培养基中，37℃培养24小时，经检测，其80％以上形成芽孢。用无菌水将茄子瓶上成熟菌泥刮洗下来，装入250ml三角瓶，振荡使菌体均匀，形成种子培养液，其浓度为1.2×10⁹cfu/ml。所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方为：每升含有蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂15g～20g，余量为水，pH7.2～7.4，121℃高压灭菌20min。

将种子培养液以5％的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，自接种后每2h取样一次测600nm的吸光值，用未接种的培养基作为空白对照，制作枯草芽孢杆菌生长曲线图(图1)，由曲线可知枯草芽孢杆菌在8～12h菌数急剧增加，表明菌体已经到达对数生长期，取用发酵时间为8小时的菌液制成一级种子液；将一级种子液以10％的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，自接种后每2h取样一次测600nm的吸光值，用未接种的培养基作为空白对照，制作枯草芽孢杆菌生长曲线图(图2)，由曲线可知枯草芽孢杆菌在12～25h菌数急剧增加，表明菌体已经达到对数生长期，因此取用该时期的菌液得到二级种子液，本实施例中选取的是发酵时间为16小时的菌液作为二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基均为，每升含有MgSO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄ 1g，NaCl 5g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，余量为水，pH7.0，将上述物质溶于水中，再121℃高压灭菌20min。

接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积：25m²，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以3％的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为：10换气次数/小时，温度30～40℃，湿度为80～90％的条件下培养60小时，培养期间每隔3小时翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂。所述的麸皮固体培养基，每千克含有麸皮500g，硫酸铵4g，氯化铵2g，水494g。其配置方法为将氯化铵和硫酸铵先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机，压力，温度分别为：1.05～1.3Kg/cm³，121～125℃条件下，灭菌30～40min，冷却至40～50℃分装浅盆，每盆5公斤，备用。

一、活菌数和杂菌率的检测：

1、平板菌落计数法

1.1、称取本实施例的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂10g作为样品，放入盛有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，摇床200rpm振荡20min，静置20～30S，制成样品悬液。

1.2、用1ml无菌吸管吸取1mL样品悬液，放入盛有9mL灭菌水的试管中，充分振摇使混合均匀，即制成1∶100均匀稀释液。

1.3、用1mL无菌吸管吸取1∶100稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌水试管内，振摇试管，混合均匀，做成1∶1000的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增稀释液，分别制成10^-4、10^-5、10^-6......10^-9梯度稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。

1.4、选择2-3个适宜稀释度(一般取10^-6、10^-7、10^-8)，用灭菌100μL微量移液器，各取0.1mL接种于已制备好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平皿内，每个稀释度做3个平板，用无菌推棒均匀涂于整个表面。

1.5、将平皿倒置于37℃±1℃恒温培养箱内培养48h±2h后，选取菌落数在30-300之间的平板计数。

2、枯草芽孢杆菌菌落形态

形态特征：菌体呈杆状，菌落表面粗糙不透明，有褶皱，污白色或微黄色，菌落不规则圆形。

3、菌落计数

3.1、稀释度的选择

3.1.1、应选择平均菌落在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。

3.1.2、若有两个稀释度。其生长的菌落数均在30-300之间，则视两者之间如何来决定若其比小于或等于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的数字。

3.1.3、若所有稀释度的平均菌落数均大于300。则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

3.1.4、若所有稀释度平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

3.2、菌落计数及鉴别

3.2.1、根据被检产品的菌种的菌落特征与杂菌区分开来。必要时进行革兰氏染色或芽孢染色，显微镜下观察。有效枯草芽孢杆菌菌落以外的其他菌落为杂菌菌落数。

3.2.2、应选择平均菌落在30-300之间的稀释度的平板，随机挑取5个目标菌落按《伯杰氏细菌系统鉴定手册》第八版、《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定。若结果符合表1特征：

表1

则可以判定该菌落为有效枯草芽孢杆菌菌落。

4、计算：

枯草芽孢杆菌活菌数(CFU/mL)＝同一稀释度三个平板菌落平均数×稀释倍数×10×n/5-n为有效枯草芽孢杆菌菌数

杂菌率(％)＝杂菌总数/(枯草芽孢杆菌活菌数+杂菌总数)

将本实施例的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂进行检验发现，其每克含活菌数250亿个活菌(芽孢率＞80％)，杂菌率1％。

枯草芽孢杆菌厌氧发酵产乳酸：将产乳酸枯草芽胞杆菌微生物制剂中的枯草芽孢杆菌芽孢接入麸皮固体培养基，接种量为重量百分比：2-4％。温度30-40℃，厌氧培养40-70小时。将经过上述厌氧发酵的发酵固形物溶于水中，加热至60～100℃，于离心机中5000rpm离心10～15min。取上清液用L-乳酸脱氢酶法测定L-乳酸含量，测得L-乳酸含量达1.0g/L以上。

将此产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂经55～60℃真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。

实施例2：

从枯草芽孢杆菌的冻干种上挑取一环菌体接种至牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面培养基中，37℃培养12小时；再将试管斜面种子转接到牛肉膏蛋白胨琼脂茄子瓶斜面培养基中，37℃培养30小时，经检测，其80％以上的菌体形成芽孢。用无菌水将茄子瓶上成熟菌泥刮洗下来，装入250ml三角瓶，振荡使菌体均匀，形成种子培养液，其浓度为2.0×10⁹cfu/ml。所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方为：每升含有蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂15g～20g，余量为水，pH7.2～7.4，121℃高压灭菌20min。

将种子培养液以3％的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率350rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间为16个小时，制成一级种子液；将一级种子液以10％的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率150rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间为30小时，经检测菌体已经达到对数生长期，由此得到二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基为，每升含有MgSO₄ 0.4g，KH₂PO₄3g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 10g，蛋白胨5g，牛肉膏10g，余量为水，pH7.4，将上述物质溶于水中，再121℃高压灭菌20min。

接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积：25m²，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级种子液以4％的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为：3次换气次数/小时，温度30～40℃，湿度为80～90％的条件下培养72小时，培养期间每隔5小时翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂。所述的麸皮固体培养基，每千克含有麸皮480g，硫酸铵5g，氯化铵5g，水510g。其配置方法为将氯化铵和硫酸铵先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机，压力，温度分别为：1.05～1.3Kg/cm³，121～125℃条件下，灭菌30～40min，冷却至40～50℃分装浅盆，每盆5公斤，备用。

按照实施例1的方法，将本实施例的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂进行检验发现，其每克含活菌数200亿个活菌(芽孢率＞80％)，杂菌率0.5％。

枯草芽孢杆菌厌氧发酵产乳酸：将产乳酸枯草芽胞杆菌微生物制剂中的枯草芽孢杆菌芽孢接入麸皮固体培养基，接种量为重量百分比：2-4％。温度30-40℃，厌氧培养40-70小时。将经过上述厌氧发酵的发酵固形物溶于水中，加热至60～100℃，于离心机中5000rpm离心10～15min。取上清液用L-乳酸脱氢酶法测定L-乳酸含量，测得L-乳酸含量达1.0g/L以上。

将此产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂经55～60℃真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。

实施例3：

从枯草芽孢杆菌的冻干种上挑取一环菌体接种至牛肉膏蛋白胨琼脂试管斜面培养基中，37℃培养16小时；再将试管斜面种子转接到牛肉膏蛋白胨琼脂茄子瓶斜面培养基中，37℃培养24小时，经检测，其80％以上形成芽孢。用无菌水将茄子瓶上成熟菌泥刮洗下来，装入250ml三角瓶，振荡使菌体均匀，形成种子培养液，种子液中菌体浓度为5.0×10⁸cfu/ml。所述的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方为：每升含有蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂15g～20g，余量为水，pH7.2～7.4，121℃高压灭菌20min。

将种子培养液以4％的接种量转入装有一级发酵培养基的30L种子罐中进行发酵培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间为12个小时，经检测表明菌体已经到达对数生长期，制成一级种子液；将一级种子液以2％的接种量，转接入装有二级发酵培养基的300L发酵罐中进一步扩大培养，装液量70％，发酵温度37±1℃，搅拌速率200rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间为12小时，经检测表明菌体已经达到对数生长期，由此得到二级种子液。所述的一级和二级发酵培养基为，每升含有MgSO₄ 1g，KH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 3g，NaCl 3g，蛋白胨20g，牛肉膏3g，余量为水，pH7.0，将上述物质溶于水中，再121℃高压灭菌20min。

接种前，先打开培养房的臭氧发生器以及紫外灯开关，培养房面积：25m²，消毒30min，制备无菌环境，在此无菌环境中将二级发酵液以5％的接种量接种到麸皮固体培养基中，混合均匀，控制麸皮固体培养基中的通风量为：6换气次数/小时，温度30～40℃，湿度为80～90％的条件下培养66小时，培养期间每隔4小时翻动麸皮固体培养基料一次，由此而制得产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂。所述的麸皮固体培养基，每千克含有麸皮600g，硫酸铵1g，氯化铵5g，水394g。其配置方法为将氯化铵和硫酸铵先用水溶再与其余固体原料混合，搅拌均匀。然后在旋转蒸煮锅或蒸饭机，压力，温度分别为：1.05～1.3Kg/cm³，121～125℃条件下，灭菌30～40min，冷却至40～50℃分装浅盆，每盆5公斤，备用。

按照实施例1的方法，将本实施例的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂进行检验发现，其每克含活菌数220亿个活菌(芽孢率＞80％)，杂菌率2％。

枯草芽孢杆菌厌氧发酵产乳酸：将产乳酸枯草芽胞杆菌微生物制剂中的枯草芽孢杆菌芽孢接入麸皮固体培养基，接种量为重量百分比：2-4％，温度30-40℃，厌氧培养30-70小时。将经过上述厌氧发酵的发酵固形物溶于水中，加热至60～100℃，于离心机中5000rpm离心10～15min。取上清液用L-乳酸脱氢酶法测定L-乳酸含量，测得L-乳酸含量达1.0g/L以上。

将此产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂经55～60℃真空干燥处理，包装成成品，检测合格后，作为商品出售。

Claims (3)

1.一种产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)：将活化的、80％以上菌体形成芽孢的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转入无菌水中，形成种子培养液，其浓度为5.0×10⁸cfu/ml～2.0×10⁹cfu/ml；

(2)：将种子培养液以3％～5％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率200～350rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间为8～16个小时，制成一级种子液；

(3)：将一级种子液以2～10％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，搅拌速率150～250rpm，通气量0.8～0.9V/V·min，溶氧浓度85～90％，发酵时间12～30h，使枯草芽孢杆菌生长至对数生长期，制成二级种子液；

(4)：在无菌环境中，将二级种子液以3～5％的接种量接入麸皮固体培养基中，混合均匀，控制通风量为：3～10换气次数/小时，温度30～40℃，湿度80％～90％条件下培养60～72小时，培养期间翻动麸皮固体培养基，由此制备得到产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂；

所述的一级和二级发酵培养基都为：每升含有MgSO₄ 0.4～1.0g、KH₂PO₄ 0.5～3g、K₂HPO₄0.5～3g、NaCl 3～10g、蛋白胨5～20g、牛肉膏3～10g，余量为水，pH7.2±0.3；

所述的麸皮固体培养基为：按总质量分数100％计，由麸皮48％～60％、硫酸铵0.1％～0.5％、氯化铵0.1％～0.5％和水39％～51％组成。

2.根据权利要求1所述的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的将活化的、80％以上形成芽孢的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转入无菌水中是将枯草芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基试管斜面，37℃培养12～16小时，然后再接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基茄子瓶斜面，37℃培养至80％以上菌体形成芽孢时，再转入无菌水中。

3.根据权利要求1所述的产乳酸枯草芽孢杆菌微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的培养期间翻动麸皮固体培养基是每隔3～5小时翻动一次。 

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