CN102876618B

CN102876618B - 一种低温沼气固体复合促进剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102876618B
Application number: CN201210403782.4A
Authority: CN
Inventors: 陈竞; 冯蕾; 杨新平; 马彩雯; 史慧锋; 唐娴; 秦新政; 王国强
Original assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2012-10-22
Filing date: 2012-10-22
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2032-10-22
Also published as: CN102876618A

Abstract

本发明公开一种低温沼气固体复合促进剂及其制备方法，选用短小芽孢杆菌CICC 10440、乳酸链球菌CICC 20711、假单胞菌（Pseudomonassp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoeaagglomerans）CGMCC No.4765,分别通过纯化复壮，并获得新鲜的纯培养发酵液按质量比1:1:1:1比例混匀，将混合液再与等质量的豆粕和麸皮混合拌匀,豆粕和麸皮按重量比1：1混合,将上述混合物摊放于阴凉干燥环境中阴干，然后添加6%-36%的三氯化铁和1.2%-7.2%的氯化镍充分拌匀，制备获得低温沼气固体复合促进剂，适合低温沼气应用，具有广泛的应用价值。

Description

一种低温沼气固体复合促进剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体说，涉及一种用于提高以牛羊粪及秸秆为原料在低温条件下产沼气水平的固体复合菌剂及其制备方法的技术领域。

背景技术

沼气属于地面生物质可再生能源，一般含甲烷（CH₄）60%-70%，二氧化碳(CO₂)25%-40%，H₂S、N₂、CO、H₂等约占5%，主要是通过细菌发酵使植物秸秆和牲畜粪便的有机物还原成气体；沼气热效率比较稳定，使用方便，其技术经济性仅次于液化石油气；沼气的制备主要是通过细菌发酵使植物秸秆和牲畜粪便的有机物还原成气体的厌氧发酵过程。

但由于目前我国大面积推广的户用沼气池几乎全部采用的是常温发酵模式，沼气池的产气情况受温度变化的影响很大，而北方地区冬季普遍寒冷漫长，沼气的生产存在产气率低、使用率低、原料分解率低、沼气使用综合效益差等问题，甚至在冬季会出现冻裂沼气池。有些地区冬季基本不产气，沼气池利用率50%，原料分解不到30%，沼气使用每年只有3个月。这种状况在一定程度上限制了北方地区沼气的发展。使北方沼气的普及和应用落后于南方地区，为此，在北方寒冷地区如何合理开发利用沼气是一个亟待解决的问题。

目前国内的户用沼气池一般是采取一些可提高沼气池冬季产气率和发挥综合效益的越冬保温增温措施，主要包括：一是日光温室、养猪暖舍、厕所、沼气池“四位一体”模式；二是北方一般采用挖防寒沟，沟内填发酵物的方式对农村户用沼气池进行保温；三是调节发酵原料配比，改善微生物的食料结构；四是在使用管理方面做到勤出料、勤进料，每次进出料量要少，进料要适当添加一些热性原料，如经过沤制的作物秸秆、牛粪、马粪等，以提高发酵物浓度，采取以料补温的方法对沼气池料液升温；以上这些措施虽有一些效果，但仍难以满足需要，难以实现户用沼气池冬季正常产气。

今后通过为沼气池提供水解微生物的优势菌群，强化不产甲烷菌的代谢功能，是提高有机物分解利用率和沼气产量的一项重要措施。

现有技术表明，添加沼气发酵促进剂在沼气发酵中主要可以改善微生物营养状况、加速新陈代谢、改变沼气微生物占优势的种类，使产甲烷丝状菌属（ Methanothrix ）过渡为活性更强的产甲烷八叠球菌属（ Methanosarcina ）；中国专利文件CNl888073(200510077792.3)公开了一种复合菌剂预处理秸秆的沼气发酵方法，复合菌剂为高温单胞菌、枯草芽孢杆菌、木霉菌和地衣芽孢杆菌，向润湿后的秸秆加入复合菌剂和作为秸秆堆沤的氮源碳酸氢铵并补加水，用塑料布覆盖堆沤，然后将堆沤好的秸秆入沼气池，同时加入碳酸氢氨和产甲烷接种物，密闭2—7天，即产沼气；预处理后的秸秆发酵速度和产气速度快，使初始产气时间缩短，产气率提高30％左右，能使所有玉米秸杆、稻草、麦杆等农作物秸秆作为沼气发酵的原料，适用范围广泛。该方法的局限性在于，一是侧重于分解秸秆不能解决用户沼气池冬季产沼气问题；二是该复合菌剂只能在预处理秸秆时使用，不能直接投入沼气池内促沼气生成，使用方法麻烦，限制了其推广。

经国内专利检索，尚未见有适用沼气低温发酵微生物菌剂及推广应用的相关产品的报道。

发明内容

针对现有技术中侧重于分解秸秆不能解决用户沼气池冬季产沼气问题，在冬季复合菌剂只能在预处理秸秆时使用，不能直接投入沼气池内促沼气生成的现有技术现状；本发明目的在于提供一种用于低温沼气生产中适用的高效固体复合微生物菌剂及其制备方法，解决了沼气池冬季产沼气问题，并且能够在冬季里直接投入沼气池内促沼气生成。

本发明的主要技术方案：选用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) CICC10440、乳酸链球菌（Streptococcus lactis）CICC 20711、假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765,分别通过纯化复壮，并获得新鲜的纯培养发酵液，按质量比1:1:1:1比例混匀，将混合液再与等质量的豆粕和麸皮混合拌匀, 豆粕和麸皮按重量比1：1混合,将上述混合物摊放于阴凉干燥环境中阴干，然后添加6%-36%的三氯化铁和1.2%-7.2%的氯化镍（干重百分比），制备获得低温沼气固体复合促进剂。

将上述混合物摊放于阴凉干燥环境中阴干，制成固体复合菌剂，称重后常温保存。

本发明具体提供一种低温沼气固体复合促进剂，通过选用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) CICC10440、乳酸链球菌（Streptococcus lactis）CICC 20711、假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765,分别通过纯化复壮，并获得新鲜的纯培养发酵液，将上述四种菌的纯培养发酵液按质量比1:1:1:1比例混匀，将混合液再与等质量的豆粕和麸皮混合拌匀, 豆粕和麸皮按重量比1：1混合,将上述混合物摊放于阴凉干燥环境中阴干，然后添加6%-36%的三氯化铁和1.2%-7.2%的氯化镍充分混匀，制备获得低温沼气固体复合促进剂。

本发明采用购自中国工业微生物保藏管理中心的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)10440 和乳酸链球菌（Streptococcus lactis）20711，本领域技术人员可以通过公众途径获得。

本发明采用的假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764。通过从羊粪沼气发酵反应器中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株产表面活性剂较高的菌株，编号为R1，菌落呈扩散状生长，半透明，最佳生长温度28℃，短杆状，革兰氏染色阴性；可在添加1%甲醇的培养基上生长。经形态、微生物学分类和16S rDNA特征序列分析鉴定，属于假单胞菌( Pseudomonas sp. )。通过对菌株发酵条件及酶学特性进行研究，结果表明：R1菌株的最佳生长培养基为PR培养基，在28℃，150rpm，培养48h，其能够产生一种生物表面活性剂。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》（《Bergey,s Manual of Systematic Bacterio-logy》）第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号为R1菌株为假单胞菌中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年 04 月 14 日，保藏号是CGMCC No.4764。经过16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为 R1的菌株为假单胞菌（Pseudomonas sp.），以下简称假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764。

同时，本发明采用的成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765。通过从羊粪沼气发酵反应器中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出一株产2，3丁二醇较高的菌株，编号为R4，菌落呈边缘整齐，表面较湿润；革兰氏阳性菌，短杆状，无芽孢，无荚膜；最佳生长温度28℃，柠檬酸盐利用试验、明胶水解试验、油脂水解、淀粉水解，尿素酶试验、硫化氢的产生试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验、甲基红试验结果均为阴性；已酰甲基甲醇（V-P）试验阳性；利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，乳糖产酸，利用淀粉产碱。经形态、微生物学分类和16S rDNA特征序列分析鉴定，属于成团泛菌（ Pantoea agglomerans ）。经摇瓶发酵条件优化试验研究。结果表明：R4菌株的最佳生长培养基为R4F培养基，28℃，150rpm，培养48h，其能够产生一种生物表面活性剂。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》（《Bergey,s Manual of Systematic Bacterio-logy》）第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对菌株进行形态学测定，生理生化检测、G+C含量测定，确定编号为R4菌株为成团泛菌中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2011年 04 月 14 日，保藏号是CGMCC No.4765。经过16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明，编号为R4菌株为成团泛菌（Pantoea agglomerans），以下简称成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765。

本发明提供的上述低温沼气固体复合促进剂可直接应用于沼气池；料液温度保持在大于15℃，以牛羊粪便为主要原料的沼气池，比不加菌剂的提高 30%-50％以上。

本领域熟知，沼气发酵的生物学过程由多菌种联合作用，可分为三个阶段，即水解阶段、产酸阶段、产气阶段。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：

本发明提供的低温沼气固体复合促进剂的使用方法简单，而且使用具有长效性；由于沼气池常年可以使用，每户每年平均可节省几个月的生活用煤；本发明对加该低温沼气固体复合促进剂后的沼渣测定结果表明，沼渣中氮、磷、钾及有机质含量都比较高，是一种很好的有机肥料，特别是对纤维素类农作物秸秆分解的微生物菌剂的制备；以及利用此低温沼气固体复合促进剂作为接种菌剂，提供对农作物秸秆进行分解处理，加快发酵产沼气的应用方法；同时也可以用于对其它有机固体废物进行生物处理产沼气。

料液温度保持在大于15℃，以牛羊粪便为主要原料的沼气池，比不加菌剂的提高 30%-50％以上。

附图说明

图1 显示为5L柱羊粪沼气低温产气实验结果图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要试剂：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、淀粉、牛肉膏、蔗糖、Na₂HPO₄、NaCL、MgSO4·7H₂O、K₂HPO4、FeSO₄7H₂O、MnSO₄·H₂O、NaNO₃。

主要仪器：5升及10升发酵系统、摇床、PCR扩增仪、冷冻离心机、显微镜、生化培养箱、分析天平、超净工作台。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：低温沼气固体复合促进剂的制备

本发明用于低温沼气固体复合促进剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）选取短小芽孢杆菌CICC10440、乳酸链球菌CICC20711、假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765,分别纯化复壮，并获得新鲜的纯培养发酵液。

（2）将步骤（1）四种纯培养发酵液按质量比1:1:1:1比例混匀，制成液体复合微生物菌剂。

（3）将步骤（2）液体复合菌剂与等质量的豆粕和麸皮混合拌匀, 豆粕和麸皮按重量比1：1混合。

（4）将步骤（3）制备的混合物摊放于阴凉干燥环境中阴干。

（5）将6%-36%的三氯化铁和1.2%-7.2%的氯化镍充分混合后加入步骤（4）中制备获得低温沼气固体复合促进剂。

（6）将步骤（5）低温沼气固体复合促进剂称重后常温保存。

本发明选取的短小芽孢杆菌CICC10440、乳酸链球菌CICC20711、假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765分别纯化复壮，并获得新鲜的纯培养发酵液；将上述四种菌的纯化复壮获得纯培养发酵液过程中的工艺及培养条件采用本领域常见培养方法获得。

实施例二：用于沼气低温发酵的固体复合菌剂的制备

将短小芽孢杆菌CICC10440、乳酸链球菌CICC20711、假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765四种菌的原始斜面菌株为出发，分别于LB平板上划线分离得单菌落，挑取健壮典型的单菌落转接斜面复壮，分别活化斜面转接液体摇瓶，于30度200转培养24小时，在10升全自动发酵罐中装料7升，灭菌后接种液体摇瓶，48小时后镜检无污染，下罐，得7升菌液；同法获得另外两株菌的菌液，混合共计28升，称取28千克豆粕和麸皮于场地中间制堆，豆粕和麸皮按各14千克混合，一边淋撒上述混合液一边拌料，直至混合液被均匀充分吸收，摊开，每天翻料一次，15天后完全干透，称取1680克-10080克的三氯化铁和336克-2016克的氯化镍研碎后充分混匀于上述混合物中，称重包装，于低温干燥条件下保存，备用，使用前混合均匀即可。

短小芽孢杆菌CICC10440采用蛋白胨 5克牛肉膏 3克,氯化钠 5克,琼脂15克，蒸馏水 1000毫升作为培养基，调pH至7.0,培养芽孢杆菌时，加入5mg MnSO₄.H₂O则有利于产生芽孢。

乳酸链球菌CICC20711采用酪蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母粉 5.0g，葡萄糖 5.0g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二胺 2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂15.0 g，蒸馏水 1.0L作为培养基，pH6.8。

假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764采用LB液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种200毫升接种至10升PR培养基中；发酵温度为28℃，并用NH₄OH 28%溶液将pH恒定调节至6-8，优选6.8；搅拌速率为400 rpm，通气量设定为0.4（V/V）；当生物量的浓度达到10g/L-40g/L时停上发酵。

成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765采用R4F液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种250毫升接种至10升R4F培养基中；发酵温度为28℃，并用NH₄OH 28%溶液将pH恒定调节至6-8；搅拌速率为100 rpm，通气量设定为0.2（V/V）；当生物量的浓度达到10g/L-30g/L时停上发酵。

R4F培养基：每1000mL蒸馏水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；0.05克MgSO4·7H₂O；0.5克K₂HPO4；0.05克FeSO₄·7H₂O；0.05克MnSO₄·H₂O；20克蔗糖；18-20克琼脂粉。

实施例三：低温沼气固体复合促进剂应用于5升沼气发酵

称取1.5千克粉末状羊粪，投入5升沼气发酵装置，加水3.5升，混匀，密封，温度在10℃-25℃条件下，七天后开始收集产气，于100天后产气量开始下降时，投加2.5克上述实施例低温沼气固体复合促进剂，混匀，继续检测产气量，同时设空白对照组；产气变化情况参见附图1所示。

称取1.5千克粉末状羊粪，投入5升沼气发酵装置，加水3.5升，混匀，密封，七天后开始收集产气，于100天后产气量开始下降时，投加2.5克上述固体复合菌剂，混匀，继续检测产气量，同时设空白对照组。产气变化情况如附图1所示。

实施例四：低温沼气固体复合促进剂应用于10方沼气发酵

冬季15℃-20℃气温条件下，沼气池温度于10m³农户家用水压式沼气池现场，以采用上述实施例获得的低温沼气固体复合促进剂5千克，用10公斤温水复溶搅匀,从进料口投加入池，再由出料口取出50公斤发酵液从进料口冲入池内，将发酵液搅匀，其他维护管理如常，记录投加复合菌剂之后3个月的出气量累计5.4-7.2方，相比以往3个月平均值1.8方-3.2方，产气量提高了40%以上。

Claims

1.一种低温沼气固体复合促进剂的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：通过选用短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) CICC10440、乳酸链球菌（Streptococcus lactis）CICC 20711、假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764和成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765,分别通过纯化复壮，并获得新鲜的纯培养发酵液，将上述四种菌的纯培养发酵液按质量比1:1:1:1比例混匀，将混合液再与等质量的豆粕和麸皮混合拌匀, 豆粕和麸皮按重量比1：1混合,将上述混合物摊放于阴凉干燥环境中阴干，然后添加6%-36%的三氯化铁和1.2%-7.2%的氯化镍充分拌匀，制备获得低温沼气固体复合促进剂；

所述的短小芽孢杆菌CICC10440采用蛋白胨 5克，牛肉膏 3克,氯化钠 5克，琼脂 15克,蒸馏水 1000毫升作为培养基，调pH至7.0,培养芽孢杆菌时，加入5mg MnSO₄.H₂O；

乳酸链球菌CICC20711采用酪蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母粉 5.0g，葡萄糖 5.0g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二胺 2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂 15.0g，蒸馏水 1.0L作为培养基，pH6.8；

假单胞菌（Pseudomonas sp.）CGMCC No.4764采用LB液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种200毫升接种至10升PR培养基中；发酵温度为28℃，并用NH₄OH 28%溶液将pH恒定调节至6-8；搅拌速率为400 rpm，通气量设定为0.4（V/V）；当生物量的浓度达到10g/L-40g/L时停上发酵；

成团泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC No.4765采用R4F液体培养基培养24小时制备菌种，取菌种250毫升接种至10升R4F培养基中；发酵温度为28℃，并用NH₄OH 28%溶液将pH恒定调节至6-8；搅拌速率为100 rpm，通气量设定为0.2（V/V）；当生物量的浓度达到10g/L-30g/L时停上发酵；

所述的R4F培养基：每1000mL蒸馏水中加入2克牛肉膏；3克蛋白胨；0.05克MgSO4·7H₂O；0.5克K₂HPO4；0.05克FeSO₄·7H₂O；0.05克MnSO₄·H₂O；20克蔗糖； 18-20克琼脂粉。

2.一种如权利要求1所述低温沼气固体复合促进剂的制备方法获得的低温沼气固体复合促进剂。

3.如权利要求2所述的固体复合促进剂在冬季沼气池中应用。