CN106811429B

CN106811429B - 一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料

Info

Publication number: CN106811429B
Application number: CN201510870125.4A
Authority: CN
Inventors: 解林奇; 白秀梅; 宋潇; 吴栋
Original assignee: ZHANGZHOU DABEINONG AGRICULTURE ANIMAL HUSBANDRY TECHNOLOGY CO LTD; Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: ZHANGZHOU DABEINONG AGRICULTURE ANIMAL HUSBANDRY TECHNOLOGY CO LTD; Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-12-02
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2035-12-02
Also published as: CN106811429A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌新菌株DZS11，其保藏号为CGMCC No.11261。该菌株耐酸、耐胆盐，具有很高的产酶能力，特别是在淀粉酶能力测定中，与其他菌株相比具有明显的优势，通过动物实验发现其能有效促进畜禽的生产性能，可作为饲料添加剂和发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

Description

一株枯草芽孢杆菌菌株及其饲料添加剂的应用与饲料

技术领域

本发明属于微生物益生菌应用技术领域，涉及一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)及其饲料添加剂的应用。

背景技术

在畜禽养殖业中，抗生素等抗菌药物能有效的减少畜禽的发病率，提高畜禽等动物的生长效率而被广泛应用在畜禽的饲料中。同时由于人类长期滥用抗生素等药物，也严重影响了畜禽产品的发展。例如耐药性病原菌增加，畜禽产品的药物残留异常严重等问题。为食品安全和消费者的身体健康造成了一定程度的危害。对此欧盟已全面禁止饲料中使用抗生素促生长饲料添加剂。为了应对这些问题，采用益生菌微生物制剂来替代抗生素已成为当前畜禽养殖的热点。

因此寻求安全、无残留的抗生素替代品迫在眉睫。通过研究发现益生菌饲料添加剂是一种十分理想的抗生素替代品，而且益生菌饲料添加剂具有天然无公害、无污染、质量稳定及效果明显等优点。特别是芽孢杆菌作为益生菌，其在生长代谢过程能产生多种酶，并且某些优良菌株还具有抑制有害菌的作用。但是，目前益生菌的研究和开发最关键的问题是优良菌株的选育，特别是优良芽孢杆菌的分离和筛选。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一株优良特性的枯草芽孢杆菌及其在畜禽养殖中的应用。

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌，该菌株从仔猪粪便中分离经过初筛复筛得到，在LB培养基上菌落形态为菌落乳白色，圆形，湿润，表面光滑，边缘不整齐，不透明。菌体杆状，单个或成短链排列存在，革兰氏染色阳性菌株，产芽孢。

利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16s rDNA PCR扩增后鉴定，经NCBI序列比对结果相似性最高(100％)的是枯草芽孢杆菌，故分子鉴定DZS11为枯草芽孢杆菌。

将该菌株命名为枯草芽孢杆菌DZS11(Bacillus subtilis DZS11)，于2015年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.11261。

本发明还提供包含该枯草芽孢杆菌的菌剂。

在本发明一个实施方案中，所述菌剂为菌粉，所述菌粉还含有保护剂和/或载体。

其中，所述菌剂的制备方法如下：将所述枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到发酵液，所得菌液与保护剂和载体混合，在进风温度170-200℃，出风温度60-90℃的条件下，高温喷雾干燥得到菌剂。

本发明还提供一种所述枯草芽孢杆菌的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述枯草芽孢杆菌种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度35-40℃，转速200-300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。

其中，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：玉米粉0.5％、豆饼粉1％、蔗糖0.4％、鱼粉0.6％、碳酸钙0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.025％、硫酸锰0.025％。

本发明还提供了含有所述的枯草芽孢杆菌的饲料添加剂。

其中，所述枯草芽孢杆菌的的添加量为1×10^8-11CFU/g。

本发明的枯草芽孢杆菌在用于饲料添加剂中，主要用于畜、禽或水产养殖的饲料添加剂，如：鸡、鸭、猪、牛、羊和鱼等的饲料添加剂。

本发明还提供包含所述枯草芽孢杆菌的预混料或配合料。

本发明的枯草芽孢杆菌DZS11，该菌株耐酸、耐胆盐，具有很高的产酶能力，特别是在淀粉酶能力测定中，与其他菌株相比具有明显的优势，通过动物实验发现其能有效促进畜禽的生产性能，可作为饲料添加剂和发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1枯草芽孢杆菌DZS11的筛选

1、初筛

采集仔猪粪便样品10份，分别称取10g土样，加入90mL无菌水制成菌悬液，经过80℃水浴中处理20min，于180r/min振荡30min，梯度稀释至合适梯度，涂布于LB培养基上，培养获得86株疑似芽孢杆菌。

牛奶培养基(蛋白酶初筛用)：5g脱脂牛奶溶于50ml蒸馏水中；1.5g琼脂溶于50ml蒸馏水中，两液分别灭菌，待冷至45－50℃时，将两液混匀倒平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上混合倒板，过夜待用。配制该培养基时，切勿将牛奶和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。

淀粉水解平板(淀粉酶初筛用)：LB培养基，其中加入0.2％的可溶性淀粉，灭菌后倒平板。

生理盐水的配置方法是：0.85％的氯化钠，高压蒸汽灭菌后备用。

人工胃液的配置方法是：1％胃蛋白酶，0.85％的氯化钠，用盐酸调节pH到2.0，过滤除菌备用。

LB固体培养基制作方法是：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，琼脂2％，pH7.0，高压蒸汽灭菌后备用。

LB液体培养基制作方法是：蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母膏5g，pH7.0，高压蒸汽灭菌后备用。

人工胆盐的配置方法是：在LB液体培养基中添加0.3％的猪胆盐，高压蒸汽灭菌后备用。

2、复筛

(1)平板菌落计数法检测DZS11菌粉的活菌数约为10¹⁰CFU/g。

(2)菌株DZS11产淀粉酶能力测定

将通过初筛过程得到的目标菌株点接于淀粉水解平板，37℃培养24h，加入路哥氏碘液染色1min后观察透明圈直径与菌体直径比，初步测定淀粉酶活力。将淀粉酶较高菌株接种于发酵培养基37℃振荡培养24-48h，取2到3个时间点的发酵培养液离心取上清液检测淀粉酶和糖化酶活力，对菌株的淀粉酶活力进行复筛。

淀粉酶活力测定方法用GB/T 18932.16-2003进行测定。

经过初筛获得一株透明圈直径与菌体直径比最大的菌株，命名为DZS11。经过淀粉酶活力定量测定菌株DZS11的淀粉酶活力为3285.87U(淀粉酶在40℃下每ml菌液1h内水解1ml的1％淀粉，定义为1个淀粉酶活力单位)。

(3)菌株DZS11产蛋白酶能力测定

将通过初筛过程得到的目标菌株点接于牛奶平板，37℃培养24h，菌落周围出现透明圈，直接观察透明圈直径与菌体直径比，初步测定蛋白酶活力。将蛋白酶较高菌株接种于发酵培养基37℃振荡培养24-48h，取2到3个时间点的发酵培养液离心取上清液检测蛋白酶活力，对菌株的蛋白酶活力进行复筛。

蛋白酶活力测定方法用GB/T 28715-2012进行测定。

同时经过蛋白酶初筛比较发现，DZS11菌株的蛋白酶活力也比较高。经过蛋白酶活力定量测定菌株DZS11的中性蛋白酶活力为65.9U(蛋白酶在pH7.2时，40℃下每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位)，酸性蛋白酶活力为41.6U(蛋白酶在pH3.0时，40℃下每分钟水解酪蛋白产生lug酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位)。此菌株和实验室其他有效益生菌株及某些国内外产品分离菌株(国内3-1是从蔚蓝某产品分离得到的，国外K1是从科汉森某产品分离得到的)的产淀粉酶活力及产蛋白酶活力比较如下表1所示：

表1：部分实验室枯草芽孢杆菌菌株酶活测定

(4)人工胃液的耐受能力测定

将1g DZS11菌粉溶于9ml灭菌的生理盐水中，振荡混匀后，用稀释涂布平板法计数。取上述菌液1ml加入9ml人工胃液中，37℃静置2小时，稀释涂布平板法计数，残存活菌浓度与原菌浓度之比为90.2％，从上述实验可以看出该菌能较好地在人工胃液中生存。

(5)人工胆盐的耐受能力测定

将1g DZS11菌粉溶于9ml灭菌的生理盐水中，振荡混匀后，用稀释涂布平板法计数。取上述菌液1ml加入9ml人工胆盐中，37℃静置2小时，稀释涂布平板法计数，残存活菌浓度与原菌浓度之比为91.6％，从上述实验可以看出该菌能较好地在人工胆盐中生存。

实施例3枯草芽孢杆菌DZS11的发酵和菌粉的制备

枯草芽孢杆菌DZS11的发酵：所用发酵培养基配制为：玉米粉0.5％、豆饼粉1％、蔗糖0.4％、鱼粉0.6％、碳酸钙0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.025％、硫酸锰0.025％。按比例配制成发酵液，然后调节pH到7.2。经121℃30min灭菌，降温至37℃，向其中接入菌龄为16h的种子液，接种量为3％，37℃，保持转速300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05。培养至18h为发酵终点，放罐，得到枯草芽孢杆菌DZS11活菌数为6.21×10⁹CFU/mL。

将发酵液中加入喷干保护剂(甘油0.8％，谷氨酸钠0.2％，玉米淀粉19％)，再经高温喷干得到枯草芽孢杆菌菌粉，活菌数约为45亿/g。

实施例5枯草芽孢杆菌DZS11菌液耐热性能测定

枯草芽孢杆菌经30L发酵罐发酵18h后，对发酵液做若干处理后，分别测定其淀粉酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。测定结果如表2所示：

表2枯草芽孢杆菌DZS11酶活耐热结果

通过实验结果可以发现，发酵液在进风温度185℃，出风温度80℃的条件下喷干后，三种酶活相比于原发酵液基本上没有变化，说明喷干工艺对酶活基本上不会造成损失。其酸性蛋白酶，无论各种条件下处理，较原发酵液下降的都不多，这说明其酸性蛋白酶对热稳定性较强。另外，80℃5min处理后，其淀粉酶损失29％，中性蛋白酶损失67％。80℃10min处理后，其淀粉酶损失77％，中性蛋白酶损失72％。90℃处理后，淀粉酶损失量已在90％以上，中性蛋白酶损失基本上保持在73％。

实施例5枯草芽孢杆菌DZS11作为饲料添加剂在鸡上的应用

采购1日龄罗氏450白羽肉公鸡，分为两个实验组和一个对照组，每个处理组10个重复，每个重复15只鸡，试验期为35天，其中对照组饲喂普通商品日粮，实验组1饲喂添加了枯草芽孢杆菌DZS11菌粉的普通商品日粮，添加剂量为1×10⁹CFU/Kg；实验组2饲喂添加了国内的(3-1)枯草芽孢杆菌菌粉的普通商品日粮，添加剂量为1×10⁹CFU/Kg；添加测量试验过程中采食量、料重比、体重的变化情况，试验结果如表3所示：

表3肉鸡生产性能统计结果

由表3数据分析可知，试验期内，实验组1肉鸡料肉比比对照组降低0.07，与对照组差异显著(P<0.05)。并且与国内产品分离菌株相比也有明显优势。测试指标中，实验组1日增重、料肉比、育肥指数效果均优于对照组和实验组2。表明饲料中添加的枯草芽孢杆菌DZS11起了很好作用，较好的改善了肉鸡的生产性能，而且降低了养殖成本，从而获得了较好的经济效益。

实施例6枯草芽孢杆菌DZS11作为饲料添加剂在仔猪上的应用

本试验研究了不同芽孢杆菌对断奶仔猪生产性能的影响。选择了国内外市售的两种芽孢杆菌产品，及公司现有芽孢杆菌产品与实验室研发的芽孢杆菌新产品进行了比较。

采用360头40±3日龄杜洛克×长白×大约克健康断奶仔猪随机分到6个处理中，每个处理5个重复，每个重复12头猪，每个栏作为一个重复。

试验采用完全随机化设计，共设6个处理组，分别为对照组，K组(国外产品)，W组(国内产品)，D组(公司现有产品)，7组(DZS11菌粉)和M组(D和7复合)。试验进行28天。

添加芽孢杆菌与不添加芽孢杆菌的日粮均由河南确山大北农饲料有限公司生产。芽孢杆菌添加量平均为1×10⁹cfu/kg。日粮粗蛋白质含量为19.5％(实测值)。

试验猪饲养于仔猪舍中，水泥地面，早中晚各加一次料，观察各栏仔猪采食量，采取区别加料的策略，保证各种采食量的仔猪都能完全自由采食和饮水。

按照常规程序和方法进行驱虫、免疫；

专人管理，各组均给予相同的饲养管理和环境条件(温度、湿度)；

试验猪发病，应在不影响试验结果的条件下依常规处理。

试验猪在试验开始和试验末时，早晨8:00空腹称重(前一天20:00断料)，然后按下式计算日增重：

平均日增重ADG(kg)＝[末栏重(kg)-始栏重(kg)]/[每栏仔猪头数×饲养天数(d)]

以栏为单位记录每天的投料量与剩料量，求出试验期间每栏总的投料量与剩料量，然后计算日采食量：

日采食量ADFI(kg)＝[投料量(kg)-剩料量(kg)]/[每栏仔猪头数×饲养天数(d)]

饲料转化率F/G＝ADFI(kg)/ADG(kg)

数据采用SAS 8.0程序GLM过程进行统计分析，多重比较用邓肯法(Duncan)，以p<0.05为显著水平，P<0.01为极显著。

由表4可知，与对照组相比，日粮中添加不同的芽孢杆菌不同程度地降低了断奶仔猪日增重、个体重和日采食量。其中7组(DZS11菌粉)与对照组相比个体重无显著差异，且降低了仔猪料重比0.08(1.68VS 1.76)，提高饲料转化率4.5％。

表4不同芽孢杆菌对断奶仔猪生产性能的影响

项目	CK	K	W	D	7	M	SEM	P值
									日增重ADG,g	321.1	283.5	303.6	290.7	309.4	299.0	14.3	0.904
日采食量ADFI,g	563.7	509.8	504.3	532.2	541.2	535.9	19.3	0.877
									饲料转化率FCR	1.76	1.79	1.76	1.77	1.68	1.78	0.051	0.598
个体重,kg	19.7	18.6	19.2	18.8	19.3	19.0	0.417	0.982

由表5可知，每吨饲料添加80g的7组(DZS11菌粉)芽孢杆菌，饲料成本增加3.2元。

表5成本计算

项目	7组
		添加量g/t)	80
菌粉价格(元/kg)	40
		增加成本(元/t)	3.2

由表6可知，与对照组相比，饲喂7组(DZS11菌粉)芽孢杆菌，每头仔猪试验期间节约饲料成本4.2元(106.4VS 110.6)。

表6节约成本

项目	对照组	7组
			耗料(kg/头)	15.8	15.2
饲料价格(元/kg)	7	7.0032
			饲料成本(元/头)	110.6	106.4

饲喂实验室研发的7组(DZS11菌粉)芽孢杆菌新产品降低仔猪料肉比0.08，提高饲料转化率4.5％。本试验结果表明7组(DZS11菌粉)芽孢杆菌新产品优于现有及市售的两种芽孢杆菌产品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，其保藏号为CGMCC No.11261。

2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，其为菌粉，所述菌粉还含有保护剂和/或载体。

4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，其制备方法如下：将所述枯草芽孢杆菌进行发酵培养得到发酵液，所得发酵液与保护剂和载体混合，在进风温度170-200℃，出风温度60-90℃的条件下，高温喷雾干燥得到菌剂。

5.一种发酵权利要求1所述菌株的方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述枯草芽孢杆菌种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度35-40℃，转速200-300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：玉米粉0.5％、豆饼粉1％、蔗糖0.4％、鱼粉0.6％、碳酸钙0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.2％、硫酸亚铁0.025％、硫酸锰0.025％。

7.含有权利要求1所述菌株的饲料添加剂。

8.如权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的添加量为1×10⁸ ^-11CFU/g。

9.含有权利要求1所述菌株的预混料或配合料。