CN110804574A - 一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法 - Google Patents
一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110804574A CN110804574A CN201911241361.4A CN201911241361A CN110804574A CN 110804574 A CN110804574 A CN 110804574A CN 201911241361 A CN201911241361 A CN 201911241361A CN 110804574 A CN110804574 A CN 110804574A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus coagulans
- fermentation
- culture
- culture medium
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 74
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 74
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 title claims abstract description 56
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 20
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 14
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 14
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 12
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 9
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 9
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 9
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 claims description 5
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940097265 cysteamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 5
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 5
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 241000193833 Bacillales Species 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000003031 feeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，包括如下步骤：1)将凝结芽孢杆菌接入选择培养基中培养得到单菌落，进行种子培养，并做保藏；2)将保藏的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基中，37℃恒温培养箱培养2～3天，取出至于4℃冰箱保存备用；3)从斜面培养基培养的凝结芽孢杆菌中挑一环菌泥接入种子培养基中进行扩大培养；4)将扩大培养后的种子液接入发酵培养基中进行分批补料发酵培养，即得高浓度凝结芽孢杆菌发酵液。该发明通过对培养基优化以及发酵过程优化，得到了高浓度发酵菌液，同时发酵液中无不溶性物质，降低了离心难度，便于浓缩，可提供高菌数粉样制剂，降低了生产成本，有助于产品推广，对畜禽健康养殖有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法。
背景技术
微生态制剂，是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂，具有天然无毒、促进宿主健康的作用。
凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），革兰阳性，属于硬（或厚）壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌，其特点在于：1、凝结芽孢杆菌作为一种兼性厌氧菌，在肠道环境下能够代谢产生乳酸，形成酸性环境，抑制病原微生物生长，有益于宿主健康；2、能以芽孢形态存在，耐高温、耐胃酸、耐胆盐、环境抗逆性强；3、提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料重比；4、有效改善断奶仔猪由于应激、过敏反应引起的菌群失调性腹泄；5、无任何毒副作用，使用安全，改善养殖环境。凝结芽孢杆菌兼具乳酸菌类和芽孢杆菌类微生态制剂的优点，由于良好的饲喂效果和加工性能，已列入饲料添加剂名录。
然而，目前市场上凝结芽孢杆菌产品普遍存在菌体含量低、发酵液中固形物含量高后处理成本大，究其原因，还是凝结芽孢杆菌产业发酵水平低、加工过程菌体损失高，影响凝结芽孢杆菌的普及应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有凝结芽孢杆菌产品存在菌体含量低、发酵液中固形物含量高后处理成本大的问题。
为此，本发明提供了一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，包括如下步骤：
1)将凝结芽孢杆菌接入选择培养基中培养得到单菌落，再挑取单菌落于种子培养基上进行种子培养，并做保藏；
2)将保藏的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基中，37℃恒温培养箱培养2～3天，取出至于4℃冰箱保存备用；
3)从斜面培养基培养的凝结芽孢杆菌中挑一环菌泥接入种子培养基中进行扩大培养；
4)将扩大培养后的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分批补料发酵培养，即得高浓度凝结芽孢杆菌发酵液。
进一步的，所述步骤1)中选择培养基由按质量百分比计的如下组分：葡萄糖0.2～1%、蛋白胨1～2%、酵母粉0.5～1%、牛肉膏0.2～0.5%、无水氯化钙0.01～0.1%、氯化钠0.1～0.5%、一水合硫酸锰0.01～0.05%、L-半胱胺盐酸盐0.01～0.05%，余量为水，使用盐酸调pH至5.0～5.5，再加入琼脂粉1.5～2%，115℃灭菌30min制备得到。
进一步的，所述步骤1)中选择培养基培养条件为40～45℃恒温培养箱培养24h。
进一步的，所述步骤1)和步骤3)中种子培养基由按质量百分比计的如下组分：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，余量为水，在115℃条件下灭菌30min制备得到。
进一步的，所述步骤1)中种子培养及步骤3)中扩大培养的条件如下：40℃～45℃、150rpm～200rpm摇床培养8～12h。
所述步骤1)中菌种保藏方法如下：种子培养液加入10%～30%甘油，混匀移入离心管中，1.5mL/支，至于-80℃冰箱保藏。
进一步的，所述步骤2)中斜面培养基由以下方法制备得到：称取1g～10g麸皮，加入90mL水小火煮沸30min～1h，用纱布滤得汁液，定容至100mL，加入1.5%～2%琼脂粉，115℃灭菌30min。
进一步的，所述步骤4)中发酵培养基由按质量百分比计的如下组分：葡萄糖0.5～2%、酵母浸膏1～3%、玉米浆0.1～1%、磷酸二氢钾0.1～0.5%、硫酸锰0.05～0.2%、硫酸镁0.01～0.15%、消泡剂0.005～0.01%，余量为水，使用氢氧化钠溶液调制pH6.8～7.5，115℃灭菌30min制备得到。
进一步的，所述步骤4)中分批补料的补料培养基由葡萄糖2～5%、酵母浸膏0.5～3%，余量为水，115℃灭菌30min制备得到。
进一步的，所述步骤4)中发酵培养条件如下：接种量1～10%，培养温度40～45℃，pH值5.0～7.5，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，风量0.5m3/h～1.5m3/h，搅拌速度100rpm～600rpm，溶氧维持10～50%，pH反弹至5.5～6.5开始补料，培养周期为35～45h。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的这种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法通过对培养基优化以及发酵过程优化，得到了高浓度发酵菌液，同时发酵液中无不溶性物质，降低了离心难度，便于浓缩，可提供高菌数粉样制剂，降低了生产成本，有助于产品推广，对畜禽健康养殖有重大意义。
(2)本发明提供的这种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法中将凝结芽孢杆菌种子经过斜面接种，大大缩短种子液培养时间，同时通过对斜面培养基成分的设计，使得凝结芽孢杆菌在该培养基上形成芽孢，且形成的芽孢可于4℃储存，节约保藏成本。
(3)本发明提供的这种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法中发酵培养基采用可溶性物质，发酵液可经过离心浓缩，相较于传统凝结芽孢杆菌发酵培养基中多使用豆粕、麸皮、淀粉等不溶物作为营养物质，大大降低了后处理干燥成本。
(4)本发明提供的这种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法中发酵培养过程采用分批补料，维持pH在5.0～7.5，使凝结芽孢杆菌一直处于最适生长pH环境中，有利于凝结芽孢杆菌的生长，大大提高了芽孢率。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
本实施例提供了一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，包括如下步骤：
(1)将凝结芽孢杆菌接入选择培养基，40～45℃恒温培养箱培养24h得到单菌落，再挑取单菌落于种子培养基上进行种子培养，并做保藏。
具体的，选择培养基用于凝结芽孢杆菌分离及检测，其成分如下：葡萄糖0.5%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、牛肉膏0.5%、无水氯化钙0.015%、氯化钠0.25%、一水合硫酸锰0.01%、L-半胱胺盐酸盐0.05%，余量为水，使用盐酸调pH至5.0～5.5，再加入琼脂粉1.5%，115℃灭菌30min制备得到。
种子培养基的成分如下：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，余量为水，115℃灭菌30min。单菌落在此种子培养基上于40℃～45℃、150rpm～200rpm摇床培养8～12h。
经种子培养后的种子培养液加入10～30%甘油，混匀移入离心管中，1.5mL/支，至于-80℃冰箱保藏。
(2)将保藏的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基中，37℃恒温培养箱培养2～3天至形成芽孢，取出至于4℃冰箱保存备用，有效期1～3个月。
具体的，斜面培养基的成分如下：称取5g麸皮，加入90mL水小火煮沸30min～1h，用纱布滤得汁液，定容至100mL，加入1.5%琼脂粉，115℃灭菌30min。
(3)从斜面培养基培养的凝结芽孢杆菌中挑一环菌泥接入种子培养基中，于45℃200rpm摇床培养8～10h。其中，种子培养基的成分如下：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，余量为水，115℃灭菌30min。
(4)将上述步骤(3)扩大培养后的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分批补料发酵培养，其中，发酵培养基的成分如下：葡萄糖1%、酵母浸膏1.5%、玉米浆0.5%、磷酸二氢钾0.5%、硫酸锰0.12%、硫酸镁0.15%、消泡剂0.005%，余量为水，使用氢氧化钠溶液调制pH6.8～7.5，115℃灭菌30min制备得到。补料的补料培养基为葡萄糖3%、酵母浸膏2%，余量为水，115℃灭菌30min。
发酵培养具体过程如下：在30L发酵罐中装入18L发酵培养基，115℃灭菌30min，结束后注水降温至40～45℃，以1～10%的接种量接入种子液，初始搅拌速度100rpm～600rpm、初始通气量0.5m3/h～1.5m3/h，开始发酵，pH先下降后反弹，开始维持溶氧在10%以上，pH反弹至5.5～6.5时开始补料，每次补入0.35%补料培养基，补完为止，补料过程中凝结芽孢杆菌会通过自身的代谢途径的转换使发酵pH维持在5.0～7.5，而大量文献及研究表明，凝结芽孢杆菌在此pH环境下有利于其生长，24h左右补料完成，27h培养基中的葡萄糖完全耗尽，凝结芽孢杆菌营养体开始形成芽孢，35h～45h芽孢完全脱落。
使用上述选择培养基检测发酵液中营养体70×108cfu/mL，芽孢68×108cfu/mL，芽孢率达到97%。
将本实施例得到的发酵液经过碟式离心机，离心浓缩4～5倍，得到菌浆，添加20%淀粉，进风温度170℃，出风温度70℃，喷雾干燥，得到高菌数微生态粉样制剂，粉样中营养体2000×108cfu/mL，芽孢1900×108cfu/mL，粉样收率为95%。
实施例2：
本实施例提供的高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其具体过程与实施例1基本一致，所不同之处在于：
选择培养基成分如下：葡萄糖0.2%、蛋白胨2%、酵母粉0.5%、牛肉膏0.5%、无水氯化钙0.1%、氯化钠0.1%、一水合硫酸锰0.03%、L-半胱胺盐酸盐0.05%，余量为水，使用盐酸调pH至5.0～5.5，再加入琼脂粉1.5%，115℃灭菌30min制备得到。
斜面培养基的成分如下：称取1g麸皮，加入90mL水小火煮沸30min～1h，用纱布滤得汁液，定容至100mL，加入1.5%琼脂粉，115℃灭菌30min。
发酵培养基的成分如下：葡萄糖0.5%、酵母浸膏3%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸锰0.2%、硫酸镁0.06%、消泡剂0.005%，余量为水，使用氢氧化钠溶液调制pH6.8～7.5，115℃灭菌30min制备得到。补料的补料培养基为葡萄糖5%、酵母浸膏0.5%，余量为水，115℃灭菌30min。
本实施例检测发酵液中营养体为50×108cfu/mL，芽孢为45×108cfu/mL，芽孢率达到90%。
将本实施例得到的发酵液经过离心浓缩6倍后得到菌浆，添加20%淀粉，进风温度170℃，出风温度70℃，喷雾干燥，得到高菌数微生态粉样制剂，粉样中营养体1500×108cfu/mL，芽孢1350×108cfu/mL，粉样收率为75%。
实施例3：
本实施例提供的高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其具体过程与实施例1基本一致，所不同之处在于：
选择培养基成分如下：葡萄糖1%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、牛肉膏0.2%、无水氯化钙0.01%、氯化钠0.5%、一水合硫酸锰0.05%、L-半胱胺盐酸盐0.01%，余量为水，使用盐酸调pH至5.0～5.5，再加入琼脂粉2%，115℃灭菌30min制备得到。
斜面培养基的成分如下：称取10g麸皮，加入90mL水小火煮沸30min～1h，用纱布滤得汁液，定容至100mL，加入1.5%琼脂粉，115℃灭菌30min。
发酵培养基的成分如下：葡萄糖2%、酵母浸膏1%、玉米浆0.1%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸锰0.05%、硫酸镁0.01%、消泡剂0.01%，余量为水，使用氢氧化钠溶液调制pH6.8～7.5，115℃灭菌30min制备得到。补料的补料培养基为葡萄糖2%、酵母浸膏3%，余量为水，115℃灭菌30min。
本实施例检测发酵液中营养体为80×108cfu/mL，芽孢为75×108cfu/mL，芽孢率达到94%。
将本实施例得到的发酵液经过离心浓缩6倍后得到菌浆，添加20%淀粉，进风温度170℃，出风温度70℃，喷雾干燥，得到高菌数微生态粉样制剂，粉样中营养体1700×108cfu/mL，芽孢1620×108cfu/mL，粉样收率可以达到86%。
对比例1：
本对比例中凝结芽孢杆菌液体发酵方法与上述实施例1的过程基本一致，所不同之处在于：斜面培养基采用传统活化使用的YPD斜面培养基，且在该YPD斜面培养基中需培养3～5天形成芽孢，接入种子培养基中摇瓶需培养12h。经检测，采用本对比例的发酵方法得到的芽孢率为5～10%。
对比例2：
本对比例中凝结芽孢杆菌液体发酵方法与上述实施例1的过程基本一致，所不同之处在于：本对比例中的发酵培养过程中不采用添加补料培养基进行补料连续发酵。经检测，采用本对比例的发酵方法，其发酵液中营养体47×108cfu/mL，芽孢40×108cfu/mL，芽孢率为85%。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将凝结芽孢杆菌接入选择培养基中培养得到单菌落，再挑取单菌落于种子培养基上进行种子培养，并做保藏；
2)将保藏的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基中，37℃恒温培养箱培养2～3天，取出至于4℃冰箱保存备用；
3)从斜面培养基培养的凝结芽孢杆菌中挑一环菌泥接入种子培养基中进行扩大培养；
4)将扩大培养后的种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中进行分批补料发酵培养，即得高浓度凝结芽孢杆菌发酵液。
2.如权利要求1所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中选择培养基由按质量百分比计的如下组分：葡萄糖0.2～1%、蛋白胨1～2%、酵母粉0.5～1%、牛肉膏0.2～0.5%、无水氯化钙0.01～0.1%、氯化钠0.1～0.5%、一水合硫酸锰0.01～0.05%、L-半胱胺盐酸盐0.01～0.05%，余量为水，使用盐酸调pH至5.0～5.5，再加入琼脂粉1.5～2%，115℃灭菌30min制备得到。
3.如权利要求2所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中选择培养基培养条件为40～45℃恒温培养箱培养24h。
4.如权利要求1所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤1)和步骤3)中种子培养基由按质量百分比计的如下组分：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，余量为水，在115℃条件下灭菌30min制备得到。
5.如权利要求4所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中种子培养及步骤3)中扩大培养的条件如下：40℃～45℃、150rpm～200rpm摇床培养8～12h。
6.如权利要求1所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤1)中菌种保藏方法如下：种子培养液加入10%～30%甘油，混匀移入离心管中，1.5mL/支，至于-80℃冰箱保藏。
7.如权利要求1所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤2)中斜面培养基由以下方法制备得到：称取1g～10g麸皮，加入90mL水小火煮沸30min～1h，用纱布滤得汁液，定容至100mL，加入1.5%～2%琼脂粉，115℃灭菌30min。
8.如权利要求1所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤4)中发酵培养基由按质量百分比计的如下组分：葡萄糖0.5～2%、酵母浸膏1～3%、玉米浆0.1～1%、磷酸二氢钾0.1～0.5%、硫酸锰0.05～0.2%、硫酸镁0.01～0.15%、消泡剂0.005～0.01%，余量为水，使用氢氧化钠溶液调制pH6.8～7.5，115℃灭菌30min制备得到。
9.如权利要求7所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤4)中分批补料的补料培养基由葡萄糖2～5%、酵母浸膏0.5～3%，余量为水，115℃灭菌30min制备得到。
10.如权利要求1所述的一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法，其特征在于，所述步骤4)中发酵培养条件如下：接种量1～10%，培养温度40～45℃，pH值5.0～7.5，发酵罐罐压0.03～0.05Mpa，风量0.5m3/h～1.5m3/h，搅拌速度100rpm～600rpm，溶氧维持10～50%，pH反弹至5.5～6.5开始补料，培养周期为35～45h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911241361.4A CN110804574A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911241361.4A CN110804574A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110804574A true CN110804574A (zh) | 2020-02-18 |
Family
ID=69492634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911241361.4A Pending CN110804574A (zh) | 2019-12-06 | 2019-12-06 | 一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110804574A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112048450A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-12-08 | 润盈生物工程（上海）有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌发酵离心上清液重复两次发酵的方法 |
| CN112852680A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-28 | 四川润格生物科技有限公司 | 一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法 |
| CN113005052A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-06-22 | 武汉微康益生菌研究院有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌bc99的保藏方法 |
| CN113930464A (zh) * | 2021-09-22 | 2022-01-14 | 湖北华扬科技发展有限公司 | 一种利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法及其应用 |
| CN115261260A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-11-01 | 漯河微康生物科技有限公司 | 一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法和菌粉制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101412983A (zh) * | 2008-11-20 | 2009-04-22 | 江苏省苏微微生物研究有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌及高密度培养的芽孢制剂的制备及其应用 |
| CN101513257A (zh) * | 2009-03-10 | 2009-08-26 | 黄继红 | 功能性小麦麸皮的发酵生产方法 |
| CN104974966A (zh) * | 2015-07-22 | 2015-10-14 | 江南大学 | 一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法 |
| CN109609432A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-04-12 | 北京好实沃生物技术有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌的产孢方法 |
-
2019
- 2019-12-06 CN CN201911241361.4A patent/CN110804574A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101412983A (zh) * | 2008-11-20 | 2009-04-22 | 江苏省苏微微生物研究有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌及高密度培养的芽孢制剂的制备及其应用 |
| CN101513257A (zh) * | 2009-03-10 | 2009-08-26 | 黄继红 | 功能性小麦麸皮的发酵生产方法 |
| CN104974966A (zh) * | 2015-07-22 | 2015-10-14 | 江南大学 | 一种凝结芽孢杆菌及其高密度发酵方法以及干菌粉制备方法 |
| CN109609432A (zh) * | 2019-01-29 | 2019-04-12 | 北京好实沃生物技术有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌的产孢方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 刘馨磊，等: "补料分批法高密度培养凝结芽孢杆菌", 《生物技术》, vol. 11, no. 6, 31 December 2001 (2001-12-31), pages 20 - 23 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112048450A (zh) * | 2020-08-14 | 2020-12-08 | 润盈生物工程（上海）有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌发酵离心上清液重复两次发酵的方法 |
| CN113005052A (zh) * | 2021-01-27 | 2021-06-22 | 武汉微康益生菌研究院有限公司 | 一种凝结芽孢杆菌bc99的保藏方法 |
| CN112852680A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-05-28 | 四川润格生物科技有限公司 | 一种高芽孢数凝结芽孢杆菌的液体发酵方法 |
| CN113930464A (zh) * | 2021-09-22 | 2022-01-14 | 湖北华扬科技发展有限公司 | 一种利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法及其应用 |
| CN115261260A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-11-01 | 漯河微康生物科技有限公司 | 一种提高凝结芽孢杆菌芽孢数和稳定性的发酵方法和菌粉制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110804574A (zh) | 一种高浓度凝结芽孢杆菌液体发酵方法 | |
| CN106282072B (zh) | 一种复合乳酸菌微生态制剂及其制备方法与应用 | |
| CN112574922B (zh) | 一株具有益生作用的贝莱斯芽胞杆菌及应用 | |
| CN109749957B (zh) | 一种具有水产病原菌拮抗特性的格氏乳杆菌制剂的制备及应用 | |
| CN113430140B (zh) | 一株植物乳杆菌NHE-LpB6401及应用 | |
| CN107828698B (zh) | 一种复合菌制剂及其制备方法和应用 | |
| CN107325974B (zh) | 高植物细胞壁降解活性瘤胃真菌及其在饲料青贮中的应用 | |
| CN109423465A (zh) | 一种控制黄曲霉毒素b1的复合生物制剂及其应用 | |
| CN113907208B (zh) | 一种预防仔猪腹泻的饲料添加剂及其制备方法和应用 | |
| CN114806975B (zh) | 一种含有肠源性益生菌的微生态制剂及其制备方法和应用 | |
| CN113388550A (zh) | 一株唾液乳杆菌NHE-LsE33及应用 | |
| CN113502243B (zh) | 一株高产乳酸的植物乳杆菌gbw-lp001及其替抗菌剂和应用 | |
| CN102342371A (zh) | 一种利用纳豆芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌制备复合饲料添加剂的工艺 | |
| CN112088978A (zh) | 一种乳酸菌稳定剂及其应用方法 | |
| CN116064324B (zh) | 一株鼠李糖乳杆菌及其培养方法和在防治腹泻和肠炎方面的应用 | |
| CN116286514A (zh) | 多功能菌剂及其所含的罗伊氏乳杆菌及其应用 | |
| CN115851494A (zh) | 一株植物乳杆菌NHE-LpE5及应用 | |
| CN109329648B (zh) | 一种拮抗对虾弧菌的复合微生态制剂的应用 | |
| CN108185182A (zh) | 一种能改善猪肉品质的tmpf生物发酵配合饲料的制备方法 | |
| CN105166397B (zh) | 一种短短芽孢杆菌微生态制剂 | |
| CN112175834B (zh) | 植物乳酸菌在枯草芽孢杆菌固体菌剂保存中的应用及延长枯草芽孢杆菌的保存期的方法 | |
| CN112136966A (zh) | 一种水产全熟化发酵饲料的制备方法 | |
| CN113564072A (zh) | 一株乳酸片球菌NHE-Pa11403及应用 | |
| CN111728081A (zh) | 一种饲料添加剂用复合菌发酵液及其制备方法 | |
| CN111349581A (zh) | 一种嗜酸乳酸菌的选育及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200218 |