CN112088978A - 一种乳酸菌稳定剂及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，提供了一种乳酸菌稳定剂及其应用方法，该稳定剂重量份9‑11份的柠檬酸钠、9‑11份的羧甲基纤维素钠、14‑16份的壳聚糖、14‑16份的山梨醇、14‑16份的谷氨酸钠、23‑27份的碳酸钙和9‑11份的碳酸氢钠组成；经验证，将该稳定剂按5‑10wt％的比例添加到乳酸菌固体发酵饲料中，能够增强乳酸菌的活力，在较长周期内提高半干发酵饲料中乳酸菌的存活率；利用该稳定剂能够显著提高乳酸菌半干发酵饲料中乳酸菌的存活率；同时，稳定剂中含有低聚糖、氨基酸等益生活性成分，能够提高畜禽生产性能。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一种乳酸菌稳定剂及其应用方法。
背景技术
乳酸菌发酵饲料是指传统饲料原料经乳酸菌发酵处理后得到的营养丰富、适口性好、消化率高的生物饲料。乳酸菌发酵过程中产生乳酸、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性物质，可将淀粉降解为葡萄糖，将蛋白质降解为小分子肽、氨基酸，对纤维素、半纤维素、木质素等难消化物质进行预消化降解，提高饲料营养价值及利用率。发酵过程中产生乳酸，使发酵饲料具有特有的酸香味，产生诱食效果，提高动物采食量。同时，乳酸菌作为益生菌，可直接饲喂动物，能够维持动物体肠道内微生态平衡，抑制病原菌在肠道内生长、定植，增强机体免疫能力，提高生长性能，减少发病率。
乳酸菌发酵饲料在发酵初期，乳酸菌生长较快，且产生大量乳酸，降低了发酵饲料pH，同时产生多种抑菌物质，抑制有害菌的生长，提高了饲料安全性。但随着发酵饲料贮存时间的延长，乳酸菌可直接利用的营养物质减少，体系pH进一步降低，对乳酸菌本身也形成抑制，最终导致乳酸菌活菌数量迅速下降。前期研究表明，保存时间＞20d的乳酸菌发酵饲料中乳酸菌活量低于108CFU/g，保存时间＞30d时乳酸菌活量低于106CFU/g，甚至几乎检测不到乳酸菌。该问题限制了含乳酸菌活菌的半干发酵饲料或半干饲料发酵剂的生产、销售和贮存。
因此，能否找到一种能够显著提高乳酸菌半干发酵饲料中乳酸菌的存活率的稳定剂为研究人员的重要任务之一。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种乳酸菌稳定剂及其使用方法，该稳定剂由重量份9-11份的柠檬酸钠、9-11份的羧甲基纤维素钠、14-16份的壳聚糖、14-16份的山梨醇、14-16份的谷氨酸钠、23-27份的碳酸钙和9-11份的碳酸氢钠；经验证，将该稳定剂按5-10wt％的比例添加到乳酸菌固体发酵饲料中，能够增强乳酸菌的活力，在较长周期内提高半干发酵饲料中乳酸菌的存活率；利用该稳定剂能够显著提高乳酸菌半干发酵饲料中乳酸菌的存活率；同时，稳定剂中含有低聚糖、氨基酸等益生活性成分，能够提高畜禽生产性能。
本发明提供的具体技术方案是：
一种乳酸菌稳定剂，该稳定剂由重量份9-11份的柠檬酸钠、9-11份的羧甲基纤维素钠、14-16份的壳聚糖、14-16份的山梨醇、14-16份的谷氨酸钠、23-27份的碳酸钙和9-11份的碳酸氢钠组成；
上述各组分中，柠檬酸钠、羧甲基纤维素钠作为缓释碳源，可以在乳酸菌生长后期提供能量；壳聚糖、山梨醇具有抑菌活性，可抑制杂菌和有害菌生长，对乳酸菌没有影响；碳酸钙和碳酸氢钠可以中和乳酸菌释放的酸性物质，起到稳定pH的作用，防止体系酸度过低，进而抑制乳酸菌生长。同时，壳聚糖作为一种可食性食物纤维，具有改善动物肠道，增强免疫力的作用；与上述组分配合可以起到更好的效果。
除此之外，发明人进一步提供了应用该稳定剂制备乳酸菌半干发酵饲料的方法，具体步骤如下：
(1)按配方称取所需发酵饲料原料；其中发酵饲料原料由玉米粉、豆粕、麸皮、次粉、青贮玉米、豆渣、锯末、酒糟中的至少三种组成；
(2)按上述发酵饲料原料总质量的5-10％添加乳酸菌发酵液；
(3)用蒸馏水将上述混合物水分调节至40-50wt％，真空密封，25℃-35℃发酵24-72h；
(4)按上述混合物总质量的5-10％添加所述的乳酸菌稳定剂，充分混合均匀，获得乳酸菌半干发酵饲料；
经检测，上述获得的乳酸菌半干发酵饲料中的乳酸菌活菌含量至少为1×109CFU/g；
上所述乳酸菌发酵液的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种活化：取10-30μL冻存的乳酸菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养24h得到液体种子；
(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa,搅拌速率100-120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是MRS液体无菌培养基；
(4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109CFU/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得乳酸菌发酵液；
除了上述方法获得的乳酸菌发酵液，采用其他方式获得的乳酸菌发酵液也可以加入本发明所提供的稳定剂，可以取得类似的效果。
在获得了上述的乳酸菌半干发酵饲料后，发明人为了验证所述稳定剂的效果，对制备的乳酸半干发酵饲料活菌存活率进行验证，具体步骤如下：
(1)实验组：按上述制备方法制备乳酸菌半干发酵饲料3份，每份5kg；
(2)对照组：按本发明提供的制备乳酸菌半干发酵饲料的方法中步骤1-3(即不添加稳定剂)制备发酵饲料3份，每份5kg；
(3)将实验组与对照组置于相同条件下保存，温度为室温，避光；
(4)每隔10d取样检测实验组和对照组剩余菌量，取样及检测操作在无菌条件下进行，每次取样量5-10g，检测培养基为添加了5wt％琼脂的MRS培养基，检测方法为稀释平板涂布法；
验证结果为：对照组初始乳酸菌菌量4.5×109CUF/g，室温保存10d剩余菌量为2.1×109CUF/g，20d剩余菌量为8.2×108CUF/g，30d剩余菌量为3.6×106CUF/g，存活率0.08％；
实验组初始菌量4.6×109CUF/g，室温保存10d剩余菌量为2.9×109CUF/g，20d剩余菌量为1.6×109CUF/g，30d剩余菌量1.0×109CUF/g，存活率21.7％。实验组较对照组乳酸菌存活率显著提高。
综上所述，将本发明所提供的稳定剂按5-10wt％的比例添加到乳酸菌固体发酵饲料中，能够增强乳酸菌的活力，在较长周期内提高半干发酵饲料中乳酸菌的存活率；利用该稳定剂能够显著提高乳酸菌半干发酵饲料中乳酸菌的存活率。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1 一种乳酸菌稳定剂，其具体制备方法如下：
称取柠檬酸钠10g，羧甲基纤维素钠10g，壳聚糖15g，山梨醇15g，谷氨酸钠15g，碳酸钙25g，碳酸氢钠10g，精确至0.01g；将上述物料充分搅拌均匀，即得乳酸菌稳定剂。
实施例2 仔猪半干发酵饲料制备及乳酸菌存活率检测
菌种活化：将20μL冻存的乳酸菌菌株接种到200mL液体MRS培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24h。
乳酸菌发酵液制备：将活化的乳酸菌菌种10mL转接到200mL液体发酵培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24h。
液体发酵培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
配制发酵饲料原料：取玉米粉600g，次粉150g，豆粕250g，混合均匀。
接种乳酸菌：将乳酸菌发酵液100mL接种到发酵饲料原料中，混合均匀。
发酵：加适量水，调节水分含量至44％，真空包装，32℃发酵48h。
添加稳定剂：将上述发酵产物按质量分为两份。其中一份按质量的5％添加乳酸菌稳定剂，充分混合均匀，为实验组，另一份不加稳定剂作为对照组。
菌量检测：将发酵饲料置于室温条件下避光保存，每隔10d取样检测剩余乳酸菌菌量，取样及检测操作在无菌条件下进行，每次取样量5-10g，检测培养基为添加琼脂的MRS培养基，检测方法为稀释平板涂布法。
检测结果：见表1
表1仔猪半干发酵饲料中乳酸菌菌量变化
| 初始菌量/cfu·g<sup>-1</sup> | 10d/cfu·g<sup>-1</sup> | 20d/cfu·g<sup>-1</sup> | 30d/cfu·g<sup>-1</sup> | |
| 实验组 | 4.6×10<sup>9</sup> | 2.9×10<sup>9</sup> | 1.6×10<sup>9</sup> | 1.0×10<sup>9</sup> |
| 对照组 | 4.5×10<sup>9</sup> | 2.1×10<sup>9</sup> | 8.2×10<sup>8</sup> | 3.6×10<sup>6</sup> |
根据实验结果，相同条件下室温贮存20d，对照组剩余菌量为8.2亿cuf/g，实验组为16亿cuf/g；室温贮存30d，对照组剩余菌量为3.6×106cuf/g，实验组为10亿cuf/g。表明添加乳酸菌稳定剂后，仔猪乳酸菌半干发酵饲料中乳酸菌存活率显著提高。
实施例3 育肥猪半干发酵饲料制备及乳酸菌存活率检测
菌种活化：将冻存的乳酸菌菌株接种到200mL液体MRS培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24h。
乳酸菌发酵液制备：将活化的乳酸菌菌种10mL转接到200mL液体发酵培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24h。
液体发酵培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
配制发酵饲料原料：取次粉350g，麸皮250g，青贮玉米300g，豆渣100g,混合均匀。
接种乳酸菌：将乳酸菌发酵液100mL接种到发酵饲料原料中，混合均匀。
乳酸菌稳定剂配制：称取柠檬酸钠5g，羧甲基纤维素钠5g，壳聚糖10g，山梨醇5g，甘油20g，谷氨酸钠10g，碳酸钙15g，碳酸氢钠5g，精确至0.01g。将上述物料加入100mL蒸馏水中，充分搅拌均匀。
发酵：加适量水，调节水分含量至46％，真空包装，32℃发酵48h，获得乳酸菌半干发酵饲料。
添加稳定剂：将上述发酵产物按质量分为两份。其中一份按质量的5％添加乳酸菌稳定剂，充分混合均匀，为实验组；另一份作为对照组。
菌量检测：将发酵饲料置于室温条件下避光保存，每隔10d取样检测剩余乳酸菌菌量，取样及检测操作在无菌条件下进行，每次取样量5-10g，检测培养基为添加琼脂的MRS培养基，检测方法为稀释平板涂布法。
检测结果：见表2
表2育肥猪半干发酵饲料中乳酸菌菌量变化
| 初始菌量/cfu·g<sup>-1</sup> | 10d/cfu·g<sup>-1</sup> | 20d/cfu·g<sup>-1</sup> | 30d/cfu·g<sup>-1</sup> | |
| 实验组 | 1.9×10<sup>9</sup> | 8.2×10<sup>8</sup> | 3.3×10<sup>8</sup> | 3.9×10<sup>7</sup> |
| 对照组 | 1.7×10<sup>9</sup> | 6.2×10<sup>8</sup> | 4.5×10<sup>7</sup> | 5.5×10<sup>6</sup> |
根据实验结果，相同条件下室温贮存20d，对照组剩余菌量为4.5×106cuf/g，实验组为3.3亿cuf/g；室温贮存30d，对照组剩余菌量为5.5×106cuf/g，实验组为3.9×107cuf/g。表明添加乳酸菌稳定剂后，育肥猪乳酸菌半干发酵饲料中乳酸菌存活率显著提高。
实施例4 乳酸菌半干发酵饲料二次发酵制备发酵饲料
菌种活化：将冻存的乳酸菌菌株接种到200mL液体MRS培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24h。
乳酸菌发酵液制备：将活化的乳酸菌菌种10mL转接到200mL液体发酵培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24h。
液体发酵培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
配制发酵饲料原料：取次粉400g，麸皮300g，青贮玉米300g，混合均匀。
接种乳酸菌：将乳酸菌发酵液100mL接种到发酵饲料原料中，混合均匀。
乳酸菌稳定剂配制：称取柠檬酸钠5g，羧甲基纤维素钠5g，壳聚糖10g，山梨醇5g，甘油20g，谷氨酸钠10g，碳酸钙15g，碳酸氢钠5g，精确至0.01g。将上述物料加入100mL蒸馏水中，充分搅拌均匀。
发酵：加适量水，调节水分含量至46％，真空包装，32℃发酵48h。
添加乳酸菌稳定剂：按上述发酵产物总质量5％添加配制好的乳酸菌稳定剂，充分混合均匀，获得乳酸菌半干发酵饲料。
二次发酵：将上述乳酸菌半干发酵饲料置于室温条件下避光保存20天，取100g与次粉350g、麸皮350g、青贮玉米300g混合均匀。加适量水，调节水分含量至46％，真空包装，32℃发酵48h。取发酵饲料1g，梯度稀释108倍涂布于固体MRS培养基中，32℃培养48h后进行乳酸菌菌落计数，计算得产品中活菌含量为3.8*109CFU/g。
结果表明，添加所述乳酸菌稳定剂制备的乳酸菌半干发酵饲料，室温保存20天后仍具有较高活性，进行二次发酵制备的发酵饲料乳酸菌含量达到38亿CFU/g，满足发酵饲料使用要求。
Claims (5)
1.一种乳酸菌稳定剂，其特征在于：该稳定剂由重量份9-11份的柠檬酸钠、9-11份的羧甲基纤维素钠、14-16份的壳聚糖、14-16份的山梨醇、14-16份的谷氨酸钠、23-27份的碳酸钙和9-11份的碳酸氢钠组成。
2.应用权利要求1所述稳定剂制备乳酸菌半干发酵饲料的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)按配方称取所需发酵饲料原料；其中发酵饲料原料由玉米粉、豆粕、麸皮、次粉、青贮玉米、豆渣、锯末、酒糟中的至少三种组成；
(2)按上述发酵饲料原料总质量的5-10％添加乳酸菌发酵液；
(3)用蒸馏水将上述混合物水分调节至40-50wt％，真空密封，25℃-35℃发酵24-72h；
(4)按上述混合物总质量的5-10％添加所述的乳酸菌稳定剂，充分混合均匀，获得乳酸菌半干发酵饲料。
3.根据权利要求2所述制备乳酸菌半干发酵饲料的方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵液的制备方法，具体步骤如下：
(1)菌种活化：取10-30μL冻存的乳酸菌接种于含有200mL MRS液体无菌培养基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养至对数期；
(2)液体种子制备：将活化的菌种200mL转接到含有1000mL MRS液体无菌培养基中，置于28-38℃，160-180rpm振荡培养24h得到液体种子；
(3)种子罐发酵：将制备好的液体种子按照5％-10％v/v的接种量接种入装液量为70％的20L种子罐中扩大培养，具体的培养条件为：保持罐温25-28℃，罐压30-40kpa,搅拌速率100-120r/min，通气量1：0.2-0.4，pH 3.4-3.6，发酵76-96小时；种子罐中的培养基是MRS液体无菌培养基；
(4)生产罐发酵：将种子液按2-10％v/v的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养，发酵结束后菌体数量达到5.0*109CFU/mL以上，将发酵完成后培养液出罐即得乳酸菌发酵液。
4.根据权利要求3所述制备乳酸菌半干发酵饲料的方法，其特征在于，
上述步骤(4)生产罐中的培养基组成为：红糖88g，酵母膏1.1g，蛋白胨1.1g，磷酸二氢钾0.35g，糖蜜105g，氢氧化钠1.85g，pH自然，加蒸馏水定容至1L。
5.根据权利要求2所述制备乳酸菌半干发酵饲料的方法，其特征在于，所述发酵饲料原料由35-38份玉米粉、6-9份豆粕、24-28份麸皮、22-25份次粉和0-15份辅料组成，其中辅料选自青贮玉米、豆渣、锯末、酒糟中的一种或几种。
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