CN113564072A - 一株乳酸片球菌NHE-Pa11403及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株新分离的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)NHE‑Pa11403，该菌分离自白羽肉鸡肠道，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.21192，保藏日期为2020年11月16日。本发明的乳酸片球菌NHE‑Pa11403可用于制备液体发酵饲料，可有效调节动物肠道微生物平衡，促进动物对营养的吸收，提高饲料转化率，提高动物生产性能。

Description

一株乳酸片球菌NHE-Pa11403及应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体的说，特别涉及一株益生乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)NHE-Pa11403及其应用。
背景技术
寻找抗生素的替代品和替代方案已经成为了畜牧业的重要研究内容，作为抗生素的替代品，益生菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。益生菌的使用方案也日趋成熟，特别对于乳酸菌一类抗逆性较弱，不易于保存的益生菌的使用，通过不断的研究和实践，乳酸菌一类的益生菌在畜牧养殖中起着非常重要的作用。
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)是益生菌中的重要成员之一，大多数为动物的体表和内部粘膜表面的益生菌之一。另外，乳酸片球菌还产酸，可以调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有拮抗作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。乳酸片球菌还能产生产生的片球菌素(Pediocin)对大肠杆菌、单核细胞增多症李氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌和产气英膜梭状芽孢杆菌等有抑制和杀灭作用。片球菌素具有宽的pH耐受性和对低、高温的耐受性。
在中国专利CN-202010512546中公开了一种微生态复合预混合饲料，所述的微生态复合预混合饲料包含益生菌、复合微量元素、复合酸化剂和载体。其中的乳酸片球菌MST02(Pediococcus acidilactici MST02)，已于2020年4月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2020094。尽管其可能是有效的，但和本发明的完全不相同。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有益生作用的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)NHE-Pa11403及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)NHE-Pa11403是从健康白羽肉鸡肠道内容物中分离的乳酸片球菌菌株，通过菌落形态观察、生理生化特征、分子生物学鉴定等确定其为乳酸片球菌，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株具有耐酸性、耐胆盐性、存活能力强，产酸性和发酵性能强，且具有广谱抑制作用等。
本发明提供的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)NHE-Pa11403，已于2020年11月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，保藏编号为CGMCC No.21192。
本发明提供的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)NHE-Pa11403具有以下微生物学特征：乳酸片球菌NHE-Pa11403是革兰氏阳性球菌，在MRS琼脂培养基上生长良好，培养48h，菌落呈圆形，白色，有光泽，中间凸起，表面光滑，边缘整齐。菌落直径1～2mm，菌落形态如图1，兼性厌氧生长，显微镜下菌体呈椭球型，经革兰氏染色后菌株形态如图2；乳酸片球菌NHE-Pa11403生长适宜温度范围：15℃-45℃，最适生长温度：30℃-40℃；生长适宜pH4.0-8，最适pH 值为5-7。部分生理生化特性如表1。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21192的乳酸片球菌NHE-Pa11403 的液体菌剂。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21192的乳酸片球菌NHE-Pa11403 的动物饮水用饲料添加剂。
饲料添加剂中乳酸片球菌NHE-Pa11403的活菌数为1.0×106-1.0× 1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中乳酸片球菌NHE-Pa11403的活菌数为1× 107CFU/g。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21192的乳酸片球菌NHE-Pa11403 或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21192的乳酸片球菌NHE-Pa11403 或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21192的乳酸片球菌NHE-Pa11403 或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气英膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.21192的乳酸片球菌NHE-Pa11403 或含有其的菌剂在食品制造中的应用。优选地，所述的食品为动物用食品。
另外，本发明进一步提供了上述乳酸片球菌NHE-Pa11403在断奶仔猪生产中的应用。
本发明中所述乳酸片球菌NHE-Pa11403的培养方法如下：
取乳酸片球菌NHE-PA11403(保藏编号为CGMCC No.21192)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)6mL，接种于300mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.0-3.5％，葡萄糖0.5-2.0％，柠檬酸钠0.1-1.5％，酵母浸粉0.5-2.8％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，乳酸菌营养素 0.1-1.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水；pH5.8-7.2。优选为：蔗糖2.0％，葡萄糖0.8％，柠檬酸钠0.2％，酵母浸粉1.5％，大豆蛋白胨 1％，乳酸菌营养素0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.3％，硫酸锰 0.02％，亚硫酸铁0.01％，吐温-800.2％，余量为水。
所述摇瓶发酵条件为：接种量0.5-10％(体积比)，发酵温度为30-40℃、 pH5.0-7.0、100-300r/min，发酵时间8-24h。优选为：接种量2％(体积比)，发酵温度为37℃、pH6.2、200r/min，发酵时间8h。
摇瓶发酵结束后进行发酵罐发酵培养，取600mL摇瓶发酵种子液接种到50L 发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，50L发酵罐装液量为35L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为8.9×109CFU/mL。
所述50L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：绵白糖1.0-3.5％，葡萄糖 0.5-2.0％，柠檬酸钠0.1-1.5％，酵母浸粉0.5-2.8％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，乳酸菌营养素0.1-1.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙 0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水。优选为：绵白糖1.2％，葡萄糖0.8％，柠檬酸钠0.6％，酵母浸粉1.2％，大豆蛋白胨1％，乳酸菌营养素0.5％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸锰0.02％，亚硫酸铁0.01％，吐温-80 0.2％，余量为水。
所述50L发酵条件为：pH5.8-7.2，装液量为25L-35L培养基，控制罐压 0.03-0.06MPa，接种量为300-3500mL，发酵温度为30-40℃，发酵时间12-36h，搅拌转速80-300r/min。优选为：pH6.2，装液量为35L培养基，控制罐压0.05MPa，接种量为600mL，发酵温度为37℃，发酵时间22h，搅拌转速200r/min。
本发明中所述乳酸片球菌NHE-Pa11403液体发酵饲料制备方法如下：
1、贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种活化
将保藏的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种，经营养琼脂平板2-3次活化，然后接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养10h，获得贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液备用。
2、植物乳杆菌菌种活化
将保藏的植物乳杆菌菌种，经MRS琼脂平板2-3次活化，然后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养24h，获得植物乳杆菌种子液备用。
3、酿酒酵母菌菌种活化
将保藏的酿酒酵母菌菌种，经PDA平板2-3次活化，然后接种于PDB培养基中， 32℃恒温180转/分钟震荡培养24h，获得酿酒酵母菌种子液备用。
4、液体饲料制备
将贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液，植物乳杆菌种子液，乳酸片球菌 NHE-Pa11403种子液和酿酒酵母菌种子液混合均匀，获得菌种混合液。然后按照 1％接种量加入液体饲料中，混合转速50r/min，混合30min，然后装入发酵桶中，密闭发酵24h，获得乳酸片球菌NHE-Pa11403液体发酵饲料。
所述菌种混合液由下述组分组成：贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液12％，植物乳杆菌种子液28％，乳酸片球菌NHE-Pa11403种子液(实施例2制备的发酵液) 55％，酿酒酵母菌种子液5％。
所述液体饲料由下述组分组成：固体饲料25％，余量为水。
所述固体饲料由下述组分组成：玉米33.94份、膨化玉米20份、豆粕(45) 12.35份、碎米10份、膨化大豆7份、发酵豆粕(酸溶蛋白10％)6份、白糖2.5份、鱼粉(进口蒸汽)2份、磷酸二氢钙1.73份、豆油(三级)1.3份、L赖氨酸盐酸盐(98.5％)0.51、甲酸钙(98％)0.5份、氯化钠(98.5％)0.43份、酸度调节剂0.4份、乳仔猪微量元素预混合饲料粉料0.3份、DL-蛋氨酸(98.5％)0.21份、 L-苏氨酸(98.5％)0.19份、氧化锌(锌76)0.18份、仔猪用微量元素预混合饲料Fucosin0.15份、氯化胆碱(60％)0.1份、酿酒酵母0.05份、乳仔猪维生素预混合饲料0.05份、香味剂0.03份、甜味剂0.02份、复合抗氧化剂0.01份、L-色氨酸(98％)0.01份、植酸酶(耐高温)0.04份。
所述贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，其保藏编号为CGMCC NO.21191，已在中国专利CN112574922A中公开；该菌已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明乳酸片球菌NHE-Pa11403的益生性的检验方法如下：
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气英膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气英膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵 0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的 0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
本发明乳酸片球菌NHE-Pa11403的抗逆性检验方法如下：
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌悬液置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010 版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm) 备用。
2、耐人工肠液性能测定
取1mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中， 37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃， 200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水 500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌悬液置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、 1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容， 121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCI调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
本发明乳酸片球菌NHE-Pa11403预防和治疗腹泻的检验方法：
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加乳酸片球菌发酵液，添加浓度为1×107CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加乳酸片球菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为 0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×107CFU/mL浓度的乳酸片球菌NHE-Pa11403发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的乳酸片球菌NHE-Pa11403抑菌性能强、产酸能力强、抗逆性强、发酵力强、生长旺盛；经发酵培养基和工艺优化，37℃发酵22h，发酵液活菌数可达到8.9×109CFU/mL，更加适合饲料工业和畜禽养殖业发展，可在液体发酵饲料中发挥重要作用，可大大降低生产成本、提高经济效益，为以后发展奠定了坚实的菌种基础。
(2)本发明的乳酸片球菌NHE-Pa11403具有显著的益生性，能显著抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气英膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌等病原菌的生长繁殖，特别是对水产动物病原菌抑菌效果突出，具有广谱抑菌性。
(3)本发明中的乳酸片球菌NHE-Pa11403可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠攻毒试验，试验组小鼠体重平均增长率显著高于对照组(P＜0.05)；沙门氏菌攻毒后，试验组小鼠精神状态和存活率明显高于负对照组。表明饲喂乳酸片球菌NHE-Pa11403菌液可有效预防和治疗小鼠腹泻，提高小鼠受病原菌攻毒的存活率，并能够促进小鼠生长。
(4)本发明乳酸片球菌NHE-Pa11403应用于断奶仔猪生产，在断奶仔猪液体发酵饲料中添加乳酸片球菌制剂仔猪皮毛亮，粪便形态明显改善，明显改善动物体况，可显著提高猪只末重、ADG和ADFI(P＜0.05)，与对照组对比，实验组猪只末重、ADG、ADFI分别提高了14.87％(P＜0.05)、22.62％(P＜0.05)和13.32％ (P＜0.05)，显著改善料肉比，降低了6.45％(P＜0.05)，促进断奶仔猪的生长和饲料转化率，显著降低腹泻率，从而提高养猪效益。
附图说明
图1是乳酸片球菌NHE-Pa11403在MRS培养基上的菌落形态图。
图2是乳酸片球菌NHE-Pa11403菌株的革兰氏染色图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
以下实施例中使用的贝莱斯芽胞杆菌为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)NHB-BvF5001，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21191，已在中国专利 CN112574922A中公开。
实施例1乳酸片球菌NHE-Pa11403的分离、筛选及鉴定
1、乳酸菌的分离纯化：
将健康白羽肉鸡屠宰取肠道后迅速在无菌条件下采集肠道内容物2.5克，置于盛有22.5mL灭菌生理盐水的三角瓶中，于37℃下恒温震荡1h后，采用10倍倍比稀释的方法依次稀释至10万倍，选择1000倍、1万倍和10万倍三个稀释度，吸取0.1mL涂布于改良的MRS琼脂平板上，平板涂布后37℃倒置培养48h，用接种环挑取溶钙圈明显且大于5mm的疑似乳酸菌的菌落在MRS琼脂平板上进行划线分离培养，经48h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于MRS琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后将菌种细胞悬浮于20％甘油溶液中，于 -80℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察：
根据步骤1中溶钙圈大小，初步筛选出产酸能力强的菌株可初步确定为乳酸菌，共115株。将步骤1保存的甘油管菌种，经MRS琼脂平板2-3次活化，然后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养18～20h，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的不产芽胞细菌作为备用。
3、乳酸菌菌悬液和发酵液制备
将步骤1获得的乳酸菌在MRS琼脂平板上划线37℃培养48h，从平板上挑取单菌落于100mL MRS液体培养基中，37℃，180r/min震荡培养24h，获得乳酸菌菌悬液备用；继续37℃，180r/min震荡培养96h，获得乳酸菌发酵液备用。
4、抑菌性乳酸菌的筛选：
取致病菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、产气英膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液2mL，加入装有200mL灭菌后冷至45℃左右的营养琼脂培养基中，然后吸取10mL未凝固的带菌培养基，转入倒有10mL底层平板的营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个(致病菌产气英膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)。在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取1个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管中可加入200μL液体，管的两端要光滑)放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似乳酸菌菌株发酵液(步骤3获得)于牛津杯中，于37℃下恒温培养24h。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，其中抑菌圈大的菌株有10株，并分别标号为3301、5704、7801、8604、9301、9601、 11403、11405、11702、12001。其中3301、5704、7801、11405、11702、12001 6株菌为杆菌，8604、9301、9601、114034株菌为球菌，选择对水产病原菌抑菌圈最大的菌株11403进行下一步研究。
5、产酸性能测定：
将步骤3种获得的乳酸菌11403菌悬液按1％(体积比)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，每小时测一次pH值，同时采用HPLC检测发酵液中乳酸含量，菌株11403发酵过程中随着时间的延长pH逐渐下降，同时乳酸含量也随时间延长而逐渐增加，在发酵24h时乳酸产量最高达22.3g/L，pH最低为3.41。
6、菌株属的鉴定：
对菌株11403进行了形态和生理生化鉴定，在MRS琼脂培养基上生长良好，培养48h，菌落呈圆形，白色，有光泽，中间凸起，表面光滑，边缘整齐。菌落直径1～2mm，菌落形态如图1，兼性厌氧生长，显微镜下菌体呈椭球型，经革兰氏染色后菌株形态如图2；乳酸片球菌NHE-Pa11403生长适宜温度范围：15℃ -45℃，最适生长温度：30℃-40℃；生长适宜pH4.0-8，最适pH值为5-7。部分生理生化特性如表1。通过对菌株11403进行生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》鉴定菌株的种属。结果显示菌株11403为片球菌属。
表1菌株11403的部分生理生化特征
Figure RE-GDA0003245133510000101
Figure RE-GDA0003245133510000111
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
7、16S rDNA测序测定：
采用细菌DNA提取的试剂盒提取11403菌株基因组DNA。通过引物F和R对 11403菌株的16S rDNA基因片段进行测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株11403与乳酸片球菌的同源性达到99.93％。通过菌株11403的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株11403为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，并正式标号为NHE-Pa11403。
8、菌株保藏：
上述经分离、纯化、筛选得到的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) NHE-Pa11403已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.21192，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。
所述改良MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％，MnSO4 0.025％，琼脂1.8％，碳酸钙1％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS琼脂培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％， MnSO40.025％，琼脂1.8％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS肉汤培养基组成为：蛋白胨1.0％，乙酸钠0.5％，牛肉膏1.0％，葡萄糖2％，酵母膏0.5％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.058％，柠檬酸二铵0.2％， MnSO40.025％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述营养琼脂培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基组成为：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6 ±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
实施例2乳酸片球菌NHE-PA11403发酵液的制备
取乳酸片球菌NHE-PA11403(保藏编号为CGMCC No.21192)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)6mL，接种于300mL摇瓶发酵培养基中进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵结束后进行发酵罐发酵培养，取600mL摇瓶发酵种子液接种到50L发酵罐中的发酵培养基中进行发酵培养，50L发酵罐装液量为35L发酵培养培养基。发酵结束后，检测发酵液活菌数为8.9×109CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
所述摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.0-3.5％，葡萄糖0.5-2.0％，柠檬酸钠0.1-1.5％，酵母浸粉0.5-2.8％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，乳酸菌营养素 0.1-1.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水；pH5.8-7.2。
优选为：蔗糖2.0％，葡萄糖0.8％，柠檬酸钠0.2％，酵母浸粉1.5％，大豆蛋白胨1％，乳酸菌营养素0.4％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.3％，硫酸锰0.02％，亚硫酸铁0.01％，吐温-80 0.2％，余量为水；pH6.2。
所述摇瓶发酵条件为：接种量2％(体积比)，发酵温度为37℃、pH6.2、 200r/min，发酵时间8h。
所述50L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：绵白糖1.0-3.5％，葡萄糖 0.5-2.0％，柠檬酸钠0.1-1.5％，酵母浸粉0.5-2.8％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，乳酸菌营养素0.1-1.5％，硫酸镁0.01-0.5％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙 0.01-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，亚硫酸铁0.01-0.5％，吐温-80 0.05-0.2％，余量为水；pH5.8-7.2，装液量为35L培养基，控制罐压0.05-0.06MPa，接种量为600mL，发酵温度为37℃，发酵时间22h，pH值6.2，搅拌转速200r/min。
实施例3乳酸片球菌NHE-Pa11403益生性验证
在无菌操作台上，将浓度为109CFU/mL的病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气英膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌)菌悬液加入冷却至45℃的营养琼脂(产气英膜梭菌则将培养基换成胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，培养条件则需要严格厌氧条件)培养基(灭菌后)中混匀，制备成4mm左右的病原菌琼脂平板，琼脂平板中病原菌的浓度为109CFU/mL。将灭菌的牛津杯放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待10分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，37℃培养36-96h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，结果如表2。
所述营养琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5；余量为水，pH 7.2±0.2。
所述胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基的配方按重量百分比计由下述组分组成：胰胨1.5％，大豆胨0.5％，酵母粉0.5％，焦亚硫酸钠0.1％，柠檬酸铁铵 0.1％，琼脂2％，余量为水，pH 7.6±0.2，使用时冷却至50℃时加入过滤除菌的 0.5％D-环丝氨酸溶液20ml/250mL。
表2乳酸片球菌NHE-Pa11403对病原菌的抑菌效果
Figure RE-GDA0003245133510000131
Figure RE-GDA0003245133510000141
实施例4乳酸片球菌NHE-Pa11403抗逆性验证
1、耐人工胃液性能测定：
取10mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备) 置于90mL(250mL三角瓶)配置的人工胃液中，37℃，200r/min恒温震荡180min；震荡完成后取10mL样液调节pH值至7.0，加入90mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表3所示。从表3中可以看出，乳酸片球菌NHE-Pa11403在pH1.5、pH2.0、pH2.5的人工胃液(含酶)中分别处理3h存活率均在98％以上，表明该菌株NHE-Pa11403具有较高的耐酸性，可以耐受胃酸，能顺利到达肠道发挥作用。
所述人工胃液制备方法：人工胃液的制备参照《中华人民共和国药典》2010 版中的制备方法，取稀盐酸16.4mL，加水约800mL与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水称释成1000mL，调节pH值分别为1.5、2.0和2.5，微孔滤膜除菌(0.22μm) 备用。
表3乳酸片球菌NHE-Pa11403在人工胃液中处理后3h的存活情况
处理 pH1.5 pH2.0 pH2.5
初始活性CFU/mL 1.09×10<sup>9</sup> 1.09×10<sup>9</sup> 1.09×10<sup>9</sup>
处理后活性CFU/mL 1.07×10<sup>9</sup> 1.08×10<sup>9</sup> 1.12×10<sup>9</sup>
处理后存活率％ 98.16 99.08 100％
2、耐人工肠液性能测定
取1mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)人工肠液中，37℃，200r/min恒温震荡5h，震荡完成后取1mL样液加入99mL生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果显示，乳酸片球菌NHE-Pa11403在人工肠液中活性不减少，存活率100％，表明该菌株能很好在肠液中生存并保存活力，从而发挥其益生作用。
所述人工肠液制备：人工肠液的制备参照《中华人民共和国药典》2010版中的制备方法，磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH6.8)，取磷酸二氢钾6.8g，加水 500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，然后用0.22μm微滤膜过滤除菌，即得。
3、耐胆盐性能测定
取1mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌悬液(按照实施例1中描述的方法制备)置于99mL(250mL三角瓶)不同胆盐浓度的溶液中，胆盐浓度分别为0.15％、0.3％、 1％、1.5％，然后37℃，200r/min恒温震荡120min，震荡完成后取1mL样液加入99mL 生理盐水，37℃，200r/min恒温震荡30min，然后进行稀释平板菌落培养计数。结果如表4所示。乳酸片球菌NHE-Pa11403在0.3％胆盐溶度的溶液中处理2小时，存活率为93.57％，表明该菌株具有较高的耐胆盐性，可以耐受十二指肠液中的胆盐，使菌株能到达肠道去发挥作用。
所述不同浓度胆盐溶液制备方法：分别取9mL、18mL、60mL、90mL的5％胆盐溶液加入pH7.4的PBS溶液中，定容至300mL，混合均匀，此为含胆盐0.15％、0.30％、 1％、1.5％的PBS溶液。
所述5％胆盐溶液制备方法：准确称取5.0g胆盐，用100mLPBS溶液溶解定容， 121℃灭菌20min。
所述PBS溶液制备方法：氯化钠0.8％，氯化钾0.02％，磷酸氢二钠0.363％，磷酸二氢钾0.024％，余量为水。用6mol/L的HCl调pH至7.4，121℃灭菌20min，备用。
表4乳酸片球菌NHE-Pa11403在不同浓度胆盐溶液中处理2h后的存活情况
处理 0.15％ 0.3％ 1％ 1.5％
初始活性CFU/mL 1.09×10<sup>9</sup> 1.09×10<sup>9</sup> 1.09×10<sup>9</sup> 1.09×10<sup>9</sup>
处理后活性CFU/mL 1.06×10<sup>9</sup> 1.02×10<sup>9</sup> 9.8×10<sup>8</sup> 9.6×10<sup>8</sup>
处理后存活率％ 97.24 93.57 89.90 88.28
实施例5乳酸片球菌NHE-Pa11403急性毒性试验
乳酸片球菌的安全性评价采用急性毒性试验，参照国标GB15193.3-2003最大耐受剂量法进行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规饲养1周后，一日分三次对小白鼠进行灌胃，0.25g/mL乳酸片球菌NHE-Pa11403菌液(相当于15000mg/kg体重)，连续灌服2周，观察小鼠是否有中毒或死亡的现象。
试验期间，小鼠精神状态良好，无中毒和死亡现象，因此本发明菌株的急性毒性试验最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，可确定该菌种为无毒级，具有较高的安全性。
实施例6小鼠攻毒试验
选取普通昆明小白鼠60只，雌性，11-13g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂5天，使小鼠尽快适应。开始正式试验，正式试验分两个阶段。第一阶段生长性能观察试验，实验组在饮水中添加乳酸片球菌发酵液，添加浓度为1×107CFU/mL。对照组和负对照组饮用未加乳酸片球菌的纯净水，连续饮水两周。试验前后分别称重1次，试验期间观察小鼠生长情况，计算各组体重平均增长率，结果如表5。第二阶段沙门氏菌攻毒试验，对负对照组和试验组进行沙门氏菌攻毒，攻毒方式采用灌胃的方式，具体为灌胃0.3mL/只浓度为 0.2％的碳酸氢纳溶液，5min后灌胃浓度为109数量级的沙门氏菌0.8mL/只，对照组则灌胃0.8mL/只生理盐水。攻毒后观察小白鼠精神状态及死亡情况，攻毒后试验组继续饮用1×107CFU/mL浓度的乳酸片球菌NHE-Pa11403发酵液，对照组和负对照组正常饮用自来水。试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，
所述乳酸片球菌发酵液为实施例2制备的发酵液，然后通过离心收集菌体，收集获得的菌体用生理盐水洗涤3-5次除去发酵液。
沙门氏菌攻毒后，通过每日观察，小鼠的发病症状有：精神萎靡不振、不活泼；表现呆滞、颤抖；蜷缩在一起，毛色不光泽，且背毛凌乱；食欲不佳、背部弓起突出，发病严重小鼠眼睛带血，不能睁开。攻毒后，第1天，负对照组开始有发病症状，且死亡4只，其他存活的也不同程度的出现了发病症状，四处逃窜，精神不振。试验组仅在第1天死亡1只，其它小鼠3天内，精神不佳、不食、聚堆，之后逐渐恢复正常。
攻毒后各组死亡时间、死亡数及存活率如表6所示，试验组小鼠攻毒后中毒现象不严重，表明乳酸片球菌NHE-Pa11403对沙门氏菌感染有一定的免疫预防效果，有效地降低了小白鼠受沙门氏菌感染时的发病率，延缓攻毒后的发病时间，从而有效提高了存活率。
表5小鼠增重情况
分组 平均始重(g/只) 平均末重(g/只) 平均增长率(％)
对照组 15.14±0.22 29.23±0.56 93.06<sup>b</sup>
负对照组 15.56±0.38 29.12±0.51 87.15<sup>c</sup>
试验组 15.24±0.77 38.43±0.97 152.16<sup>a</sup>
表6攻毒前、后的小鼠死亡情况
Figure RE-GDA0003245133510000171
实施例7乳酸片球菌NHE-Pa11403液体发酵饲料制备
5、贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种活化
将保藏的贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001菌种，经营养琼脂平板2-3次活化，然后接种于营养肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养10h，获得贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液备用。
6、植物乳杆菌菌种活化
将保藏的植物乳杆菌菌种，经MRS琼脂平板2-3次活化，然后接种于MRS肉汤培养基中，37℃恒温180转/分钟震荡培养24h，获得植物乳杆菌种子液备用。
7、酿酒酵母菌菌种活化
将保藏的酿酒酵母菌菌种，经PDA平板2-3次活化，然后接种于PDB培养基中， 32℃恒温180转/分钟震荡培养24h，获得酿酒酵母菌种子液备用。
8、液体饲料制备
将贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液，植物乳杆菌种子液，乳酸片球菌 NHE-Pa11403种子液和酿酒酵母菌种子液混合均匀，获得菌种混合液。然后按照 1％接种量加入液体饲料中，混合转速50r/min，混合30min，然后装入发酵桶中，密闭发酵24h，获得乳酸片球菌NHE-Pa11403液体发酵饲料。
所述菌种混合液由下述组分组成：贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001种子液12％，植物乳杆菌种子液28％，乳酸片球菌NHE-Pa11403种子液(实施例2制备的发酵液) 55％，酿酒酵母菌种子液5％。
所述液体饲料由下述组分组成：固体饲料10-50％，余量为水。
优选为：固体饲料25％，余量为水
所述固体饲料由下述组分组成：玉米33.94份、膨化玉米20份、豆粕(45) 12.35份、碎米10份、膨化大豆7份、发酵豆粕(酸溶蛋白10％)6份、白糖2.5份、鱼粉(进口蒸汽)2份、磷酸二氢钙1.73份、豆油(三级)1.3份、L赖氨酸盐酸盐(98.5％)0.51、甲酸钙(98％)0.5份、氯化钠(98.5％)0.43份、酸度调节剂0.4份、乳仔猪微量元素预混合饲料粉料0.3份、DL-蛋氨酸(98.5％)0.21份、 L-苏氨酸(98.5％)0.19份、氧化锌(锌76)0.18份、仔猪用微量元素预混合饲料Fucosin0.15份、氯化胆碱(60％)0.1份、酿酒酵母0.05份、乳仔猪维生素预混合饲料0.05份、香味剂0.03份、甜味剂0.02份、复合抗氧化剂0.01份、L-色氨酸(98％)0.01份、植酸酶(耐高温)0.04份。
所述贝莱斯芽胞杆菌NHB-BvF5001，其保藏编号为CGMCC NO.21191，已在中国专利CN112574922A中公开；该菌已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
实施例8乳酸片球菌NHE-Pa11403液体发酵饲料对断奶仔猪生长性能影响
本试验采用对照试验设计，将192头断奶仔猪随机分成2组，每组3个重复，每个重复32只。干料组饲喂固体饲料，液态组饲喂液体发酵饲料(实施例7制备)。对照组猪群采用干料桶饲喂模式，试验猪群采用液态粥料机，均自由采食和饮水。每天记录投料量及健康状况，定期观察猪只皮毛亮度及粪便状况，其他饲养管理均相同。本试验结果如表7和表8所示，由表7可知，液态组猪只末重、ADG 和ADFI均显著高于干料组(P＜0.05)，与干料组对比，液态组猪只末重、ADG、 ADFI分别提高了14.87％(P＜0.05)、22.62％(P＜0.05)和13.32％(P＜0.05)， F/G显著低于干料组，降低了6.45％(P＜0.05)。由表8可知，液态组猪猪只腹泻率显著降低了18.01％，差异显著(P＜0.05)。
表7液态发酵饲料对断奶仔猪生长性能的影响
指标 干料组 液态组
初重(kg) 6.92±0.93 7.02±1.03
末重(kg) 18.97±1.76<sup>b</sup> 21.79±2.31<sup>a</sup>
ADG(g/d) 376.40±42.31<sup>b</sup> 461.54±56.12.66<sup>a</sup>
ADFI(kg/d) 685.22±0.84<sup>b</sup> 776.50±0.00<sup>a</sup>
F/G 1.86±0.87<sup>a</sup> 1.74±0.67<sup>b</sup>
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p＞0.05)。
表8液态发酵饲料对断奶仔猪腹泻及死亡的影响
指标 干料组 液态组
腹泻率(％) 1.11±0.17<sup>a</sup> 0.91±0.33<sup>b</sup>
死亡率(％) 2.08 2.08
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，肩标相同小写字母或者无字母表示差异不显著(p＞0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 新希望六和股份有限公司
四川新希望畜牧科技有限公司
成都枫澜科技有限公司
<120> 一株乳酸片球菌NHE-Pa11403及应用
<130> 2029
<141> 2020-11-16
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> Pediococcus acidilactici
<400> 1
cgaacttccg ttaattgatc atgacgtgct tgcactgaat gagattttaa cacgaagtga 60
gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccaga agcaggggat aacacctgga 120
aacagatgct aataccgtat aacagagaaa accgcctggt tttcttttaa aagatggctc 180
tgctatcact tctggatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240
aaggcgatga tgcgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300
cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca agtctgatgg 360
agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgt taaagaagaa 420
cgtgggtgag agtaactgtt cacccagtga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta 540
aagcgagcgc aggcggtctt ttaagtctaa tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt 600
gcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660
gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg 720
acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 780
taaacgatga ttactaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagtaatccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaagaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcttc tgccaaccta agagattagg cgttcccttc ggggacagaa tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttattac tagttgccag cattcagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg atggtacaac gagtcgcgaa accgcgaggt ttagctaatc tcttaaaacc 1260
attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
atgagagttt gtaacaccca aagccggtgg ggtaaccttt taggagctag ccgtctaa 1438

Claims (9)

1.一株乳酸片球菌NHE-Pa11403，分类命名为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)NHE-Pa11403，于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.21192，保藏地址为中国北京。
2.如权利要求1所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在动物饮水用饲料添加剂上的应用。
3.如权利要求2所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在动物饮水用饲料添加剂上的应用，其中饲料添加剂中乳酸片球菌NHE-Pa11403的活菌数为1.0×106-1.0×1010CFU/g；优选地，饲料添加剂中乳酸片球菌NHE-Pa11403的活菌数为1×107CFU/g。
4.如权利要求1所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在提高饲料转化率、提高动物生产性能中的应用。
5.如权利要求1所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
6.如权利要求5所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用，其中所述的广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、猪伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、产气荚膜杆菌、彭氏变形杆菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌。
7.如权利要求1所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在食品制造中的应用，优选地，所述的食品为动物用食品。
8.如权利要求1所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在断奶仔猪生产中的应用。
9.如权利要求1所述的乳酸片球菌NHE-Pa11403或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
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