CN107828698B - 一种复合菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合菌制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于水产养殖领域，本发明公开了一种复合菌制剂及其制备方法和应用，本发明复合菌制剂采用(1)种子的制备；(2)接种凝结芽孢杆菌；(3)接种丁酸梭菌；(4)接种乳酸菌和酵母菌混合种子液，得到复合菌制剂。本发明复合菌制剂可以应用于在水产养殖，能有效降解养殖池塘中的亚硝酸盐，净化水质，促进我国水产业的健康养殖和高效生产。

Description

一种复合菌制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种复合菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
高密度集约化养殖水体中，积累了大量的饲料残饵及水产动物的排泄物，造成污染有机物增多，水环境生态系统失去平衡，水体中的亚硝酸盐严重超标，引起水产动物疾病的大面积爆发，影响了水产动物的健康生长。微生物能对水体进行修复，具有无毒、无副作用、无残留、无污染、安全可靠、持续时间长，稳水效果好等特点，越来越受到水产养殖行业的关注。
丁酸梭菌又称酪酸菌，作为一种益生菌在日本、韩国早已得到应用。它是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽胞杆菌，可以从土壤和人或者动物的粪便中分离到。研究发现丁酸梭菌有整肠、抗癌、提高免疫力等作用。目前已被制成微生态制剂广泛应用于食品保健、动物饲料等领域。丁酸梭菌有耐高温、耐胆酸盐等特点，既可以产生多种酶和营养物质，又可以抑制有害菌、增殖有益菌，具有非常广阔的应用前景。
丁酸梭菌是专性厌氧芽孢杆菌，不耗氧，其代谢物有机酸能稳定水体pH，代谢物酶类能降解有机质，代谢物抗菌因子能抑制致病菌的生长和繁殖，代谢物B族维生素能促进双歧杆菌和乳酸菌等有益菌的增值。作为水体修复制剂具有天然优势。丁酸梭菌与乳酸菌和酵母菌相互协调才能使得整个养殖环境系统处于生态平衡系统之中，养殖环境中的有机质、氨氮、亚硝酸盐等有害物质处于最低水平。在养殖环境中生物修复方面，丁酸梭菌复合菌制剂就显示了其良好的应用研究前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述不足而提供一种以丁酸梭菌为主体、产品质量稳定、操作简单、无需复配的复合菌制剂的制备方法，本发明产品可以应用于在水产养殖，能有效降解养殖池塘中的亚硝酸盐，净化水质，促进我国水产业的健康养殖和高效生产。
本发明的技术方案是：
一种复合菌制剂，该复合菌的制备方法为：
(1)种子的制备：取凝结芽孢杆菌斜面，用接种环挑取2环菌苔，接种于营养肉汤中，25～38℃条件下摇床培养12～18小时，得到活化菌液；取丁酸梭菌甘油管种子，接种于RCM培养基中，30～38℃条件下静置培养18～28小时，得到活化菌液；取嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母斜面各一支，用接种环挑取2环嗜酸乳杆菌菌苔，接种于YPD液体培养基中，然后用接种环挑取产朊假丝酵母菌苔，接种于同一个YPD液体培养基中，25～30℃条件下静置培养3～7天，得到乳酸菌和酵母菌混合种子液；
(2)接种凝结芽孢杆菌：取凝结芽孢杆菌活化菌液，按1％～10％接种量接种于发酵罐无菌发酵培养基中，通气、搅拌培养2～6小时，然后不通气、低速搅拌培养1～4小时；
(3)接种丁酸梭菌：取丁酸梭菌活化菌液，按1％～10％接种量接种于步骤 (2)所述发酵罐中，不通气、低速搅拌培养18～32小时；
(4)接种乳酸菌和酵母菌混合种子液：取乳酸菌和酵母菌混合种子液，按 1％～10％接种量接种于步骤(3)所述发酵罐中，继续静置培养3～10天，得到以丁酸梭菌为主体的复合菌制剂；
所述步骤(2)中发酵培养基配方为：葡萄糖2～20g/L，酵母粉1～7g/L，氯化钠0.2～1.0g/L，豆粕2～30g/L，玉米浆粉1～10g/L，磷酸氢二钾0.5～2.0g/L，硫酸镁0.1～1.0g/L，硫酸锰0.1～1.0g/L，硫酸亚铁0.1～1.0g/L，碳酸钙1～20g/L。
复合菌制剂在水产养殖领域的应用。
复合菌制剂具有降低养殖水中亚硝酸盐的作用。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明方法，发酵前期先接入蛋白酶能力较强的凝结芽孢杆菌，前期好氧发酵对豆粕进行酶解，便于丁酸梭菌生长繁殖；选择价廉的豆粕作为氮源，并且酶解无需外加蛋白酶，极大地降低了生产成本。
2、本发明方法，采用分段接种、分段培养的方法，实现了复合菌制剂共培养的同时，芽孢率较高，解决了丁酸梭菌与乳酸菌共培养由于pH低导致丁酸梭菌出芽率低的问题。分段接种不同的菌种提高了物料的利用率。丁酸梭菌与乳酸菌混合培养，能有效促进乳酸菌的生长，并增强产品的稳定性。
3、生产的复合菌制剂丁酸梭菌活菌数达5.0×108CFU/mL以上，出芽率高达 90％以上，乳酸菌活菌数达2.0×107CFU/ml以上，酵母菌活菌数达1.0×107CFU/ml 以上。
4、本发明方法生产的复合菌制剂，培养结束后，培养体系pH≤4.5，培养体系稳定。
5、本发明产品可以应用于在水产养殖，能有效降解养殖池塘中的亚硝酸盐，净化水质，促进我国水产业的健康养殖和高效生产。
具体实施方式
下面结合实施例及表格对本发明作进一步详细的描述，本发明的实施方式不限于此。
实施例一
(1)取凝结芽孢杆菌斜面，用接种环挑取2环菌苔，接种于营养肉汤中， 37℃条件下摇床培养16小时，得到活化菌液；取丁酸梭菌甘油管种子，接种于 RCM培养基中，37℃条件下静置培养24小时，得到活化菌液；取嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母斜面各一支，用接种环挑取2环嗜酸乳杆菌菌苔，接种于YPD 液体培养基中，然后用接种环挑取产朊假丝酵母菌苔，接种于同一个YPD液体培养基中，28℃条件下静置培养3天，得到乳酸菌和酵母菌混合种子液。(2) 发酵培养基的配制：葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠1g/L，豆粕16g/L，玉米浆粉5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸亚铁0.2g/L，碳酸钙6g/L。调节pH7.0±0.2，121℃灭菌30分钟，然后冷却。(3)取凝结芽孢杆菌活化菌液，按3％接种量接种于发酵罐无菌发酵培养基中，37℃、1:0.5通气量、200rpm搅拌培养4小时，然后不通气、80rpm搅拌培养2小时。此时凝结芽孢杆菌出芽率为零。(4)取丁酸梭菌活化菌液，按5％接种量接种于上述步骤 (3)所述发酵罐中，37℃、不通气、80rpm搅拌培养24小时，出芽率达到90％以上。(5)取乳酸菌和酵母菌混合种子液，按5％接种量接种于步骤上述(4) 所述发酵罐中，降温至30℃继续培养3天，得到以丁酸梭菌为主体的复合菌制剂。经检测，复合菌制剂丁酸梭菌活菌数达8.0×108CFU/mL，出芽率高达95％，乳酸菌活菌数达3.0×107CFU/ml，酵母菌活菌数达2.5×107CFU/ml，pH4.0。
实施例二
在模拟池塘水中降解亚硝酸盐的测定。
取9个1L的无菌螺口瓶，装约1L养殖池塘水，加入虾饲料2g/L、氯化铵 0.042g/L、亚硝酸钠0.025g/L，115℃灭菌30分钟。1组接1％嗜酸乳杆菌，2组接1％产朊假丝酵母，3组接1％丁酸梭菌，4组接0.33％实施例1复合菌，5组对照组不接菌。30℃，恒温培养箱，静置，定期测定亚硝酸盐含量，亚硝酸盐采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定。试验结果见表1。
表1各菌株在模拟池塘水中亚硝酸盐降解率
Figure BDA0001491949000000051
上述试验结果表明，本发明实施例复合菌在加虾饲料的模拟池塘水样中降解亚硝酸盐能力比乳酸菌和酵母菌强，且复合菌制剂降解亚硝酸盐能力比单一菌株强。
实施例三
选择6个试验水桶，灌入养殖水100升/桶，水深1.0米，每桶放虾苗30尾。试验组投放上述复合菌制剂，用量为0.30毫升/桶，对照组试验水池不投入复合菌制剂，每两天同步检测NO2 --N、观测对虾生长情况，连续检测8天。亚硝酸盐采用广州利洋水产科技有限公司生产的亚硝酸盐快速检测试剂盒测定。试验结果见表2。
表2水体亚硝酸盐随时间变化表
Figure BDA0001491949000000052
Figure BDA0001491949000000061
试验结果：上述试验结果表明，本发明实施例第8天时试验组亚硝酸盐的含量就降低了60％以上，对虾生长良好，充分说明本发明复合菌制剂能够有效的净化水质。
制备实施例包括但不限于上述。

Claims (1)

1.一种具有降低养殖水中亚硝酸盐作用的复合菌制剂，其特征在于，该复合菌制剂的制备方法为：
（1）取凝结芽孢杆菌斜面，用接种环挑取2环菌苔，接种于营养肉汤中，37℃条件下摇床培养16小时，得到活化菌液；取丁酸梭菌甘油管种子，接种于RCM培养基中，37℃条件下静置培养24小时，得到活化菌液；取嗜酸乳杆菌和产朊假丝酵母斜面各一支，用接种环挑取2环嗜酸乳杆菌菌苔，接种于YPD液体培养基中，然后用接种环挑取产朊假丝酵母菌苔，接种于同一个YPD液体培养基中，28℃条件下静置培养3天，得到乳酸菌和酵母菌混合种子液；
（2）发酵培养基的配制：葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠1g/L，豆粕16g/L，玉米浆粉5g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸亚铁0.2g/L，碳酸钙6g/L；调节pH7.0±0.2，121℃灭菌30分钟，然后冷却；
（3）取凝结芽孢杆菌活化菌液，按3%接种量接种于发酵罐无菌发酵培养基中，37℃、1:0.5通气量、200rpm搅拌培养4小时，然后不通气、80rpm搅拌培养2小时，此时凝结芽孢杆菌出芽率为零；
（4）取丁酸梭菌活化菌液，按5%接种量接种于上述步骤（3）所述发酵罐中，37℃、不通气、80rpm搅拌培养24小时，出芽率达到90%以上；
（5）取乳酸菌和酵母菌混合种子液，按5%接种量接种于上述步骤 （4）所述发酵罐中，降温至30℃继续培养3天，得到以丁酸梭菌为主体的复合菌制剂。
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