CN112795524B - 一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法和液体培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，以丁酸梭菌为发酵菌株，将‑80℃冰箱中取出的菌种接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h；然后按2％接种量将种子液接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，并打开空气液封装置阀门。种子培养基和发酵培养基成分为：一水葡萄糖3‑5g/L、可溶性淀粉5‑10g/L、酵母浸膏5‑10g/L、磷酸氢二钾1‑3g/L、硫酸亚铁6‑10g/L、碳酸钙5‑10g/L、番茄粉0.2‑0.8g/L，pH6.5‑7.0。通过硫酸亚铁、碳酸钙及空气液封装置三者相辅相成、协同作用，促使发酵罐内及发酵培养基快速达到厌氧环境，从而解除氧对丁酸梭菌生长的抑制作用，促使丁酸梭菌快速生长繁殖，能使丁酸梭菌活菌数可由7.6*108CFU/mL提升至4.1*109CFU/mL，从而降低生产成本。

Description

一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法和液体培养基
技术领域
本发明涉及厌氧微生物的液体发酵培养及发酵工艺技术领域，尤其涉及丁酸梭菌液体发酵的制备方法。
背景技术
丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，又名酪酸菌，属于梭菌属，是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌。能够发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳水化合物产酸，且能产生淀粉酶，进而水解淀粉后代谢产物为丁酸、醋酸和乳酸。丁酸梭菌在动物肠道内不仅可以促进动物肠道双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌群生长代谢，还能抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，从而达到改善肠道健康，维护益生菌群平衡，减少肠毒素积累。且丁酸梭菌作为一种芽孢杆菌能耐受胃酸、胆盐而进入到肠道，从而发挥其益菌的功能。所以丁酸梭菌可作为一种饲料添加剂使用，以减少抗生素产品的使用或滥用，为替抗、减抗的绿色养殖道路添砖加瓦。
丁酸梭菌作为一种专性厌氧的益生菌，在液体发酵过程中需要保持厌氧环境、稳定的较适pH值，才有利于它的生长、繁殖。多数研究者对丁酸梭菌一般都是采用液体发酵静置培养，但出现培养活菌数较低、活菌数增长缓慢等现象。有些研究者在丁酸梭菌液体发酵生产工艺中通入氮气来营造厌氧环境，通过额外添加碳酸钠、氢氧化钠或氨水等来调节发酵液pH等，这些工艺使得丁酸梭菌的发酵步骤变得繁琐。
所以寻求一种较为经济且在工艺上操作简单的生产工艺技术尤为重要，本发明采用硫酸亚铁来消除发酵液培养基溶解氧，其原理为：12Fe2++3O2+6H2O＝4Fe(OH)3+8Fe3+，从而达到消除氧的目的。其中丁酸梭菌发酵产酸，进而把Fe(OH)3沉淀消除溶解，其原理为：Fe(OH)3+3H+＝3H2O+Fe3+。再利用碳酸钙与丁酸梭菌发酵产生的酸反应，产生二氧化碳，使发酵罐内残留空气通过空气液封装置排除，达到去除空气中氧的目的，而空气液封装置保证了外界空气无法进入到发酵罐内。通过这三者相辅相成、协同作用，促使发酵罐内快速达到厌氧环境，促使丁酸梭菌快速生长繁殖。
发明内容
本发明为了克服现有的丁酸梭菌发酵技术缺点，从而提供了一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，旨在解决如何快速创造厌氧环境及优化生产工艺，以提高丁酸梭菌的活菌数。
本发明采用硫酸亚铁、碳酸钙及空气液封装置，三者相辅相成、协同作用，促使发酵罐内快速达到厌氧环境，促使丁酸梭菌快速生长繁殖。其中硫酸亚铁直接消耗培养基中的溶解氧，碳酸钙与丁酸梭菌发酵产生的酸反应，产生二氧化碳，使发酵罐内残留空气通过空气液封装置排除，达到去除空气中氧的目的，而空气液封装置保证了外界空气无法进入到发酵罐内。
为了实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一种丁酸梭菌液体发酵的液体培养基，成分为：一水葡萄糖3-5g/L、可溶性淀粉5-10g/L、酵母浸膏5-10g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸亚铁6-10g/L、碳酸钙5-10g/L、番茄粉0.2-0.8g/L，pH6.5-7.0。
优选地，所述一种丁酸梭菌液体发酵的液体培养基中，一水葡萄糖作为速效碳源、可溶性淀粉作为缓效碳源，速效碳源使丁酸梭菌快速繁殖，缓效碳源可诱导、促进丁酸梭菌在发酵过程中分泌大量淀粉酶。
优选地，所述一种丁酸梭菌液体发酵的液体培养基中，硫酸亚铁用于去除液体发酵培养基中溶解氧，碳酸钙可与丁酸梭菌发酵产生的酸反应，从而有效减缓pH值下降，维持较适丁酸梭菌生长的pH值环境，且碳酸钙与酸反应产生的二氧化碳有利于快速营造一个厌氧的环境。
优选地，所述一种丁酸梭菌液体发酵的液体培养基中，番茄粉富含多种氨基酸、维生素及微量元素，可为丁酸梭菌繁殖提供生长因子。
一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备种子液：以丁酸梭菌为发酵菌株，将-80℃冰箱中取出的菌种接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h，种子培养基中包含硫酸亚铁和碳酸钙；
(2)制备发酵液：按2％接种量将步骤(1)中制备的种子液接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，并打开空气液封装置阀门，其中，发酵培养基包含硫酸亚铁和碳酸钙，开始发酵过程中无需补加其他原料。
优选地，所述种子培养基成分为：一水葡萄糖3-5g/L、可溶性淀粉5-10g/L、酵母浸膏5-10g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸亚铁6-10g/L、碳酸钙5-10g/L、番茄粉0.2-0.8g/L，pH6.5-7.0。
优选地，所述发酵培养基成分为：一水葡萄糖3-5g/L、可溶性淀粉5-10g/L、酵母浸膏5-10g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、硫酸亚铁6-10g/L、碳酸钙5-10g/L、番茄粉0.2-0.8g/L，pH6.5-7.0。
优选地，所述一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，其搅拌转速为60-80r/min，培养时间18-24h。
优选地，所述一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，其空气液封装置为发酵罐顶部的补料针头中连接一条无菌橡胶软管，软管另一头直接伸入装有碱性溶液的玻璃瓶中，起到排出发酵罐内二氧化碳而外界空气无法进入发酵罐内的作用。
采用上述方案后，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
一、本发明的液体培养基中除碳酸钙，其他皆可全溶，但搅拌开启后，碳酸钙能均匀分布在培养基中，发酵结束后，碳酸钙全部利用溶解完全，发酵液无原料沉淀，有利于后续对菌株的浓缩、菌液分离，且原料成本低。
二、培养基的硫酸亚铁能消耗发酵液中的溶解氧，使发酵液达到无氧环境，解除氧对丁酸梭菌的生长抑制，促使丁酸梭菌快速生长繁殖。
三、培养基的碳酸钙与丁酸梭菌发酵产生的酸反应，从而有效维持较适的pH值生长环境，无需额外加碱调节，从而优化、减少生产工艺步骤。
四、发酵过程中的空气液封装置，有利于排出发酵罐内二氧化碳，从而保持罐内压力为常压，且阻断外界空气进入发酵罐内，从而保证了丁酸梭菌能正常快速的生长。
五、空气液封装置排出发酵罐内二氧化碳的同时，将发酵罐内的残留空气排出，带走空气中的氧气。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案做进一步的描述，故做如下具体实施例，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述范围与菌株丁酸梭菌，同样适用于其他专性厌氧菌株的发酵培养，凡是不背离本发明的构思及等同替代均在本发明的保护范围之内。
实施例1
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，并打开空气液封装置阀门，培养时间20h，检测丁酸梭菌活菌数及发酵液pH值。
其中，所述种子培养基为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。所述发酵培养基为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。硫酸亚铁分别设置不同浓度梯度：0g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L。
通过添加不同硫酸亚铁用量来优化并确定硫酸亚铁的最适用量，具体试验结果如表1所示：
表1
硫酸亚铁浓度 0g/L 2g/L 4g/L 6g/L 8g/L 10g/L
活菌数CFU/mL 2.5*10<sup>9</sup> 2.9*10<sup>9</sup> 3.6*10<sup>9</sup> 3.8*10<sup>9</sup> 4.1*10<sup>9</sup> 4.0*10<sup>9</sup>
pH值 5.41 5.38 5.25 5.20 5.02 5.13
由表1结果数据可知，在硫酸亚铁用量浓度为0-8g/L时，随着硫酸亚铁用量增加，丁酸梭菌活菌数也随之增加。分析原因为发酵罐的培养基在经过高温蒸汽灭菌后会消耗大部分的硫酸亚铁，当硫酸亚铁用量增加，补足了因灭菌过程消耗的那部分硫酸亚铁。而当用量增加至10g/L时，丁酸梭菌活菌数不再增加，那就说明硫酸亚铁用量已经过量了。故通过对本次试验数据分析，可以得出硫酸亚铁最适添加量为8g/L。
实施例2
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，培养时间20h。所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。此实施例培养基中不添加硫酸亚铁、碳酸钙，发酵过程不使用空气液封装置。
实施例3
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，并打开空气液封装置阀门，培养时间20h。所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸亚铁8g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。此实施例为本发明的方案。
实施例4
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，并打开空气液封装置阀门，培养时间20h。所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。此实施例培养基中不添加硫酸亚铁。
实施例5
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，并打开空气液封装置阀门，培养时间20h。所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸亚铁8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。此实施例培养基中不添加碳酸钙。
实施例6
从-80℃冰箱中取出丁酸梭菌接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，培养时间20h。所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸亚铁8g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。此实施例发酵过程不使用空气液封装置。
通过实施例2-6的试验，检测丁酸梭菌活菌数与发酵终点培养基pH值，并分析试验结果，具体各实施例活菌数如表2所示：
表2：
Figure BDA0002981362180000061
由表2试验数据结果分析：
(1)实施例4无添加硫酸亚铁，培养基氧气无法快速去除，导致丁酸梭菌生长较实施例3缓慢，但因为有碳酸钙及空气液封装置，能有效调节发酵培养基的pH值，与及时排出二氧化碳，有利于提高丁酸梭菌活菌数，故活菌数高于实施例2。
(2)实施例5无添加碳酸钙，导致丁酸梭菌发酵产生的酸无法去除，培养基pH值降低，反而抑制了丁酸梭菌的生长，但活菌数高于实施例2是因为添加了硫酸亚铁，除去培养基中溶解氧，解除氧对丁酸梭菌的抑制，且硫酸亚铁与氧反应产生的氢氧化铁也能中和部分酸，故促使丁酸梭菌快速生长。
(3)实施例6中在发酵过程中无开启空气液封装置，碳酸钙与丁酸梭菌发酵产生的酸反应所产生的二氧化碳无法排除发酵罐，导致发酵罐罐压力高达0.15Mpa。在高压环境下，抑制了丁酸梭菌的生长。与实施例2对比，虽说实施例2也无空气液封装置，但实施例2同时也无碳酸钙，故实施例2中无二氧化碳产生，从而不会产生高压环境。
实施例7
从-80℃冰箱中取出植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌分别接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h。后按2％接种量接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，转速80r/min，并打开空气液封装置阀门，培养时间18h。此实施例因为菌株对营养的需求不同而采取与前述不同的培养基。所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖25g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸亚铁8g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。分别检测各自乳酸菌活菌数及发酵液pH值，具体结果如表3所示。
表3
菌株 植物乳杆菌 鼠李糖乳杆菌 干酪乳杆菌 嗜酸乳杆菌
活菌数CFU/mL 8.8*10<sup>9</sup> 8.2*10<sup>9</sup> 6.7*10<sup>9</sup> 7.4*10<sup>9</sup>
pH值 5.10 5.08 5.27 5.19
由表3试验数据结果可知，本发明采用硫酸亚铁、碳酸钙及空气液封装置协同作用的工艺同时适用于一般的厌氧乳酸菌的培养，且在乳酸菌培养的活菌数高于丁酸梭菌。

Claims (2)

1.一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，其特征在于步骤为：
(1)制备种子液：以丁酸梭菌为发酵菌株，将-80℃冰箱中取出的菌种接种到3L种子培养基中，37℃静置培养18h，种子培养基中包含硫酸亚铁和碳酸钙；
(2)制备发酵液：按2％接种量将步骤(1)中制备的种子液接入200L发酵罐的150L发酵培养基中37℃厌氧培养，开启电机搅拌，并打开空气液封装置阀门，其中，发酵培养基包含硫酸亚铁和碳酸钙，开始发酵过程中无需补加其他原料；
步骤(2)中搅拌转速为80r/min，培养时间20h；
所述种子培养基与发酵培养基成分为：一水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉10g/L、酵母浸膏10g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸亚铁8g/L、碳酸钙8g/L、番茄粉0.5g/L，pH7.0。
2.如权利要求1所述的一种丁酸梭菌液体发酵的制备方法，其特征在于：步骤(2)中空气液封装置为发酵罐顶部的补料针头中连接一条无菌橡胶软管，软管另一头直接伸入装有碱性溶液的玻璃瓶中。
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