CN107988137A - 一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法以及高浓丁酸梭菌芽孢制品 - Google Patents

一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法以及高浓丁酸梭菌芽孢制品 Download PDF

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Abstract

一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，涉及微生物发酵技术，其包括将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，于30～37℃下进行厌氧发酵。其通过对培养基成分、发酵条件的优化，使得从发酵液中获得高浓度丁酸梭菌芽孢，又由于发酵培养基成分中采用可溶性碱进行pH调节，整个发酵过程没有引入不溶性成分，便于后期对发酵液进行离心浓缩，总体上可大幅降低生产成本。一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其由上述高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到，其所含由的丁酸梭菌芽孢的浓度高，可广泛应用在保健食品、饲料添加剂、整场药物、微生物菌肥等领域，具有较大的应用价值。

Description

一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法以及高浓丁酸梭菌芽孢制品
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术，具体而言，涉及一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法以及高浓丁酸梭菌芽孢制品。
背景技术
丁酸梭菌是梭状芽孢杆菌属的一种，广泛存在奶酪、人和动物肠道与粪便中、土壤等自然环境中。丁酸梭菌是一种直的或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，端圆，单个或成对，短链，能运动，孢子卵圆，偏心或次端生，其对环境变化具有一定的抗性，丁酸梭菌通过动物肠道时，能耐受胃酸及胆汁酸盐，具有极强的整场作用，抑制肠道内的致病菌，促进肠道中有益菌的生长。这些都使得丁酸梭菌广泛应用在保健食品、饲料添加剂、整场药物、微生物菌肥等领域，是一种较理想的具有广泛开发前景的微生态制剂。
在丁酸梭菌芽孢生产过程中，培养基的配方及发酵条件的控制至关重要，直接影响着发酵液中的芽孢数量。传统丁酸梭菌芽孢生产方法中，发酵液中的丁酸梭菌芽孢浓度不高，用于丁酸梭菌生产的发酵培养基中常用玉米粉、豆饼粉来当微生物生长所需的碳源和氮源，由于玉米粉、豆饼粉水溶性不好，一方面不利于微生物利用，另一方面发酵液残留的这些不溶性成分，会引起后处理困难，使得丁酸梭菌芽孢生产成本较高。因此，丁酸梭菌芽孢生产方法有待改进和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其通过对培养基成分、发酵条件优化，使得从发酵液中获得高浓度丁酸梭菌芽孢，其操作更为简单方便，能够降低生产成本。
本发明的另一目的在于提供一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其由上述高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到，其所含的丁酸梭菌芽孢的浓度高，具有较大的应用价值。
本发明的实施例是这样实现的：
一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括：
将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，于30～37℃下进行厌氧发酵；
其中，发酵培养基包括：麦芽糊精1～5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，酵母自溶粉1～3wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，三水合乙酸钠0.5～1.0wt％，硫酸镁0.1～1wt％，磷酸氢二钾0.1～1wt％，吐温-80 0.1～1wt％，谷氨酸钠0.1～1wt％，以及硅油0.01～0.2wt％。
一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其由上述高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到。
本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例提供了一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，于30～37℃下进行厌氧发酵。其通过对培养基成分、发酵条件的优化，使得从发酵液中获得高浓度丁酸梭菌芽孢，又由于发酵培养基成分中采用可溶性碱进行pH调节，整个发酵过程没有引入不溶性成分，便于后期对发酵液进行离心浓缩，总体上可大幅降低生产成本。
本发明实施例还提供了一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其由上述高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到，其所含由的丁酸梭菌芽孢的浓度高，可广泛应用在保健食品、饲料添加剂、整场药物、微生物菌肥等领域，具有较大的应用价值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法以及高浓丁酸梭菌芽孢制品进行具体说明。
一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括：
将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，于30～37℃下进行厌氧发酵；
其中，发酵培养基包括：麦芽糊精1～5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，酵母自溶粉1～3wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，三水合乙酸钠0.5～1.0wt％，硫酸镁0.1～1wt％，磷酸氢二钾0.1～1wt％，吐温-80 0.1～1wt％，谷氨酸钠0.1～1wt％，以及硅油0.01～0.2wt％。
优选地，发酵培养基包括：麦芽糊精2～4wt％，酵母浸膏1.5～2wt％，酵母自溶粉2～3wt％，硫酸锰0.035～0.045wt％，氯化钙0.06～0.08wt％，硫酸亚铁0.05～0.08wt％，三水合乙酸钠0.6～0.8wt％，硫酸镁0.3～0.8wt％，磷酸氢二钾0.3～0.8wt％，吐温-80 0.3～0.8wt％，谷氨酸钠0.3～0.8wt％，以及硅油0.05～0.15wt％。
优选地，在进行厌氧发酵时，保持50～100rpm的转速进行搅拌。通过搅拌可以使发酵更为均匀。在进行发酵之前，可以先将发酵培养基加热至115～120℃，并保持30～60min进行灭菌，防止杂菌对发酵体系造成污染。
进一步地，可溶性碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的至少一种。现有技术中，主要采用碳酸钙来调控发酵过程中的pH，由于碳酸钙不溶于水，所以其在发酵过程中调控pH的能力较差。而选择可溶性碱则可以实现pH值的快速调控，调控效果好，还不会有固体残留，利于对发酵液进行后续的处理。
同时，采用上述发酵体系再厌氧发酵过程中，发酵培养基的表面不需添加其他物质进行液封，使得发酵结束后，对发酵罐的清洗更加容易，达到环保节约的效果。
进一步地，本发明实施例所提供的一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法还包括在厌氧发酵之前的扩大培养步骤：将初级种子培养液接入到扩大培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，再加入占扩大培养基0.5～1.5wt％的碱式碳酸镁和0.01～0.5wt％的泡敌，于30～37℃下静置培养。同样地，在扩大培养中，采用可溶性碱以实现pH值的快速调控，以对pH值进行精确的控制。同时，在扩大培养过程中，通过添加碱式碳酸镁来稳定pH范围。碱式碳酸镁不溶于水，其能够缓慢的中和丁酸梭菌代谢产生的酸，解除丁酸梭菌生长过程中的酸抑制，并且，其在中和过程释放出了镁离子，镁离子作为菌体生长所需的微量元素，能进一步促进菌体生长。
优选地，扩大培养基包括：麦芽糊精1～3.5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，以及三水合乙酸钠0.5～1.0wt％。
进一步地，本发明实施例所提供的一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法还包括在扩大培养步骤之前的活化培养步骤：将丁酸梭菌的单菌落培养液接入到活化培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，再加入占活化培养基0.5～1.5wt％的碱式碳酸镁和0.01～0.5wt％的泡敌，于30～37℃下静置培养。
优选地，活化培养基包括：麦芽糊精1～3.5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，以及三水合乙酸钠0.5～1.0wt％。
进一步地，单菌落培养液是将分离得到的丁酸梭菌的单菌落与甘油混合，并于-80～-50℃下保藏得到；优选地，甘油的用量占单菌落培养液的10～30wt％。与之对应地，单菌落培养液在接入活化培养基之前，先于75～85℃下恒温处理10～20min。通过恒温处理可以使菌体生长保持一致性，并能有效防止杂菌的污染。
可选地，本发明实施例所提供的一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法还包括在活化培养前的分离步骤：将丁酸梭菌菌种接入分离培养基进行厌氧培养分离得到丁酸梭菌的单菌落，再进行种子培养，并做保藏。
其中，分离培养基包括酵母浸粉0.5～2.5％，胰蛋白胨1～2.5wt％，牛肉粉1～2.5wt％，葡萄糖1～2.5wt％，硫酸镁0.01～1wt％，三水合乙酸钠0.5～1.5wt％，柠檬酸铵0.2～2.0wt％，硫酸锰0.005～0.35wt％，三水磷酸氢二钾0.2～1.0wt％，吐温-80 0.1～0.8wt％，琼脂粉0.1～0.5wt％。
进一步地进行种子培养的培养基包括麦芽糊精1～3.5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，三水合乙酸钠0.5～1.0wt％。进行种子培养时，先将单菌落接入培养基中，加水溶解后用可溶性碱调pH至6.0～7.5，然后再加入0.5～1.5wt％碱式碳酸镁以及泡敌0.01～0.5wt％。
本发明实施例还提供了一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其由上述高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种分离得到丁酸梭菌的单菌落的方法，其包括：
S1.将丁酸梭菌菌种接入分离培养基进行厌氧培养分离得到丁酸梭菌的单菌落。
S2.将丁酸梭菌的单菌落接种到培养基中，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.0±0.1，然后再加入1wt％碱式碳酸镁进行种子培养。
S3.加入种子培养液20wt％的甘油，移至离心管中，于-80℃下进行保藏，得到单菌落培养液。
其中，分离培养基包括酵母浸粉0.5wt％，胰蛋白胨1wt％，牛肉粉1wt％，葡萄糖2wt％，硫酸镁0.01wt％，三水合乙酸钠0.5wt％，柠檬酸铵0.2wt％，硫酸锰0.005wt％，三水磷酸氢二钾0.2wt％，吐温-80 0.1wt％，琼脂粉0.5wt％，pH自然。
进行种子培养的培养基包括麦芽糊精2wt％，酵母浸膏(LM800)1wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％。
实施例2
本实施例提供一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括：
S1.取实施例1中所提供的单菌落培养液接种到活化培养基中，用氢氧化钠调节pH至7.0±0.1，再加入占活化培养基1wt％的碱式碳酸镁，于37℃下静置培养，得到初级种子培养液。
S2.将初级种子培养液接入到扩大培养基中，用氢氧化钠调节pH至7.0±0.1，再加入占活化培养基1wt％的碱式碳酸镁，于37℃下静置培养，得到种子培养液。
S3.将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用氢氧化钠调节pH至6.3，搅拌转速100rpm，于35℃下进行厌氧发酵。
其中，活化培养基和扩大培养基的组分均包括：麦芽糊精2wt％，酵母浸膏(LM800)1wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％。
发酵培养基包括：麦芽糊精4wt％，酵母浸膏2wt％，酵母自溶粉1wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％，硫酸镁0.5wt％，磷酸氢二钾0.3wt％，吐温-80 0.1wt％，谷氨酸钠0.3wt％，硅油0.02wt％。
厌氧发酵27h后测定发酵液中丁酸梭菌总菌和芽孢数量分别达到20.8亿/mL和21.0亿/mL。
实施例3
本实施例提供一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括：
S1.取实施例1中所提供的单菌落培养液接种到活化培养基中，用氢氧化钠调节pH至6.5，再加入占活化培养基1wt％的碱式碳酸镁，于37℃下静置培养，得到初级种子培养液。
S2.将初级种子培养液接入到扩大培养基中，用氢氧化钠调节pH至6.5，再加入占活化培养基1wt％的碱式碳酸镁，于37℃下静置培养，得到种子培养液。
S3.将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用氢氧化钠调节pH至7.5，搅拌转速50rpm，于30℃下进行厌氧发酵。
其中，活化培养基和扩大培养基的组分均包括：麦芽糊精3.5wt％，酵母浸膏(LM800)1wt％，硫酸锰0.05wt％，氯化钙0.1wt％，硫酸亚铁0.1wt％，三水合乙酸钠0.5wt％。
发酵培养基包括：麦芽糊精1wt％，酵母浸膏2.5wt％，酵母自溶粉3wt％，硫酸锰0.05wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％，硫酸镁1wt％，磷酸氢二钾1wt％，吐温-80 1wt％，谷氨酸钠1wt％，硅油0.01wt％。
厌氧发酵35h后测定发酵液中丁酸梭菌总菌和芽孢数量分别达到20.3亿/mL和19.9亿/mL。
实施例4
本实施例提供一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括：
S1.取实施例1中所提供的单菌落培养液接种到活化培养基中，用氢氧化钠调节pH至7.5，再加入占活化培养基1wt％的碱式碳酸镁，于37℃下静置培养，得到初级种子培养液。
S2.将初级种子培养液接入到扩大培养基中，用氢氧化钠调节pH至7.5，再加入占活化培养基1wt％的碱式碳酸镁，于37℃下静置培养，得到种子培养液。
S3.将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用氢氧化钠调节pH至6.0，搅拌转速100rpm，于35℃下进行厌氧发酵。
其中，活化培养基和扩大培养基的组分均包括：麦芽糊精1wt％，酵母浸膏(LM800)2.5wt％，硫酸锰0.05wt％，氯化钙1wt％，硫酸亚铁0.1wt％，三水合乙酸钠1wt％。
发酵培养基包括：麦芽糊精5wt％，酵母浸膏1wt％，酵母自溶粉3wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙1wt％，硫酸亚铁0.1wt％，三水合乙酸钠1wt％，硫酸镁1wt％，磷酸氢二钾1wt％，吐温-80 1wt％，谷氨酸钠1wt％，硅油0.2wt％。
厌氧发酵27h后测定发酵液中丁酸梭菌总菌和芽孢数量分别达到20.1亿/mL和20.4亿/mL。
实施例5
本实施例提供一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括：
S1.取实施例1所提供的单菌落培养液置于80℃水浴锅中高温处理10min。
S2.取处理后的单菌落培养液1mL接种于装有200mL活化培养基的250mL三角瓶中，于37℃条件下静止培养24h以形成芽孢，得到初级种子培养液。
其中，活化培养基组分包括：麦芽糊精2wt％，酵母浸膏(LM800)1wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％。活化培养基在加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.0±0.1，然后再加入1wt％碱式碳酸镁。
S2.无菌条件下以1％的接种量(即4mL)将上述初级种子培养液接种到装有400mL扩大培养基的500mL三角瓶中，于37℃条件下静止培养24h以形成芽孢，得到种子培养液。
其中，活化培养基的组分包括：麦芽糊精2wt％，酵母浸膏(LM800)1wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％，加水溶解后用氢氧化钠溶液调pH至7.0±0.1，然后再加入1wt％的碱式碳酸镁。
S3.在30L发酵罐中装入15L发酵培养基，115℃灭菌30min结束后，关闭进罐蒸汽，稍微打开发酵罐罐体尾气阀门使其自然降温，降至105℃时，关闭尾气阀门并用无菌八层纱布封住出气口，手动注入冷却水降温至100℃以下，打开尾气阀门，当培养基温度降至85℃时，停止降温并将400mL三角瓶种子菌液接入发酵罐中，搅拌转速100rpm保温10min，时间结束后自动降温至35℃开始发酵。
清液发酵过程中温度控制35℃，搅拌转速100rpm，不通风厌氧发酵，用20wt％的氢氧化钠溶液控制发酵的pH 6.30，发酵全程中尾气阀门全开。
其中，发酵培养基的组分包括：麦芽糊精4wt％，酵母浸膏2wt％，酵母自溶粉1wt％，硫酸锰0.025wt％，氯化钙0.05wt％，硫酸亚铁0.03wt％，三水合乙酸钠0.5wt％，硫酸镁0.5wt％，磷酸氢二钾0.3wt％，吐温-80 0.1wt％，谷氨酸钠0.3wt％，硅油0.02wt％。
厌氧发酵27h后测定发酵液中丁酸梭菌总菌和芽孢数量分别达到21.4亿/mL和21.6亿/mL。
综上所述，本发明本发明实施例提供了一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其包括将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，于30～37℃下进行厌氧发酵。其通过对培养基成分、发酵条件的优化，使得从发酵液中获得高浓度丁酸梭菌芽孢，又由于发酵培养基成分中采用可溶性碱进行pH调节，整个发酵过程没有引入不溶性成分，便于后期对发酵液进行离心浓缩，总体上可大幅降低生产成本。
本发明实施例还提供了一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其由上述高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到，其所含由的丁酸梭菌芽孢的浓度高，可广泛应用在保健食品、饲料添加剂、整场药物、微生物菌肥等领域，具有较大的应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，包括：
将丁酸梭菌的种子培养液接入到发酵培养基中，用可溶性碱调节pH至6.0～7.5，于30～37℃下进行厌氧发酵；
其中，所述发酵培养基包括：麦芽糊精1～5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，酵母自溶粉1～3wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，三水合乙酸钠0.5～1.0wt％，硫酸镁0.1～1wt％，磷酸氢二钾0.1～1wt％，吐温-80 0.1～1wt％，谷氨酸钠0.1～1wt％，以及硅油0.01～0.2wt％。
2.根据权利要求1所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，在进行厌氧发酵时，保持50～100rpm的转速进行搅拌。
3.根据权利要求1所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，所述可溶性碱包括氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，还包括在厌氧发酵之前的扩大培养步骤：将初级种子培养液接入到扩大培养基中，用所述可溶性碱调节pH至6.0～7.5，再加入占所述扩大培养基0.5～1.5wt％的碱式碳酸镁和0.01～0.5wt％的泡敌，于30～37℃下静置培养。
5.根据权利要求4所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，所述扩大培养基包括：麦芽糊精1～3.5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，以及三水合乙酸钠0.5～1.0wt％。
6.根据权利要求4或5所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，还包括在所述扩大培养步骤之前的活化培养步骤：将丁酸梭菌的单菌落培养液接入到活化培养基中，用所述可溶性碱调节pH至6.0～7.5，再加入占所述活化培养基0.5～1.5wt％的碱式碳酸镁和0.01～0.5wt％的泡敌，于30～37℃下静置培养。
7.根据权利要求6所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，所述活化培养基包括：麦芽糊精1～3.5wt％，酵母浸膏1～2.5wt％，硫酸锰0.025～0.05wt％，氯化钙0.05～1wt％，硫酸亚铁0.03～0.1wt％，以及三水合乙酸钠0.5～1.0wt％。
8.根据权利要求6所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，所述单菌落培养液是将分离得到的丁酸梭菌的单菌落与甘油混合，并于-80～-50℃下保藏得到；优选地，所述甘油的用量占所述单菌落培养液的10～30wt％。
9.根据权利要求8所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法，其特征在于，所述单菌落培养液在接入所述活化培养基之前，先于75～85℃下恒温处理10～20min。
10.一种高浓丁酸梭菌芽孢制品，其特征在于，由权利要求1～9任一项所述的高浓丁酸梭菌芽孢生产方法制备得到。
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