CN106929440A - 一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法及应用 - Google Patents

一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法及应用。该发酵方法包括如下步骤：S100、接种发酵：将丁酸梭菌种子液按照体积分数5～10％接种至丁酸梭菌发酵培养基，pH6.0～6.5、温度35～38℃下培养10～20h；S200、补料发酵：流加混合碳源，补料发酵20～40小时；所述混合碳源包括60～100g/L糖、100～140g/L乙酸钠；S300、孢子化发酵：补料发酵完成后，补加含钙、镁、锰的复合液，孢子化发酵10～30小时，使丁酸梭菌孢子化。该发酵方法在大幅提高丁酸梭菌菌体浓度的同时，促进代谢产物丁酸的合成，可同时生产出了高性价比的丁酸梭菌和丁酸，工业化优势进一步提升，效益提升的同时也实现和满足了环保要求。

Description

一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法及应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵工程领域，更具体的说，涉及一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法及应用。
背景技术
肠道微生物群已成为国内外学术、生产应用关注的重点，作为调节肠道微生物群平衡、替代抗生素使用的微生态制剂在动物肠道健康中应用越来越受到全社会的关注。但受制于微生物研究方法和生产技术，行业内主要以生产好氧菌和兼性厌氧菌为主流。动物肠道微生物群99％以上是严格厌氧菌，而且通过肠道宏基因组研究发现其中厌氧菌中又以共生梭菌为主。所以未来动物微生态制剂的研发方向和趋势是厌氧菌的菌种筛选、产业化发酵系统创建、稳定型产品开发等。丁酸梭菌属于产芽孢的、肠道严格厌氧的共生梭菌群的一员，是近年来厌氧型微生态制剂的研发重点，但受制于厌氧发酵技术和产品稳定性，丁酸梭菌行业整体发酵生产水平不高，且芽孢率低，不能形成有竞争力的商品化产品。
丁酸是一种重要的化工原料，在食品、医药、农业、能源工业等领域应用广泛。丁酸主要有两种生产方式：化工合成法和生物发酵法。化工合成法成本优势较大，但受制于石油工业原料，且环保问题严重。生物发酵法存在产物浓度低，后处理量大等问题，但其生产条件温和，能耗低，污染小，而且原料来源广泛，适于生产高级别丁酸产品(食品和医药级丁酸)的要求。丁酸梭菌作为发酵法生产丁酸的主要菌种之一，其核心代谢产物就是丁酸，从其发酵液中提取丁酸是获取丁酸的一种可行有效的方式。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于：提供一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法，解决现有工艺中菌体浓度不高、代谢产物丁酸的合成量低问题。
本发明所要解决的技术问题之二在于：提供一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法的应用，解决现有工艺过程中，微生态制剂厂商只获取丁酸梭菌菌体，化工能源生产只获取发酵产物丁酸，不能充分发挥发酵产物的价值。
本发明解决上述技术问题的方案在于：提供一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法，包括如下步骤：
S100、接种发酵：将丁酸梭菌种子液按照体积分数(V/V)5～10％接种至丁酸梭菌发酵培养基，pH6.0～6.5、温度35～38℃下培养10～20h，使得丁酸梭菌快速适应期，进入对数分裂期。
S200、补料发酵：流加混合碳源，补料发酵20～40小时；混合碳源包括60～100g/L糖、100～140g/L乙酸钠；糖为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖中的至少一种，也可以使用淀粉水解液、糖蜜等替代；乙酸钠的乙酸体作为丁酸发酵过程中一个关键物，参与丁酸发酵反应的最后过程—丁酰CoA形成丁酸，同时该过程中乙酸形成乙酰CoA，补充丁酸发酵过程中高效碳源，可提高发酵产物积累效率。而且丁酸梭菌发酵过程中会产生少量乙酸，外源可控添加乙酸钠，将反馈抑制乙酸产生，有利于提高发酵终产物丁酸纯化和纯度。补料发酵结束时，丁酸梭菌含量高达10～20亿CFU/ml，丁酸含量可到25～30g/L。
S300、孢子化发酵：补料发酵完成后，补加含钙、镁、锰的复合液，孢子化发酵10～30小时，使丁酸梭菌孢子化。钙、镁、锰盐复合液的补加量和补加速度可根据发酵液体积作相应调整，例如，1000L的发酵罐中，含钙、镁、锰的复合液浓度优选为20～30g/L，流加速度5～15L/h，总量10～30L。丁酸梭菌在含钙、镁、锰的复合液作用下迅速孢子化，孢子化率高达90％，孢子化后的丁酸梭菌抗逆性大幅增强，不会因干燥、高温等而失活，便于制备微生物制剂。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，步骤S100之前还包括：
S001、一级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将丁酸杆菌菌种管按照体积分数0.1～1％接种至种子培养基中，35～38℃下培养20～30h，制得一级种子液；
S002、二级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将一级种子液按照体积分数0.2～2％接种至种子培养基中，35～38℃下培养10～20h制得二级种子液；
S003、发酵培养基配制：配制发酵培养基，灭菌后冷却至室温。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，1L种子培养基包括酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g，余量为水；pH 7.0～7.2；
1000L发酵培养基包括葡萄糖20kg，玉米粉3.3kg，豆粕粉40kg，硫酸铵1kg，蛋白胨4.5kg，酵母膏1.8kg，小苏打1.2kg，磷酸二氢钾1.8kg，碳酸钙1.8kg，硫酸镁0.63kg，硫酸锰0.18kg，消泡剂1L，余量为水；pH 7.0～7.5。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，步骤S200中：采用连续或者分阶段的方式流加混合碳源，流加的混合碳源总量占发酵液的体积分数为0.5～5％。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，步骤S300中：采用连续或者分阶段的方式补加含钙、镁、锰的复合液，含钙、镁、锰的复合液包括包括Ca2+、Mg2+、Mn2+。例如，使用氯化钙、硫酸镁、硫酸锰配制所述含钙、镁、锰的复合液，Ca2+、Mg2+、Mn2+的浓度大于0.01mol/L。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，步骤S300之后还包括：
S400、孢子分离：菌液分离后收集菌体孢子，干燥制成原粉级丁酸梭菌；
S500、丁酸提取：菌液分离后的发酵清液，萃取丁酸。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，步骤S400中，使用喷雾干燥塔干燥菌体孢子，喷雾干燥塔的干燥参数：进风温度140～200℃，出风温度60～80℃。菌体孢子喷雾干燥后，可制成50亿/克原粉级丁酸梭菌。
在本发明提供的高浓度丁酸梭菌的发酵方法中，步骤S500具体包括：
S501、调节发酵清液的pH至3.0；也可以事先离心或膜过滤发酵清液，再用盐酸等常规无机酸调节pH；
S502、磷酸三丁酯与N235按体积比70～100:0～30混合制成萃取剂；磺化煤油与大豆油按体积比0～50:50～100混合制成稀释剂；其中，N235的学名三(辛-癸)烷基叔胺；
S503、萃取剂与稀释剂按体积比20～50:50～80混合制成萃取液，萃取液与发酵清液混合后分离出有机相，例如，萃取液与发酵液等比例混合于反应釜中，恒温25℃、100rpm搅拌20分钟，静置待两相平衡，可快速实现；使用碳酸钠水溶液反萃取有机相，搅拌后静置，待两相平衡后分离出水相，得到高浓度丁酸，例如，有机相与1M碳酸钠等比例混合反萃取，恒温25℃、100rpm搅拌20分钟，丁酸收率可到85％。若要高纯度回收，可进行多次萃取-反萃取工艺，丁酸总收率可达95％。
本发明还提供上述任意一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法，在丁酸制备和/或丁酸梭菌制备过程中的应用。
实施本发明，具有如下有益效果：建立了高浓度丁酸梭菌发酵方法及其孢子化工艺技术，在发酵过程中大幅提高丁酸梭菌菌体浓度的同时，促进代谢产物丁酸的合成。孢子化的丁酸梭菌，经过收集、干燥制成原粉级微生态制剂；发酵液经过特定条件下的萃取系统萃取后，实现丁酸的高纯度回收。同时生产出了高性价比的丁酸梭菌和丁酸，工业化优势进一步提升，效益提升的同时也实现和满足了环保要求。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
1)、生物发酵高浓度丁酸梭菌
1.1一级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将丁酸杆菌菌种管按照体积分数(V/V)0.1％接种至种子培养基中，35℃下培养30h，制得一级种子液；
1.2二级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将一级种子液按照体积分数(V/V)0.2％接种至种子培养基中，35℃下培养20h制得二级种子液；
1.3发酵培养基配制：配制发酵培养基，灭菌后冷却至室温；
1.4接种发酵：将丁酸梭菌种子液按照体积分数(V/V)5％接种至丁酸梭菌发酵培养基，pH6.0、温度35℃下培养20h；
1.5补料发酵：流加混合碳源，补料发酵40小时；混合碳源包括100g/L糖、140g/L乙酸钠；采用连续的方式流加混合碳源，流加的混合碳源总量占发酵液的体积分数(V/V)为5％。
2)、丁酸梭菌孢子化发酵
补料发酵完成后，采用连续的方式补加含钙、镁、锰的复合液，孢子化发酵10小时，使丁酸梭菌孢子化。
3)、微生态制剂的制备
菌液分离后收集菌体孢子，使用喷雾干燥塔干燥菌体孢子，喷雾干燥塔的干燥参数：进风温度140℃，出风温度60℃；菌体孢子喷雾干燥制成50亿/克原粉级丁酸梭菌。
4)、丁酸萃取
4.1菌液分离后的发酵清液，离心或膜过滤去杂，调节发酵清液的pH至3.0；
4.2磷酸三丁酯作为萃取剂；磺化煤油与大豆油按体积比50:50混合制成稀释剂；
4.3萃取剂与稀释剂按体积比20:80混合制成萃取液，萃取液与发酵清液混合后分离出有机相；使用碳酸钠水溶液反萃取有机相，搅拌20min后静置待两相平衡后分离出水相，得到高浓度丁酸。
实施例2
1)、生物发酵高浓度丁酸梭菌
1.1一级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将丁酸杆菌菌种管按照体积分数(V/V)1％接种至种子培养基中，38℃下培养20h，制得一级种子液；
1.2二级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将一级种子液按照体积分数(V/V)2％接种至种子培养基中，38℃下培养10h制得二级种子液；
1.3发酵培养基配制：配制发酵培养基，灭菌后冷却至室温；
1.4接种发酵：将丁酸梭菌种子液按照体积分数(V/V)10％接种至丁酸梭菌发酵培养基，pH6.5、温度38℃下培养10h；
1.5补料发酵：流加混合碳源，补料发酵20小时；混合碳源包括60g/L糖、100g/L乙酸钠；采用分阶段的方式流加混合碳源，流加的混合碳源总量占发酵液的体积分数(V/V)为0.5％。
2)、丁酸梭菌孢子化发酵
补料发酵完成后，采用分阶段的方式补加含钙、镁、锰的复合液，孢子化发酵30小时，使丁酸梭菌孢子化。
3)、微生态制剂的制备
菌液分离后收集菌体孢子，使用喷雾干燥塔干燥菌体孢子，喷雾干燥塔的干燥参数：进风温度200℃，出风温度80℃；菌体孢子喷雾干燥制成50亿/克原粉级丁酸梭菌；
4)、丁酸萃取
4.1菌液分离后的发酵清液，离心或膜过滤去杂，调节发酵清液的pH至3.0；
4.2磷酸三丁酯与N235按体积比70:30混合制成萃取剂；大豆油按作为稀释剂；
4.3萃取剂与稀释剂按体积比50:50混合制成萃取液，萃取液与发酵清液混合后分离出有机相；使用碳酸钠水溶液反萃取有机相，搅拌20min后静置待两相平衡后分离出水相，得到高浓度丁酸。
实施例3
1)、生物发酵高浓度丁酸梭菌
1.1一级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将丁酸杆菌菌种管按照体积分数(V/V)0.6％接种至种子培养基中，37℃下培养25h，制得一级种子液；
1.2二级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将一级种子液按照体积分数(V/V)1％接种至种子培养基中，37℃下培养15h制得二级种子液；
1.3发酵培养基配制：配制发酵培养基，灭菌后冷却至室温；
1.4接种发酵：将丁酸梭菌种子液按照体积分数(V/V)8％接种至丁酸梭菌发酵培养基，pH6.3、温度37℃下培养15h；
1.5补料发酵：流加混合碳源，补料发酵30小时；混合碳源包括80g/L糖、120g/L乙酸钠；采用连续的方式流加混合碳源，流加的混合碳源总量占发酵液的体积分数(V/V)为3％。
2)、丁酸梭菌孢子化发酵
补料发酵完成后，采用连续的方式补加含钙、镁、锰的复合液，孢子化发酵10～30小时，使丁酸梭菌孢子化。
3)、微生态制剂的制备
3.1孢子分离：菌液分离后收集菌体孢子，使用喷雾干燥塔干燥菌体孢子，喷雾干燥塔的干燥参数：进风温度160℃，出风温度70℃；菌体孢子喷雾干燥制成50亿/克原粉级丁酸梭菌；
4)、丁酸萃取
4.1菌液分离后的发酵清液，离心或膜过滤去杂，调节发酵清液的pH至3.0；
4.2磷酸三丁酯与N235按体积比85:15混合制成萃取剂；磺化煤油与大豆油按体积比20:80混合制成稀释剂；
4.3萃取剂与稀释剂按体积比30:70混合制成萃取液，萃取液与发酵清液混合后分离出有机相；使用碳酸钠水溶液反萃取有机相，搅拌20min后静置待两相平衡后分离出水相，得到高浓度丁酸。
显然，上面描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
S100、接种发酵：将丁酸梭菌种子液按照体积分数5～10％接种至丁酸梭菌发酵培养基，pH6.0～6.5、温度35～38℃下培养10～20h；
S200、补料发酵：流加混合碳源，补料发酵20～40小时；所述混合碳源包括60～100g/L糖、100～140g/L乙酸钠；
S300、孢子化发酵：补料发酵完成后，补加含钙、镁、锰的复合液，孢子化发酵10～30小时，使丁酸梭菌孢子化。
2.根据权利要求1所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤S100之前还包括：
S001、一级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将丁酸杆菌菌种管按照体积分数0.1～1％接种至种子培养基中，35～38℃下培养20～30h，制得一级种子液；
S002、二级种子制备：配制种子培养基，灭菌后冷却至室温，将所述一级种子液按照体积分数0.2～2％接种至种子培养基中，35～38℃下培养10～20h制得二级种子液；
S003、发酵培养基配制：配制发酵培养基，灭菌后冷却至室温。
3.根据权利要求2所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，
1L所述种子培养基包括酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g；pH 7.0～7.2；
1000L所述发酵培养基包括葡萄糖20kg，玉米粉3.3kg，豆粕粉40kg，硫酸铵1kg，蛋白胨4.5kg，酵母膏1.8kg，小苏打1.2kg，磷酸二氢钾1.8kg，碳酸钙1.8kg，硫酸镁0.63kg，硫酸锰0.18kg，消泡剂1L；pH 7.0～7.5。
4.根据权利要求1所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤S200中：采用连续或者分阶段的方式流加所述混合碳源，流加的所述混合碳源总量占发酵液的体积分数为0.5～5％。
5.根据权利要求1所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤S300中：采用连续或者分阶段的方式补加所述含钙、镁、锰的复合液，所述含钙、镁、锰的复合液包括Ca2+、Mg2+、Mn2+。
6.根据权利要求1所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤S300之后还包括：
S400、孢子分离：菌液分离后收集菌体孢子，干燥制成原粉级丁酸梭菌；
S500、丁酸提取：菌液分离后的发酵清液，萃取丁酸。
7.根据权利要求6所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤S400中，使用喷雾干燥塔干燥所述菌体孢子，喷雾干燥塔的干燥参数：进风温度140～200℃，出风温度60～80℃。
8.根据权利要求6所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，其特征在于，所述步骤S500具体包括：
S501、调节所述发酵清液的pH至3.0；
S502、磷酸三丁酯与N235按体积比70～100:0～30混合制成萃取剂；磺化煤油与大豆油按体积比0～50:50～100混合制成稀释剂；
S503、萃取剂与稀释剂按体积比20～50:50～80混合制成萃取液，所述萃取液与所述发酵清液混合后分离出有机相；使用碳酸钠水溶液反萃取所述有机相，搅拌后静置，待两相平衡后分离出水相，得到高浓度丁酸。
9.权利要求1～8中任意一项所述的高浓度丁酸梭菌的发酵方法，在丁酸制备和/或丁酸梭菌制备过程中的应用。
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