CN108504697A - 一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法 - Google Patents

一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期在80‑85℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期。

Description

一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法
技术领域
本发明涉及丁酸梭菌发酵制备丁酸领域，具体是一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法。
背景技术
长期以来，饲用抗生素在保障动物健康、促进动物生长、提高饲料利用率等方面效果明显，给畜禽生产带来了巨大的经济效益。但随着人民生活水平的提高和健康意识的加强，饲用抗生素所带来的抗药性和药物残留等问题也日益受到人们的重视，于是各国政府纷纷出台措施严格控制抗生素作为饲料添加剂应用。因此，开发抗生素替代品成为饲料添加剂研究的热点。短链脂肪酸(SCFA)包括乙酸、丙酸和丁酸，其中起主要作用的是丁酸。主要来自大肠中厌氧杆菌对碳水化合物和蛋白质的酵解作用，是结肠上皮细胞能量的主要来源，丁酸具有水、脂两亲的特性,偏重于亲脂，pH值在4～6时不易被分解，动物摄食后大部分能避过酸性环境的小肠，直接进入盲肠和结肠继续发挥作用。作为一种生物调节剂，丁酸在维持细胞的分化和结肠上皮的完整性、提高动物生产性能方面发挥着重要作用。
丁酸是一种重要的化工原料，广泛应用于化工产品、食品添加剂以及医药产品的生产。目前，丁酸的工业生产主要采用源于石油化工行业的正丁醛氧化法。进入21世纪以来，石油等矿石资源日益枯竭，寻找可再生能源物质的任务变的更加急迫。生物质是唯一可以大规模再生，足以支持人类发展的资源。非粮食类的生物质资源来源丰富，价格低廉，如能以此作为原料用于生产丁酸，将改变丁酸生产过程中对矿石资源过度依赖的现状，降低原料成本，减少生产过程中对环境的污染。
目前微生物发酵生产丁酸是生物质能研究的一个热点，但是从发酵液中提取丁酸的研究很少。
丁酸在维持细胞的分化和结肠上皮的完整性、提高动物生产性能方面发挥着重要作用，可降低猪的腹泻率，提高猪的生长速度，降低料肉比，减少猪喂养过程中的抗生素使用量。因此，生物法生产丁酸也会随着研究的深入而越来越展现其优势，尤其是将生物法生产丁酸与养殖猪结合，将会成为环保养殖的重要发展趋势。加之丁酸的可观的市场前景，生物法大规模生产丁酸将是未来的一个发展趋势。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，研发出一种提高生物丁酸产量多级发酵工艺。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔6-8h，在80-85℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期。
优选地，所述步骤S1中将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔7h，在82℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株。
优选地，所述步骤S3中的一级培养基由以下重量组分配比的的原料制成：酵母膏0.3％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，可溶性淀粉0.1％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.05％，乙酸钠0.3％，余量为水。
优选地，所述步骤S3中碳酸钠溶液滴加总量为发酵液总量的1.3％。
优选地，所述步骤S3中的二级培养基由以下重量组分配比的的原料制成：葡萄糖2％，淀粉0.35％，玉米粉0.37％，豆粕粉4.5％，硫酸铵0.1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.2％，小苏打0.124％，磷酸二氢钾0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.07％，硫酸锰0.02％，硫化钙0.6％，消泡剂0.15％，余量为水。
优选地，控制所述步骤S1-S4全程培养时间为72-78h，培养温度为37℃。
有益效果
本发明公开一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，丁酸梭菌发酵产生大量的丁酸，可作为生物法生产丁酸的工业化生产，丁酸在维持细胞的分化和结肠上皮的完整性、提高动物生产性能方面发挥着重要作用，可降低猪的腹泻率，提高猪的生长速度，降低料肉比，减少猪喂养过程中的抗生素使用量。
由于本发明所用菌株为动物益生菌菌株，菌体更容易定植于猪的肠道内，且所用菌株属于益生菌，对猪无任何副作用
实施例1:
一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔7h，在82℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期，培养完毕得到丁酸发酵液，采用气相色谱法检测脂肪酸含量为120mg/g。
其中，一级培养基由以下重量组分配比的的原料制成：酵母膏0.3％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，可溶性淀粉0.1％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.05％，乙酸钠0.3％，余量为水。
其中，二级培养基由以下重量组分配比的的原料制成：葡萄糖2％，淀粉0.35％，玉米粉0.37％，豆粕粉4.5％，硫酸铵0.1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.2％，小苏打0.124％，磷酸二氢钾0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.07％，硫酸锰0.02％，硫化钙0.6％，消泡剂0.15％，余量为水。
其中，控制步骤S1-S4全程培养时间为78h，培养温度为37℃。
实施例2:
一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔6h，在80℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期，培养完毕得到丁酸发酵液，采用气相色谱法检测脂肪酸含量为118mg/g。
其中，一级培养基和二级培养基的组成如实施例1。
其中，控制步骤S1-S4全程培养时间为72h，培养温度为37℃。
实施例3:
一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔8h，在85℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期，培养完毕得到丁酸发酵液，采用气相色谱法检测脂肪酸含量为123mg/g。
其中，一级培养基和二级培养基的组成如实施例1。
其中，控制步骤S1-S4全程培养时间为75h，培养温度为37℃。
实施例4:
一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔7h，在82℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期，培养完毕得到丁酸发酵液，采用气相色谱法检测脂肪酸含量为125mg/g。
其中，一级培养基和二级培养基的组成如实施例1。
其中，控制步骤S1-S4全程培养时间为74h，培养温度为37℃。
实施例5:
一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，所述显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔7.5h，在84℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期，培养完毕得到丁酸发酵液，采用气相色谱法检测脂肪酸含量为130mg/g。
其中，一级培养基和二级培养基的组成如实施例1。
其中，控制步骤S1-S4全程培养时间为76h，培养温度为37℃。
试验验证：
1.1将本发明实施例1制备得到的发酵液稀释后，添加到30日龄断奶仔猪的饮水中，持续喂养15日观察仔猪的生长情形以及腹泻情形。其中实验组和对照组各20头断奶仔猪，实验组共三组，分别为试验1-3组，试验1-3组中的菌落总数依次为104CFU/ml、105CFU/ml、106CFU/ml，对照组为常规饮水。其中生长情形统计如表1所示，腹泻情形如表2所示：
表1丁酸梭菌TB11饮剂对断奶仔猪生产性能的影响
表2腹泻情况观察结果
1.2耐受菌株存活试验：
将实施例1中S1步骤中的丁酸梭菌的耐受菌株，进行耐热试验，试验方法为：将耐受菌株放置到70-90℃热水中，处理5min后计算活菌率(存活菌数/总菌数)，试验结果如表3所示：
表3耐热试验
由表1-3可知本发明得到发酵液能够显著提高仔猪的生长状况，改善仔猪腹泻情况，以及耐受菌株具有较佳的耐热性。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，包括语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，其特征在于，提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法包括以下步骤：
S1、将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔6-8h，在80-85℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株；
S2、将步骤S1中的耐受菌株接种至液体摇瓶培养基中培养至对数期后得到一级种子；
S3、取步骤S2中的一级种子菌种总量的1％接种至50L的种子罐中的一级培养基中，培养至对数生长期后得到二级种子；
S4、取步骤S3中的二级种子菌种总量的1.5％接种至1800L的发酵罐中二级培养基中培养至对数期，检测培养液pH至5.5时，往发酵罐中滴加质量分数为12％碳酸钠溶液，继续培养至芽孢后期。
2.根据权利要求1所述的显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，其特征在于，所述步骤S1中将丁酸梭菌接种到培养基中，培养至培养液的pH小于3.5，在丁酸梭菌芽孢形成前期每隔7h，在82℃水浴条件下进行耐受处理，收集耐受处理后的菌液，分离耐受菌株。
3.根据权利要求1所述的显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，其特征在于，所述步骤S3中的一级培养基由以下重量组分配比的的原料制成：酵母膏0.3％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，可溶性淀粉0.1％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.5％，半胱氨酸盐酸盐0.05％，乙酸钠0.3％，余量为水。
4.根据权利要求1所述的显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，其特征在于，所述步骤S3中碳酸钠溶液滴加总量为发酵液总量的1.3％。
5.根据权利要求1所述的显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，其特征在于，所述步骤S3中的二级培养基由以下重量组分配比的的原料制成：葡萄糖2％，淀粉0.35％，玉米粉0.37％，豆粕粉4.5％，硫酸铵0.1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.2％，小苏打0.124％，磷酸二氢钾0.2％，碳酸钙0.2％，硫酸镁0.07％，硫酸锰0.02％，硫化钙0.6％，消泡剂0.15％，余量为水。
6.根据权利要求1-5任一所述的显著提高丁酸产量的丁酸梭菌发酵方法，其特征在于，控制所述步骤S1-S4全程培养时间为72-78h，培养温度为37℃。
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