CN102319270A

CN102319270A - 采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法

Info

Publication number: CN102319270A
Application number: CN201110287802A
Authority: CN
Inventors: 胡军; 蔡翔; 丁立; 陈从富
Original assignee: HUBEI LVXUE BIOLOGICAL INDUSTRY CO LTD
Current assignee: HUBEI LVXUE BIOLOGICAL INDUSTRY CO LTD
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2031-09-26
Also published as: CN102319270B

Abstract

本发明公开了采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法，该方法是由酪酸菌在酪酸菌种子培养基中经二级种子扩大培养和在酪酸菌发酵培养基中发酵，在发酵过程中通过补充碳源、氮源以及用氨水来调节发酵液的pH值等代谢调控措施，来增加酪酸菌的菌体数、芽孢体的转化率以及发酵罐装料系数，再经菌体收集、添加保护剂、喷雾干燥制粉、菌粉检验、包装工序制得;本发明方法生产周期短，酪酸菌的培养密度高，活菌数目较高，生产成本较低，能够大规模产业化生产，产品质量稳定。

Description

采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法

㈠技术领域：本发明涉及酪酸菌活菌制剂的制备方法，具体是采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法。

㈡背景技术：酪酸菌即丁酸梭菌（(Clostridium butyrium）,为革兰阳性厌氧芽孢杆，是1933 年由日本千叶医科大学宫入近治博士首先发现并报告的, 因此又名宫入菌。该菌存在于土壤、人和动物肠道、干酪及自然酸奶中, 细菌学分类属于梭菌属,为革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌, 培养后期可变为阴性菌。酪酸菌为梭状芽孢杆菌, 菌体为直或微弯, 孢子圆形或椭圆形, 为内生芽孢, 常使菌体中部膨大呈梭形。对外界环境有较强的抵抗力, 经80℃、30min 和90℃、10min 热处理后全部存活; 加热90℃、20min 后,95 %存活; 加热100℃、5min 后30 %存活。耐热、耐酸, pH 值为1.0～5.0 时仍能存活; pH 值为4.0～9.8 时能适合其生长。因此, 酪酸菌能够抵抗制粒过程中的高温、高热, 与目前广泛应用的非芽孢类活菌制剂相比, 更具广阔的市场前景。

酪酸菌是人体肠道内正常的有益菌,它能够拮抗有害菌，促进有益菌生长，调节人的肠道菌群平衡；能促进肠黏膜修复，维持屏障完整，并能祛除肠黏膜炎症，阻止肠黏膜腐烂，恢复肠功能；分泌低聚糖酶，把多糖降解为低聚糖，促进肠道内有益菌群（双歧杆菌、乳酸杆菌等）的繁殖和成长，快速恢复菌群平衡；对有害菌具有拮抗作用。调节宿主的基因表达，有效防治肠癌；能恢复肠道的免疫功能及化学屏障、生物屏障，健康肠道，恢复肠功能。

正是由于酪酸菌具有的独特的生物特点，早在上个时间四十年代，日本就已经把它开发成为治疗肠道疾病的药物。近半个世纪以来，日本的酪酸菌活菌制剂-米雅系列产品在日本、韩国、中国等亚洲国家和地区广泛应用于消化系统、小儿、外科、肿瘤、妇产科等种种原因肠道菌群失调、急慢性腹泻、抗生素相关肠炎、便秘等疾病的治疗，疗效确切。

酪酸菌及其制剂主要应用于以下几个方面：

1、作为药物使用

能够治疗肠菌群紊乱、腹泻、肠炎，预防肠癌。另外酪酸菌也可作为肠炎、肝病、化放疗造成的免疫力下降、菌群失调的良好辅助治疗药物；

2、作为兽药使用

酪酸菌可用以治疗动物肠道感染和肠功能异常。酪酸菌可增加动物肠内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量,可促进排便,可抑制肠道腐败产物氨和胺类的产生;可抑制霍乱弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、致病性大肠杆菌、出血性大肠杆菌以及引起伪膜性肠炎的魏氏梭菌的繁殖；

3、用作饲料添加剂

酪酸菌能单独作为饲料添加剂使用,也能与乳酸菌、芽孢菌、双歧杆菌等益生菌复配使用,能增强该类产品的功效。在提高动物免疫力、抗病力及降低猪的料肉比方面都有显著效果目前。

近年来，我国生物制药方面有着飞速的发展，乳酸菌种、双岐杆菌等微生态制剂国内在人药制剂和兽药制剂领域都已实现产业化生产，人用酪酸菌活菌制剂目前国内也有多家制药企业在进行产业化生产。但总体来说，酪酸菌产业项目还存在着生产规模偏小，冷冻干燥菌粉活菌含量还不够高，芽孢形成率偏低，生产成本高，产品存放稳定性差等问题。

酪酸菌微生态制剂的生产主要是利用其活的芽孢体，获得大量的酪酸菌芽孢体或活菌体并保持它们的活性是酪酸菌制剂生产的关键，芽孢数目越多越好。酪酸菌的生产方法都是采用液态深层发酵法培养酪酸菌菌体和芽孢，然后分离菌体及芽孢，并将其做成制剂。目前酪酸菌制剂比较流行的生产方法是采用各自取得的酪酸菌生产菌种，使用三级种子培养的方法，发酵培养酪酸菌活菌体，采用冻干机冷冻干燥的方法制备酪酸菌活菌制剂。现有方法的主要不足是：

1.种子培养级数过多，总的发酵周期偏长，所需的设备多，加大了设备的投资和增加了染菌机会，加大了发酵风险；

2.发酵罐装料系数为60-80%，设备利用率不高；

3.发酵培养的酪酸菌菌落总数一般在1.0-5.5×10⁸个/ml，芽孢率一般小于90%，酪酸菌的培养密度偏低，相应的发酵成本较大；

4.发酵菌体分离技术采用的是管式离心机，单台管式离心机处理发酵液能力较小，目前国内最大规格的150型管式离心机发酵液处理能力为1.0 m³/h，大规模生产酪酸菌时受到设备限制；

5.制剂技术均采用冷冻干燥技术，需要使用冻干机，由于冻干机的装料量有限，且设备投入大，使用成本高，限制了酪酸菌的大规模生产。

㈢发明内容：本发明的目的主要是针对目前酪酸菌活菌制剂工艺所存在的问题，提供一种采用补料分批发酵法制备高密度酪酸菌活菌制剂的方法，该方法生产周期短，酪酸菌的培养密度高，活菌数目较高，生产成本较低，能够大规模产业化生产，产品质量更稳定。

本发明工艺方法的技术方案步骤如下：

一级种子培养：取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在34-38℃厌氧培养12～16h; 所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5%-2. 5 %、牛肉膏0.5% -2.0%、酵母浸膏0. 3% -0.5%、磷酸氢二钾0.01% -0.05%、氯化钠0.1%-0.2 %、水94.75-98.59%，培养基的pH 6. 0-7. 0；

二级种子培养：将一级种子接种于酪酸菌二级种子培养基中，接种量为酪酸菌二级种子培养基体积的3～9%；在34-38℃厌氧培养12～16h;所用培养基的原料及用量为：葡萄糖1.5%-2.5 %、蛋白胨1.0% -1.5%、酵母粉0. 5% -1.5%、磷酸氢二钾0.02% -0.05%、氯化钠0.1%-0.2 %、硫酸镁0. 02%-0.1%、水94.15-96.86%，培养基的pH 6. 0-7. 2；

发酵:将二级种子接种于酪酸菌发酵培养基中，接种量为酪酸菌发酵培养基体积的3～9%；以氮气控制罐压0. 02MPa -0. 04MPa，在34-46℃厌氧培养32-38h；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖3.0%-5.0%、酵母粉1.0% -2.5%、黄豆粉2.0% -3.5%、磷酸氢二钾0.05% -0.1%、硫酸镁0. 05%-0.1%、碳酸钙0. 3%-0.6%、硫酸锰0.002%、水88. 2%-93.6%，培养基的pH 5. 8-7. 5 ；

当发酵至12-14 h开始流加由葡萄糖10%-20%、水80%-90%配制成的碳源葡萄糖补料培养基，至发酵结束前8小时；

当发酵至13-15 h开始流加由豆粉水解液5.0%-10.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水89.8-94.8%配制成的氮源豆粉水解液补料培养基，至发酵结束前10小时；

当发酵至12h开始使用重量百分浓度17.0%-24.0%的氨水流加调节pH，使发酵液控制pH6.4-6.8；发酵过程中采用间歇式搅拌，保持培养基浓度均衡；

发酵过程中碳源葡萄糖补料培养基与氮源豆粉水解液补料培养基的加入体积比为1：1，但总补料量控制在初始发酵培养基体积的20-40%,最终发酵液装料系数为80-92%；

发酵结束前4-6h逐步将发酵温度提高至42-46℃，直至芽抱形成率≥96%，结束发酵；

菌体收集:经检验合格的发酵菌液，采用碟片式离心机收集菌体，获得湿菌泥并使用纯化水反复冲洗菌泥；

添加保护剂：将所得的湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 4-30的重量比，加入由脱脂奶粉5%-15%、海藻糖2%-5%、淀粉5%-15%、甘油2%-3%、维生素C0.5%-1%、水61%-85.5% 配制的保护剂，混合均匀；

喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制剂；其中进风温度控制在85-120℃；

菌粉检验:每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个；

上述各级种子培养基、发酵培养基、补料培养基、保护剂均需要经过110-123℃,15-30分钟的蒸汽湿热实罐灭菌，灭菌后，培养基要迅速降至36-37℃；

上述各级种子培养基、发酵培养基、补料培养基中的原料用量均为重量百分比；配制时保证所用原料的重量百分比之和为100%。

本发明工艺方法的优选技术方案步骤如下：

一级种子培养：取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在36℃厌氧培养14h; 所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2.0%、牛肉膏1.0%、酵母浸膏0. 3%、磷酸氢二钾0.02%、氯化钠0.1%、水96.58%，培养基的pH 6. 5；

二级种子培养：将一级种子接种于酪酸菌二级种子培养基中，接种量为酪酸菌二级种子培养基体积的5%；在35℃厌氧培养13h;所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2.3 %、蛋白胨1.4%、酵母粉1.2%、磷酸氢二钾0.03%、氯化钠0.15%、硫酸镁0. 04%、水94.88%，培养基的PH 6. 7；

发酵:将二级种子接种于酪酸菌发酵培养基中，接种量为酪酸菌发酵培养基体积的9%；以氮气控制罐压0. 04MPa，在46℃厌氧培养38h；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖3.9%、酵母粉1.7%、黄豆粉3.4%,磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 5%、硫酸锰0.002%、水90. 45%，培养基的pH6.8；

当发酵至14 h开始流加由葡萄糖15%，水85%配制成的碳源葡萄糖补料培养基，至发酵结束前8小时；

当发酵至13h开始流加由豆粉水解液8.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水91.2%配制成的氮源豆粉水解液补料培养基，至发酵结束前10小时；

当发酵至12h开始使用重量百分浓度23.0%的氨水流加调节pH，使发酵液控制pH6.5；发酵过程中采用间歇式搅拌，保持培养基浓度均衡；

发酵过程中碳源葡萄糖补料培养基与氮源豆粉水解液补料培养基的加入体积比为1：1，但总补料量控制在初始发酵培养基体积的30%,最终发酵液装料系数为90%；

发酵结束前5h逐步将发酵温度提高至42℃，直至芽抱形成率≥96%，结束发酵；

添加保护剂：将所得的湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 9的重量比，加入由脱脂奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、维生素C0.5%、水74.5%配制的保护剂，混合均匀；

喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制剂；其中进风温度控制在85-95℃；

菌粉检验:每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个。

本发明所涉及的酪酸菌种子冻干管菌种，又名丁酸梭菌，拉丁学名：Clostridium butyricum，是申请人从位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”购得，菌种编号：1.2709，菌种名称：Clostridium butyricum（“菌种购买证明”原件随申请文件一起提供）。

本发明具有如下特点：

1、本发明酪酸菌发酵种子培养技术采用二级种子培养方法，比其它技术少一级种子罐培养。缩短了总发酵周期，降低了染菌机会，减少了发酵风险和设备投资；

2、通过补料的方法，本发明的发酵罐装料系数达到85-92%，提高了设备利用率和单罐产量；

3、通过发酵中间调控，本发明酪酸菌的培养密度较高，放罐发酵液的菌落总数大于2.0×10⁹个/ml，芽孢率大于96%，增加了单位体积的酪酸菌菌体产量，相应的降低了发酵生产成本；

4、本发明酪酸菌发酵菌体分离技术采用的是碟片式离心机，单台机器处理发酵液能力较大，处理量一般为1-30m³/h,能够满足大规模发酵时设备要求；

5、本发明采用喷雾干燥技术，料液处理量大，能够满足大规模生产要求，且设备投入相对要节约很多。达到同样的产能，使用喷雾干燥技术要比使用冻干干燥技术设备投资要少2-5倍，喷雾干燥设备使用成本也低；

6、本发明制备的酪酸菌活菌制剂，活菌含量高，每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0x10¹⁰个。能够部分取代抗生素，用于各种原因引起的人体和动物肠道菌群失调、急慢性腹泻、肠易激综合症、与抗生素相关性肠炎、便秘或腹泻便秘交替症等疾病的治疗。

（四）附图说明

图1是本发明工艺方框图。

（五）具体实施方式：

实施例1（以2m³发酵罐为例）

本发明酪酸菌活菌制剂的制备方法依次由下述工艺步骤组成:

1、一级种子培养：在5000m1三角瓶中装有一级种子培养基3000m1, 121℃湿热灭菌30min后，培养基迅速降至36-37℃。取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在35-36℃厌氧培养12 h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

2、二级种子培养：在200升发酵罐中装有二级种子培养基100升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃，接入长好的一级种子3000毫升，在36-37℃厌氧培养16 h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

3、发酵：在2m³发酵罐中装有发酵培养基1200升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃。接入长好的二级种子100升。以氮气控制罐压0. 02MPa -0. 04MPa，在34-46℃厌氧培养至38h。检验放罐发酵液的菌落总数为2.2×10⁹个/ml，芽孢率97%；

4、发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至12h开始流加碳源葡萄糖培养基，至30h结束，补入葡萄糖培养基总体积为200升；

4.2发酵至14 h开始流加氮源豆粉水解液培养基，至28h结束，补入豆粉水解液培养基总体积为200升；

4.3发酵至12h开始使用氨水流加调节pH，使发酵液控制pH6.4-6.6；

4.4发酵过程中采用间歇式搅拌，每隔30分钟开启搅拌3分钟，保持培养基浓度均衡；

4.5本实施例发酵过程中总补料量为400升；

4.6发酵结束前6h逐步将发酵温度提高至46℃，直至芽抱形成率≥96%结束发酵；

5、本实施例中，碳源葡萄糖培养基培养基经过110℃,15分钟的蒸汽湿热实罐灭菌，氮源豆粉水解液培养基经过121℃,20分钟的蒸汽湿热实罐灭菌以保证纯种培养；

6、菌体收集:经检验合格的发酵菌液，采用碟片式离心机收集菌体，获得湿菌泥并使用纯化水反复冲洗菌泥；

7、添加保护剂：保护剂配制好后需经过110℃,15分钟的蒸汽湿热实罐消毒。湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 6的重量比，加入保护剂，并且混合均匀；

8、喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制剂；其中进风温度控制在88-92℃；

9、菌粉检验: 本实施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制剂，经检验每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个。

本实施例所说各种酪酸菌培养基配方及保护剂配方由下述原料及重量百分比组成：

一级种子培养基配方

葡萄糖2.0%、牛肉膏1.0%、酵母浸膏0. 3%、磷酸氢二钾0.02%、氯化钠0.1%、水96.58%，培养基的pH 6. 5。

二级种子培养基配方

葡萄糖2.5 %、蛋白胨1.5%、酵母粉1.5%、磷酸氢二钾0.04%、氯化钠0.1%、硫酸镁0. 05%、水94.31%，培养基的pH 6. 6。

发酵培养基配方

葡萄糖3.3%、酵母粉1.5%、黄豆粉3.0%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 5%、硫酸锰0.002%、水91. 6%，培养基的pH6.5 。

流加碳源葡萄糖培养基配方

葡萄糖10%，水90%，培养基的pH 自然。

流加氮源豆粉水解液培养基配方

豆粉水解液5.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水94.8%，培养基的pH 自然。

流加氨水重量百分浓度为24.0%。

添加的保护剂配方

脱脂奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、维生素C0.5%、水74.5%，培养基的pH 自然。

实施例2（以2m³发酵罐为例）

酪酸菌活菌制剂的制备方法依次由下述工艺步骤组成：

1、一级种子培养：在5000m1三角瓶中装有一级种子种子培养基3000m1, 121℃湿热灭菌30min后，培养基迅速降至36℃。取酪酸菌种子冻干管菌种，接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在34-35℃厌氧培养14 h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

2、二级种子培养：在200升发酵罐中装有二级种子培养基100升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃，接入长好的一级种子9000毫升，在35-36℃厌氧培养12 h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

3、发酵：在2m³发酵罐中装有发酵培养基1200升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃。接入长好的二级种子100升。以氮气控制罐压0. 03MPa -0. 04MPa，在35-42℃厌氧培养至32h。本次检验放罐发酵液的菌落总数为2.6×10⁹个/ml，芽孢率97%；

4、发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至13h开始流加碳源葡萄糖培养基，至24h结束，补入葡萄糖培养基总体积为240升；

4.2发酵至14 h开始流加氮源豆粉水解液培养基，至22h结束，补入氮源豆粉水解液培养基总体积为240升；

4.3发酵至12h开始使用氨水流加调节pH，使发酵液控制PH6.5-6.6；

4.5本实施例发酵过程中总补料量为480升；

4.6发酵结束前4h逐步将发酵温度提高至42℃，直至芽抱形成率≥96%结束发酵；

5、本实施例中碳源葡萄糖培养基培养基经过110℃,15分钟的蒸汽湿热实罐灭菌，氮源豆粉水解液培养基经过121℃,20分钟的蒸汽湿热实罐灭菌以保证纯种培养；

7、添加保护剂：保护剂配制好后需经过110℃,15分钟的蒸汽湿热实罐消毒。湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 9的重量比，加入保护剂，并且混合均匀；

8、喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制剂；其中进风温度控制在86-88℃；

9、菌粉检验: 本实施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制剂，经检验每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个；

10、成品包装：将干燥后的菌粉使用铝箔塑料袋真空包装。

一级种子培养基配方

葡萄糖2.2%、牛肉膏1.2%、酵母浸膏0. 5%、磷酸氢二钾0.03%、氯化钠0.15%、水95.92%，培养基的pH 6. 6。

二级种子培养基配方

葡萄糖2.3 %、蛋白胨1.4%、酵母粉1.2%、磷酸氢二钾0.03%、氯化钠0.15%、硫酸镁0. 04%、水94.88%，培养基的pH 6. 7。

发酵培养基配方

葡萄糖3.5%、酵母粉1.8%、黄豆粉3.2%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0. 1%、碳酸钙0. 4%、硫酸锰0.002%、水90.89%，培养基的pH6.6。

流加碳源葡萄糖培养基配方

葡萄糖15%，水85%，培养基的pH 自然。

流加氮源豆粉水解液培养基配方

豆粉水解液8.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水91.2%，培养基的pH 自然。

流加氨水重量百分浓度为17.0%。

添加的保护剂配方

脱脂奶粉12%、海藻糖3%、15%淀粉、甘油2%、维生素C0.5%、水67.5 %，培养基的pH 自然。

实施例3（以5m³发酵罐为例）

酪酸菌活菌制剂的制备方法依次由下述工艺步骤组成：

1、一级种子培养：在5000m1三角瓶中装有一级种子培养基3000m1，装3瓶, 121℃湿热灭菌30min后，培养基迅速降至37℃。取酪酸菌种子冻干管菌种，分别接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在34-38℃厌氧培养13 h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

2、二级种子培养：在500升发酵罐中装有二级种子培养基250升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃，接入长好的一级种子9000毫升，在35-38℃厌氧培养12h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

3、发酵：在5m³发酵罐中装有发酵培养基3500升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃。接入长好的二级种子250升。以氮气控制罐压0. 03MPa -0. 04MPa，在34-46℃厌氧培养至38h。本次检验放罐发酵液的菌落总数为2.6×10⁹个/ml，芽孢率98%；

4、发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至12h开始流加碳源葡萄糖培养基，至30h结束，补入葡萄糖培养基总体积为400升；

4.2发酵至14 h开始流加氮源豆粉水解液培养基，至28h结束，补入豆粉水解液培养基总体为400升；

4.3发酵至12h开始使用氨水流加调节pH，使发酵液控制PH6.4-6.8；

4.5本实施例发酵过程中总补料量为800升；

4.6发酵结束前5h逐步将发酵温度提高至42℃，直至芽抱形成率≥96%结束发酵；

7、添加保护剂：保护剂配制好后需经过110℃,15分钟的蒸汽湿热实罐消毒。湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1:7的重量比，加入保护剂，并且混合均匀；

8、喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，通过喷雾塔进行喷雾干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制剂；其中进风温度控制在87-90℃；

、菌粉检验: 本实施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制剂，经检验每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个；

10、成品包装：将干燥后的菌粉使用铝箔塑料袋真空包装。

一级种子培养基配方

葡萄糖2.5%、牛肉膏2.0%、酵母浸膏0. 5%、磷酸氢二钾0.05%、氯化钠0.20%、水94.75%，培养基的pH 6. 0。

二级种子培养基配方

葡萄糖1.5 %、蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%、磷酸氢二钾0.05%、氯化钠0.2%、硫酸镁0. 1%、水96.65%，培养基的pH 6. 7。

发酵培养基配方

葡萄糖4.5%、酵母粉2.0%、黄豆粉2.0%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0. 04%、碳酸钙0. 3%、硫酸锰0.002%、水91. 11%，培养基的pH5.8。

流加碳源葡萄糖培养基配方

葡萄糖15%，水85%，培养基的pH 自然。

流加氮源豆粉水解液培养基配方

豆粉水解液9.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水90.8%，培养基的pH 自然。

流加氨水重量百分浓度为23.0%。

添加的保护剂配方

脱脂奶粉13%、海藻糖3%、14%淀粉、甘油2%、维生素C0.5%、水67.5 %，培养基的pH 自然。

实施例4（以5m³发酵罐为例）

酪酸菌活菌制剂的制备方法依次由下述工艺步骤组成：

1、一级种子培养：在5000m1三角瓶中装有一级种子培养基3000m1，装3瓶, 121℃湿热灭菌30min后，培养基迅速降至36-37℃。取酪酸菌生产种子冻干管菌种，分别接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在37℃厌氧培养12h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

2、二级种子培养：在500升发酵罐中装有二级种子培养基250升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃，接入长好的一级种子9000毫升，在37℃厌氧培养12 h。经检查，本次培养的菌种未见染菌、菌体形态较好；

3、发酵：在5m³发酵罐中装有发酵培养基3000升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃。接入长好的二级种子250升。以氮气控制罐压0. 03MPa -0. 04MPa，在36-44℃厌氧培养至37h。本次检验放罐发酵液的菌落总数为2.3×10⁹个/ml，芽孢率97%；

4、发酵过程中采用以下中间控制方法：

4.1发酵至13h开始流加碳源葡萄糖培养基，至29h结束，补入葡萄糖培养基总体积为600升；

4.2发酵至14 h开始流加氮源豆粉水解液培养基，至27h结束，补入豆粉水解液培养基总体积为600升；

4.5本实施例发酵过程中总补料量为1200升；

4.6发酵结束前6h逐步将发酵温度提高至44℃，直至芽抱形成率≥96%结束发酵；

5、本实施例碳源葡萄糖培养基培养基经过110℃,15分钟的蒸汽湿热实罐灭菌，氮源豆粉水解液培养基经过121℃,20分钟的蒸汽湿热实罐灭菌以保证纯种培养；

7、添加保护剂：湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 13的重量比，加入保护剂，并且混合均匀；

8、喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，通过喷雾塔进行喷雾干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制剂；其中进风温度控制在87-89℃；

9、菌粉检验: 本实施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制剂，经检验每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个;

10、成品包装：将干燥后的菌粉使用铝箔塑料袋真空包装。

本实施例所说各种酪酸菌培养基配方及保护剂配方由下述原料及重量百分比组成:

一级种子培养基配方

葡萄糖2.4%、牛肉膏1.3%、酵母浸膏0. 5%、磷酸氢二钾0.04%,氯化钠0.1%、水95.66%、培养基的pH 6. 8。

二级种子培养基配方

葡萄糖2.5%、蛋白胨1.4%,酵母粉1.5%、磷酸氢二钾0.05%、氯化钠0.15%、硫酸镁0. 05%、水94.35%，培养基的pH 6. 5。

发酵培养基配方

葡萄糖3.9%、酵母粉1.7%、黄豆粉3.4%,磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 5%、硫酸锰0.002%、水90. 4%，培养基的pH6.8。

流加碳源葡萄糖培养基配方

葡萄糖15%，水85%，培养基的pH 自然。

流加氮源豆粉水解液培养基配方

豆粉水解液6.0%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.1%、水93.8%，培养基的pH 自然。

流加氨水重量百分浓度为22.0%。

添加的保护剂配方

脱脂奶粉11%、海藻糖3%、12%淀粉、甘油2%、维生素C0.5%、水71.5 %，培养基的pH 自然。

实施例5（以2m³发酵罐为例）

一级种子培养：在5000m1三角瓶中装有一级种子培养基3000m1,分装两瓶， 121℃湿热灭菌30min后，培养基迅速降至36-37℃。取酪酸菌种子冻干管菌种，分别接种于酪酸菌三角瓶一级种子培养基中，在36℃厌氧培养14h; 所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2.0%、牛肉膏1.0%、酵母浸膏0. 3%、磷酸氢二钾0.02%、氯化钠0.1%、水96.58%，培养基的pH 6. 5。

二级种子培养：在200升发酵罐中装有二级种子培养基120升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃，接入长好的一级种子6000毫升。在35℃厌氧培养13h;所用培养基的原料及用量为：葡萄糖2.3 %、蛋白胨1.4%、酵母粉1.2%、磷酸氢二钾0.03%、氯化钠0.15%、硫酸镁0. 04%、水94.88%，培养基的PH 6. 7。

发酵: 在2m³发酵罐中装有发酵培养基1330升，121℃灭菌20min，培养基迅速降至36-37℃。接入长好的二级种子119.7升。以氮气控制罐压0. 04MPa，在46℃厌氧培养38h；所用培养基的原料及用量为：葡萄糖3.9%、酵母粉1.7%、黄豆粉3.4%,磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0. 05%、碳酸钙0. 5%、硫酸锰0.002%、水90. 4%，培养基的pH6.8。

当发酵至14 h开始流加由葡萄糖15%，水85%配制成的碳源葡萄糖补料培养基，至发酵结束前8小时；检验放罐发酵液的菌落总数为2.9×10⁹个/ml，芽孢率97%.

发酵过程中碳源葡萄糖补料培养基与氮源豆粉水解液补料培养基的加入体积比为1：1，本实施例发酵过程中总补料量为340升；

发酵结束前5h逐步将发酵温度提高至42℃，直至芽抱形成率≥96%，结束发酵。

菌体收集:经检验合格的发酵菌液，采用碟片式离心机收集菌体，获得湿菌泥并使用纯化水反复冲洗菌泥。

添加保护剂：将所得的湿菌泥称重，按湿菌泥：保护剂=1: 9的重量比，加入由脱脂奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、维生素C0.5%、水74.5%配制的保护剂，混合均匀。

喷雾干燥制粉:将混合好的配有保护剂的菌泥，喷雾干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制剂；其中进风温度控制在85-95℃。

菌粉检验:每克菌粉含酪酸菌活菌数不少于1.0×10¹⁰个。

上述实施例1-实施例5中所涉及的酪酸菌种子冻干管菌种，是申请人从位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所内的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”购得，菌种编号：1.2709，菌种名称：Clostridium butyricum。