CN105368909A - 提高β-胡萝卜素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高β-胡萝卜素产量的方法中，包括种子培养、发酵培养、混菌发酵液流加步骤，在发酵过程中加入三孢布拉氏霉正负菌发酵完成后所得发酵液，刺激菌体生产β-胡萝卜素，提高β-胡萝卜素的产率。相对现有技术，本发明不再提纯混菌发酵液中的三孢酸，而直接采用混菌发酵液，提高了发酵过程的可控性，可应用于大规模低复杂度的工业化生产，对比原来发酵条件，产量提高了67%。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程的技术领域，具体说是一种提高β-胡萝卜素产量的方法。
背景技术
β-胡萝卜素分子式为C40H55，是合成维生素A的前体物质，是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上具有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
目前生产β-胡萝卜素的方法主要有植物提取法，化学合成法，微生物发酵法。植物提取法是指从胡萝卜等富含β-胡萝卜素的植物中提取β-胡萝卜素，化学合成法是以化学原料化学法合成β-胡萝卜素。微生物发酵法是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物发酵生产β-胡萝卜素。其中，以三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素最具工业应用前景。
三孢布拉氏霉属于霜霉目，白锈科，拉丁名是Blakeseleatrispora，有性无性繁殖，有(+)(-)两种接合型，即正负两种菌株，单独的(+)或(-)菌发酵产β-胡萝卜素的能力很低，低于45mg/L。(+)、(-)菌株在PDA平板上形成白色菌落，没有明显的产色素能力。
正负菌株按不同比例混合后发酵，会产生较多的β-胡萝卜素。其中，正负菌株按1:4混合后产量最高，达到了350mg/L。
三孢布拉氏霉在平板上生长呈蔓延状，菌丝生长快，较难挑取纯菌落。在培养基中添加0.05％的OP乳化剂，限制菌丝蔓延，获得较规则的菌落，便于挑取得到较纯菌株。
US7252965B2公开了一种利用六十细胞仪来筛选β-胡萝卜素高产菌种的方法。将孢子悬液经紫外线照射后，用流式细胞仪来处理诱变后的孢子液。通过分析孢子产生的特定荧光强弱，来判断其产β-胡萝卜素能力的大小。荧光越强，生产能力越强。利用这种方法，筛选到了一株高产菌株，产量达到9g/L。
CN104805167A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。本发明过表达MEP途径中的4个酶，构建不同强度启动子的MEP途径，从而提高β-胡萝卜素的产量。
CN101096355一种从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法，公开了一种从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的工艺。所述的方法是新鲜胡萝卜经过绞汁以后，倒入高压均质机中均质，均质后的胡萝卜浓汁中加入沉淀剂CaCl2·2H2O和稳定剂氨水/乙醇，经过离心，弃去上清液，得到橙红色沉淀；将沉淀经过冷冻干燥机冷冻干燥，得到粉末状干燥的沉淀，在沉淀中加入有机溶剂石油醚萃取其中的β-胡萝卜素，之后旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂，得到β-胡萝卜素油状物。所提得的β-胡萝卜素纯度达90％，提取量达180mg/100g，提取率可达80％以上。该法具有工艺新颖，操作简单，成本低等特点，对研究开发从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素具有很高的参考价值。
CN1558953公开了三孢布拉霉的β－胡萝卜素的生物合成基因，其编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)。carRP基因，其特征在于DNA序列SEQIDNO：1，编码氨基酸序列SEQIDNO：3，其具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQIDNO：2，编码氨基酸序列SEQIDNO：4，其具有八氢番茄红素脱氢酶活性。本发明还涉及(i)构建表达附加拷贝的所述基因的质粒的方法和(ii)在所述基因的启动子控制下表达异源基因的方法。
CN103951600A一种提取盐藻中β-胡萝卜素的方法，公开了一种提取盐藻中的β-胡萝卜素的方法，包括步骤有：(1)将盐藻泥或盐藻粉与蒸馏水以质量比1:5的比例充分混合，以盐酸调节pH值至5-6.5；(2)将蛋白酶与上述盐藻液按质量比1:33.3～54.5混合后充分溶解，保温、钝化；(3)将提取液经离心后取沉淀；(4)将沉淀与植物油以质量比1:5的比例混合后加热、保持、静置冷却，过滤得油溶液。本发明方法采用添加少量的蛋白酶即可以起到破坏细胞膜的作用，操作简便，节省了成本，适合于大规模工业化生产，同时省去了提纯后需要再用油悬浮的工艺，本方法环境友好，可大规模推广使用。
上述方法中，植物法提取具有消耗原材料多，成本高，受原料影响较大等缺点。化学合成法会合成对人体有害的中间产物，且不易分离。因此，微生物发酵法具有更广阔的应用前景。而三孢布拉氏霉具有菌体生长快，生长条件要求低，β-胡萝卜素含量较高等优点，最具前景，但由于三孢布拉氏霉菌种的特殊性，还无法实现低复杂度的大规模工业化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种提高β-胡萝卜素产量的方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的提高β-胡萝卜素产量的方法，包括以下步骤：
(1)种子培养基
将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；
种子培养基组成为：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
(2)发酵培养
将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0％、黄豆饼粉2.0％、KH2PO40.25％、MgSO4·7H2O0.02％、豆油3.0％、工业玉米浆2.0％、维生素B10.005％、柠檬酸三钠0.3％、曲拉通0.1％、BHT0.05％、混菌发酵液10％。
发酵方法如下：以发酵培养基10％的体积比例且含正负菌1:4的比例将三孢布拉氏霉菌接种到5L的发酵罐中，获得接种后的培养基装液量3L，通风量1.0V/V,转速220r/min，27℃培养88h；发酵周期内40～88h，利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH稳定在7.0～7.4，发酵结束后离心除去菌体；
(3)混菌培养基的流加
混菌培养基：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
混菌菌液的培养条件:培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；
混菌发酵液：向发酵罐内流加相对于发酵罐内装液量体积2％～5％的混菌发酵液，以体积单位mL进行流加，流加时间点为24～48h。
本发明还可以采用以下技术措施：
在混菌发酵完成后对发酵液进行分离检测，包括以下步骤：从5L发酵罐中取样，将发酵液进行抽滤，蒸馏水洗涤三次；精确称取抽滤后的菌体0.03g，加入3mL左右乙酸乙酯，研磨菌体至无色；直至全部研磨液，用乙酸乙酯定容至25mL；量取上述溶液1mL用乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm处测其吸光值；
产量计算公式为：产量＝0.01947×吸光度值mg/L。
向发酵罐中流加的混菌发酵液量为发酵罐内装液量的4％。
混菌发酵液的流加时间点为48h。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的提高β-胡萝卜素产量的方法中，在发酵过程中加入三孢布拉氏霉正负菌发酵完成后所得发酵液，刺激菌体生产β-胡萝卜素，提高β-胡萝卜素的产率。相对现有技术，本发明不再提纯混菌发酵液中的三孢酸，而直接采用混菌发酵液，提高了发酵过程的可控性，可应用于大规模低复杂度的工业化生产，对比原来发酵条件，产量提高了67％。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：
本发明的提高β-胡萝卜素产量的方法，步骤如下：
1、将三孢布拉氏霉正负菌株进行活化6h，即将其从PDA斜面培养基转接到500ml的三角瓶中，装液量为100ml，恒温27℃,220r/min培养48～52h制得种子液；种子培养基组成为：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
2、以10％的体积比将步骤1所得的种子液接到5L(装液量为3L)的发酵罐中，通风量1.0(V/V),300r/min，30℃培养88h，在40h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到3.0，直至发酵结束；结束后离心除去菌体；
发酵培养基成分：玉米淀粉3.0％、黄豆饼粉2.0％、KH2PO40.25％、MgSO4·7H2O0.02％、豆油3.0％、工业玉米浆2.0％、维生素B10.005％、柠檬酸三钠0.3％、曲拉通0.1％、BHT0.05％、混菌发酵液10％；
3、混菌培养基的流加：
混菌培养基：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
混菌菌液的培养条件:培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48h；
混菌发酵液，利用发酵罐自动流加系统按发酵罐内装液量体积的2％流加混菌发酵液，以体积单位(mL)进行流加，流加时间点为混菌开始后的24h；
4、β-胡萝卜素的分离检测：
从5L发酵罐中取样，将发酵液进行抽滤，蒸馏水洗涤三次；精确称取抽滤后的菌体0.03g，加入3mL左右乙酸乙酯，研磨菌体至无色；直至全部研磨液，用乙酸乙酯定容至25mL；量取上述溶液1mL用乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm处测其吸光值。
实施例2：
本发明的提高β-胡萝卜素产量的方法，步骤如下：
1、将三孢布拉氏霉正负菌株进行活化8h，即将其从PDA斜面培养基转接到500ml的三角瓶中，装液量为100ml，恒温27℃,220r/min培养52h制得种子液；种子培养基组成为：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
2、以10％的体积比将步骤1所得的种子液接到5L(装液量为3L)的发酵罐中，通风量1.0(V/V),300r/min，30℃培养88h，在52h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到3.0，直至发酵结束；结束后离心除去菌体；
发酵培养基成分：玉米淀粉3.0％、黄豆饼粉2.0％、KH2PO40.25％、MgSO4·7H2O0.02％、豆油3.0％、工业玉米浆2.0％、维生素B10.005％、柠檬酸三钠0.3％、曲拉通0.1％、BHT0.05％、混菌发酵液10％；
3、混菌培养基的流加：
混菌培养基：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
混菌菌液的培养条件:培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为52h；
混菌发酵液，利用发酵罐自动流加系统按发酵罐内装液量体积的5％流加混菌发酵液，以体积单位(mL)进行流加，流加时间点为混菌开始后的48h；
4、β-胡萝卜素的分离检测：
从5L发酵罐中取样，将发酵液进行抽滤，蒸馏水洗涤三次；精确称取抽滤后的菌体0.03g，加入3mL左右乙酸乙酯，研磨菌体至无色；直至全部研磨液，用乙酸乙酯定容至25mL；量取上述溶液1mL用乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm处测其吸光值。
实施例3：
本发明的提高β-胡萝卜素产量的方法，步骤如下：
1、将三孢布拉氏霉正负菌株进行活化7h，即将其从PDA斜面培养基转接到500ml的三角瓶中，装液量为100ml，恒温27℃,220r/min培养50h制得种子液；种子培养基组成为：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
2、以10％的体积比将步骤1所得的种子液接到5L(装液量为3L)的发酵罐中，通风量1.0(V/V),300r/min，30℃培养88h，在50h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到3.0，直至发酵结束；结束后离心除去菌体；
发酵培养基成分：玉米淀粉3.0％、黄豆饼粉2.0％、KH2PO40.25％、MgSO4·7H2O0.02％、豆油3.0％、工业玉米浆2.0％、维生素B10.005％、柠檬酸三钠0.3％、曲拉通0.1％、BHT0.05％、混菌发酵液10％；
3、混菌培养基的流加：
混菌培养基：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
混菌菌液的培养条件:培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为50h；
混菌发酵液，利用发酵罐自动流加系统按发酵罐内装液量体积的3％流加混菌发酵液，以体积单位(mL)进行流加，流加时间点为混菌开始后的36h；
4、β-胡萝卜素的分离检测：
从5L发酵罐中取样，将发酵液进行抽滤，蒸馏水洗涤三次；精确称取抽滤后的菌体0.03g，加入3mL左右乙酸乙酯，研磨菌体至无色；直至全部研磨液，用乙酸乙酯定容至25mL；量取上述溶液1mL用乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm处测其吸光值。
实施例4：
本发明的提高β-胡萝卜素产量的方法，步骤如下：
1、将三孢布拉氏霉正负菌株进行活化8h，即将其从PDA斜面培养基转接到500ml的三角瓶中，装液量为100ml，恒温27℃,220r/min培养52h制得种子液；种子培养基组成为：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
2、以10％的体积比将步骤1所得的种子液接到5L(装液量为3L)的发酵罐中，通风量1.0(V/V),300r/min，30℃培养88h，在52h运用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠使pH缓慢地稳定到3.0，直至发酵结束；结束后离心除去菌体；
发酵培养基成分：玉米淀粉3.0％、黄豆饼粉2.0％、KH2PO40.25％、MgSO4·7H2O0.02％、豆油3.0％、工业玉米浆2.0％、维生素B10.005％、柠檬酸三钠0.3％、曲拉通0.1％、BHT0.05％、混菌发酵液10％；
3、混菌培养基的流加：
混菌培养基：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
混菌菌液的培养条件:培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为52h；
混菌发酵液，利用发酵罐自动流加系统按发酵罐内装液量体积的4％流加混菌发酵液，以体积单位(mL)进行流加，流加时间点为混菌开始后的48h；
4、β-胡萝卜素的分离检测：
从5L发酵罐中取样，将发酵液进行抽滤，蒸馏水洗涤三次；精确称取抽滤后的菌体0.03g，加入3mL左右乙酸乙酯，研磨菌体至无色；直至全部研磨液，用乙酸乙酯定容至25mL；量取上述溶液1mL用乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm处测其吸光值。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种提高β-胡萝卜素产量的方法，包括以下步骤：
(1)种子培养基
将三孢布拉氏霉正负菌分别活化后转接到500mL三角瓶中，培养基装液量100mL，培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；
种子培养基组成为：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
(2)发酵培养
将上述正负菌种子液按比例接种到发酵培养基，发酵生产β-胡萝卜素；向发酵过程中流加混菌发酵液；
发酵培养基中按质量百分比包括：玉米淀粉3.0％、黄豆饼粉2.0％、KH2PO40.25％、MgSO4·7H2O0.02％、豆油3.0％、工业玉米浆2.0％、维生素B10.005％、柠檬酸三钠0.3％、曲拉通0.1％、BHT0.05％、混菌发酵液10％。
发酵方法如下：以发酵培养基10％的体积比例且含正负菌1:4的比例将三孢布拉氏霉菌接种到5L的发酵罐中，获得接种后的培养基装液量3L，通风量1.0V/V,转速220r/min，27℃培养88h；发酵周期内40～88h，利用3mol/L的盐酸和3mol/L的氢氧化钠调控pH稳定在7.0～7.4，发酵结束后离心除去菌体；
(3)混菌培养基的流加
混菌培养基：玉米淀粉3.5％、黄豆饼粉2.3％、KH2PO40.15％、MgSO4·7H2O0.01％、工业玉米浆1％、豆油0.5％；
混菌菌液的培养条件:培养温度为27℃，摇床转速220rpm，培养时间为48-52h；
混菌发酵液：向发酵罐内流加相对于发酵罐内装液量体积2％～5％的混菌发酵液，以体积单位mL进行流加，流加时间点24～48h。
2.根据权利要求1所述的提高β-胡萝卜素产量的方法，其特征在于：在混菌发酵完成后对发酵液进行分离检测，包括以下步骤：从5L发酵罐中取样，将发酵液进行抽滤，蒸馏水洗涤三次；精确称取抽滤后的菌体0.03g，加入3mL左右乙酸乙酯，研磨菌体至无色；直至全部研磨液，用乙酸乙酯定容至25mL；量取上述溶液1mL用乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm处测其吸光值；
产量计算公式为：产量＝0.01947×吸光度值mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的提高β-胡萝卜素产量的方法，其特征在于：步骤(3)中，向发酵罐中流加的混菌发酵液量为发酵罐内装液量的4％。
4.根据权利要求3所述的提高β-胡萝卜素产量的方法，其特征在于：步骤(3)中，混菌发酵液的流加时间点为48h。
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|---|---|---|---|---|
| CN106244635A (zh) * | 2016-09-18 | 2016-12-21 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种提取三孢酸的方法 |
| CN107119098A (zh) * | 2017-05-11 | 2017-09-01 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 在发酵过程中添加生长因子生产β‑胡萝卜素及检测方法 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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