CN105602932A - β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法 - Google Patents

β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法 Download PDF

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Abstract

一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,在PDA培养基中添加三孢酸,刺激菌体生产β-胡萝卜素,从而使菌落在筛选培养基上形成黄色菌落。经过诱变处理后的菌体,会因为生产β-胡萝卜素能力不同而形成颜色深浅不一的菌落。菌落的黄色越深,代表其生产β-胡萝卜素能力越强。从黄色较深的菌落中挑选菌落为高产β-胡萝卜素菌株,目的性强,可以大大提高筛选效率,减少筛选所用时间及工作量。

Description

β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物工程的技术领域,具体说是一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法。
背景技术
β-胡萝卜素分子式为C40H55,是合成维生素A的前体物质,是一种抗氧化剂,具有解毒作用,是维护人体健康不可缺少的营养,在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上具有显著的功能,并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
目前生产β-胡萝卜素的方法主要有植物提取法,化学合成法,微生物发酵法。植物提取法是指从胡萝卜等富含β-胡萝卜素的植物中提取β-胡萝卜素,化学合成法是以化学原料化学法合成β-胡萝卜素。微生物发酵法是指以三孢布拉氏霉,杜氏海藻,酵母等微生物发酵生产β-胡萝卜素。其中,以三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素最具工业应用前景。
三孢布拉氏霉属于霜霉目,白锈科,拉丁名是Blakeseleatrispora,有性无性繁殖,有(+)()两种接合型,即正负两种菌株,单独的(+)或()菌发酵产β-胡萝卜素的能力很低,低于45mg/L。(+)、()菌株在PDA平板上形成白色菌落,没有明显的产色素能力。
正负菌株按不同比例混合后发酵,会产生较多的β-胡萝卜素。其中,正负菌株按1:4混合后产量最高,达到了350mg/L。
三孢布拉氏霉在平板上生长呈蔓延状,菌丝生长快,较难挑取纯菌落。在培养基中添加0.05%的OP乳化剂,限制菌丝蔓延,获得较规则的菌落,便于挑取得到较纯菌株。
US7252965B2公开了一种利用六十细胞仪来筛选β-胡萝卜素高产菌种的方法。将孢子悬液经紫外线照射后,用流式细胞仪来处理诱变后的孢子液。通过分析孢子产生的特定荧光强弱,来判断其产β-胡萝卜素能力的大小。荧光越强,生产能力越强。利用这种方法,筛选到了一株高产菌株,产量达到9g/L。
CN104805167A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下步骤:培养大肠杆菌基因工程菌,从发酵液中获得β-胡萝卜素,所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌,该四个β-胡萝卜素合成基因分别是:crtE、crtI、crtB和crtY,并且,所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体,该四个MEP途径基因分别是:dxs、idi、ispD和ispF。本发明过表达MEP途径中的4个酶,构建不同强度启动子的MEP途径,从而提高β-胡萝卜素的产量。
CN101096355一种从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法,公开了一种从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的工艺。所述的方法是新鲜胡萝卜经过绞汁以后,倒入高压均质机中均质,均质后的胡萝卜浓汁中加入沉淀剂CaCl2·2H2O和稳定剂氨水/乙醇,经过离心,弃去上清液,得到橙红色沉淀;将沉淀经过冷冻干燥机冷冻干燥,得到粉末状干燥的沉淀,在沉淀中加入有机溶剂石油醚萃取其中的β-胡萝卜素,之后旋转蒸发浓缩,回收有机溶剂,得到β-胡萝卜素油状物。所提得的β-胡萝卜素纯度达90%,提取量达180mg/100g,提取率可达80%以上。该法具有工艺新颖,操作简单,成本低等特点,对研究开发从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素具有很高的参考价值。
CN1558953公开了三孢布拉霉的β-胡萝卜素的生物合成基因,其编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)。carRP基因,其特征在于DNA序列SEQIDNO:1,编码氨基酸序列SEQIDNO:3,其具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶活性。carB基因,其特征在于DNA序列SEQIDNO:2,编码氨基酸序列SEQIDNO:4,其具有八氢番茄红素脱氢酶活性。本发明还涉及(i)构建表达附加拷贝的所述基因的质粒的方法和(ii)在所述基因的启动子控制下表达异源基因的方法。
CN103951600A一种提取盐藻中β-胡萝卜素的方法,公开了一种提取盐藻中的β-胡萝卜素的方法,包括步骤有:(1)将盐藻泥或盐藻粉与蒸馏水以质量比1:5的比例充分混合,以盐酸调节pH值至5-6.5;(2)将蛋白酶与上述盐藻液按质量比1:33.3~54.5混合后充分溶解,保温、钝化;(3)将提取液经离心后取沉淀;(4)将沉淀与植物油以质量比1:5的比例混合后加热、保持、静置冷却,过滤得油溶液。本发明方法采用添加少量的蛋白酶即可以起到破坏细胞膜的作用,操作简便,节省了成本,适合于大规模工业化生产,同时省去了提纯后需要再用油悬浮的工艺,本方法环境友好,可大规模推广使用。
上述方法中,植物法提取具有消耗原材料多,成本高,受原料影响较大等缺点。化学合成法会合成对人体有害的中间产物,且不易分离。因此,微生物发酵法具有更广阔的应用前景。而三孢布拉氏霉具有菌体生长快,生长条件要求低,β-胡萝卜素含量较高等优点,最具前景。三孢布拉氏霉因其菌种的特殊性,用基因工程技术改造菌株难度较大,因此,较好的改造方法还是选用诱变筛选的方法。一般的筛选方法盲目性较大,原理模糊,筛选工作量大,效率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,在PDA培养基中添加三孢酸,生成筛选培养基;将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液,并对孢子悬液进行紫外诱变;将诱变后的孢子于筛选培养基中培养并形成菌落,挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
本发明还可以采用以下技术措施:
按筛选培养基质量的0.05%向筛选培养基中加入OP乳化剂。
PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液,其制备过程为:将三孢布拉霉出发菌株的正负菌株按1:4比例混合,在发酵培养基中发酵6天,得到发酵液;取100ML发酵液并用稀盐酸调至pH2.0,然后7000r/min,离心10min后,留取上清溶液;在上述上清溶液中,加入等体积氯仿,震荡萃取,分液,保留氯仿层;向氯仿层中加入相同体积的4%NaHCO3溶液萃取,留取NaHCO3层;再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0,加入相同体积氯仿,充分震荡,萃取;将氯仿层旋转蒸干,得到三孢酸粗提物;三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中,-20℃保藏。
发酵培养基中按质量百分比包括以下组分:玉米淀粉3.0%,黄豆饼粉2.0%,KH2PO40.25%,MgSO4.7H2O0.02%,,豆油3.0%,工业玉米浆2.0%,VB10.005%,柠檬酸三钠0.3%,曲拉通1000.1%,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%;pH值自然。
按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉,并于121℃灭菌20min。
PDA培养基的制备方法为,将土豆去皮,切成丁状,称取200g加入适量水中,煮沸20min,用8层滤布过滤取清液,定容至1L,加入20g葡萄糖,琼脂粉20g,加热融化后,分装至试管中,每只试管装液6-8mL,121℃灭菌20min后,即得PDA培养基。
将保藏的三孢布拉霉正负菌株取出,挑取少量菌体,涂于PDA培养中,27℃培养6-8天,待孢子成熟后,保藏于4℃;将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下,用血球计数板计数后,稀释至106个/mL;正负菌株按照1:4的比例,相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发酵培养基中,27℃,220r/min,6天,获得菌体及发酵液;制备孢子液,取5mL孢子液于放有转子的平板中,将平板置于磁力搅拌器上,转动中紫外照射4min,取0.1mL的处理后孢子液涂布于筛选培养基上,生长2-4天,挑取目的菌落。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法中,在PDA培养基中添加三孢酸,刺激菌体生产β-胡萝卜素,从而使菌落在筛选培养基上形成黄色菌落。经过诱变处理后的菌体,会因为生产β-胡萝卜素能力不同而形成颜色深浅不一的菌落。菌落的黄色越深,代表其生产β-胡萝卜素能力越强。从黄色较深的菌落中挑选菌落为高产β-胡萝卜素菌株,目的性强,可以大大提高筛选效率,减少筛选所用时间及工作量。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,在PDA培养基中添加三孢酸,生成筛选培养基;将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液,并对孢子悬液进行紫外诱变;将诱变后的孢子于筛选培养基中培养并形成菌落,挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
实施例中所述三孢布拉霉Blakesleatrispora已于2015年10月28日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所(邮编100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCCNo.11551。
按筛选培养基质量的0.05%向筛选培养基中加入OP乳化剂。
PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液,其制备过程为:将三孢布拉霉出发菌株的正负菌株按1:4比例混合,在发酵培养基中发酵6天,得到发酵液;取100ML发酵液并用稀盐酸调至pH2.0,然后7000r/min,离心10min后,留取上清溶液;在上述上清溶液中,加入等体积氯仿,震荡萃取,分液,保留氯仿层;向氯仿层中加入相同体积的4%NaHCO3溶液萃取,留取NaHCO3层;再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0,加入相同体积氯仿,充分震荡,萃取;将氯仿层旋转蒸干,得到三孢酸粗提物;三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中,-20℃保藏。
发酵培养基中按质量百分比包括以下组分:玉米淀粉3.0%,黄豆饼粉2.0%,KH2PO40.25%,MgSO4.7H2O0.02%,,豆油3.0%,工业玉米浆2.0%,VB10.005%,柠檬酸三钠0.3%,曲拉通1000.1%,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%;pH值自然。
按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉,并于121℃灭菌20min。
PDA培养基的制备方法为,将土豆去皮,切成丁状,称取200g加入适量水中,煮沸20min,用8层滤布过滤取清液,定容至1L,加入20g葡萄糖,琼脂粉20g,加热融化后,分装至试管中,每只试管装液6-8mL,121℃灭菌20min后,即得PDA培养基。
将保藏的三孢布拉霉正负出发菌株取出,挑取少量菌体,涂于PDA培养中,27℃培养6-8天,待孢子成熟后,保藏于4℃;将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下,用血球计数板计数后,稀释至106个/mL;正负菌株按照1:4的比例,相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发酵培养基中,27℃,220r/min,6天,获得菌体及发酵液;制备孢子液,取5mL孢子液于放有转子的平板中,将平板置于磁力搅拌器上,转动中紫外照射4min,取0.1mL的处理后孢子液涂布于筛选培养基上,生长2-4天,挑取目的菌落。
用800目尼龙滤布过滤发酵液,保留目的菌体;真空泵抽干获得菌体;称重;取0.03g目的菌体加入乙酸乙酯用研钵研磨至菌体无色;吸取全部研磨液至25mL容量瓶,乙酸乙酯定容至25mL;吸取上述溶液1mL于10mL容量瓶,乙酸乙酯定容至10mL;以乙酸乙酯为空白样,454nm下测其吸光OD值,根据标准曲线计算β-胡萝卜素含量。
取三孢布拉霉负出发菌株在PDA培养基上培养6-8天,至孢子成熟;将负菌孢子用无菌生理盐水洗下,制备孢子悬液;用血球计数板计数后,稀释至106个/mL;取5mL孢子液于5cM平板中,置于紫外灯下照射4min;去1mL上述孢子液,稀释涂布于筛选培养基平板上,使每个平板上长出约10个菌落;挑选两组菌落颜色比出发菌株更深更黄的菌落分别作为目的菌落1和目的菌落2;分别在PDA培养基中培养6-8天至孢子成熟;将筛选所得的负菌株与正菌株按4:1的比例混合,接种于发酵培养基,27℃,220r/min,发酵6天,测其两组β-胡萝卜素含量。
对照例1:
出发菌株正负菌株按1:4比例接种于发酵培养基,27℃,220r/min,发酵6天,测其β-胡萝卜素含量。
对比结果如表1:
表1正负菌株发酵后生产的β-胡萝卜素含量对照表
组别 β-胡萝卜素含量 较出发菌株提高%
对照例1 350.42mg/L
目的菌落1 512.46mg/L 46.24%
目的菌落2 577.71mg/L 65.01%
从表1结果可以看出,使用本方明的方法,能够有效筛选到较出发菌株的β-胡萝卜素生产能力增强的菌株,筛选目的较强,筛选效率高,大大节省了前期菌种筛选工作。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例公开如上,然而,并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰,成为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:在PDA培养基中添加三孢酸,生成筛选培养基;将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液,并对孢子悬液进行紫外诱变;将诱变后的孢子于筛选培养基中培养并形成菌落,挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
2.根据权利要求1所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:按筛选培养基质量的0.05%向筛选培养基中加入OP乳化剂。
3.根据权利要求1或2所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液,其制备过程为:将三孢布拉霉出发菌株的正负菌株按1:4比例混合,在发酵培养基中发酵6天,得到发酵液;取100ML发酵液并用稀盐酸调至pH2.0,然后7000r/min,离心10min后,留取上清溶液;在上述上清溶液中,加入等体积氯仿,震荡萃取,分液,保留氯仿层;向氯仿层中加入相同体积的4%NaHCO3溶液萃取,留取NaHCO3层;再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0,加入相同体积氯仿,充分震荡,萃取;将氯仿层旋转蒸干,得到三孢酸粗提物;三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中,-20℃保藏。
4.根据权利要求3所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:发酵培养基中按质量百分比包括以下组分:玉米淀粉3.0%,黄豆饼粉2.0%,KH2PO40.25%,MgSO4.7H2O0.02%,,豆油3.0%,工业玉米浆2.0%,VB10.005%,柠檬酸三钠0.3%,曲拉通1000.1%,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%;pH值自然。
5.根据权利要求4所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
6.根据权利要求5所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉,并于121℃灭菌20min。
7.根据权利要求6所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:PDA培养基的制备方法为,将土豆去皮,切成丁状,称取200g加入适量水中,煮沸20min,用8层滤布过滤取清液,定容至1L,加入20g葡萄糖,琼脂粉20g,加热融化后,分装至试管中,每只试管装液6-8mL,121℃灭菌20min后,即得PDA培养基。
8.根据权利要求1或7所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法,其特征在于:将保藏的三孢布拉霉正负菌株取出,挑取少量菌体,涂于PDA培养中,27℃培养6-8天,待孢子成熟后,保藏于4℃;将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下,用血球计数板计数后,稀释至106个/mL;正负菌株按照1:4的比例,相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发酵培养基中,27℃,220r/min,6天,获得菌体及发酵液;制备孢子液,取5mL孢子液于放有转子的平板中,将平板置于磁力搅拌器上,转动中紫外照射4min,取0.1mL的处理后孢子液涂布于筛选培养基上,生长2-4天,挑取目的菌落。
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