CN105602932A - β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法 - Google Patents

β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法 Download PDF

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Abstract

一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，在PDA培养基中添加三孢酸，刺激菌体生产β-胡萝卜素，从而使菌落在筛选培养基上形成黄色菌落。经过诱变处理后的菌体，会因为生产β-胡萝卜素能力不同而形成颜色深浅不一的菌落。菌落的黄色越深，代表其生产β-胡萝卜素能力越强。从黄色较深的菌落中挑选菌落为高产β-胡萝卜素菌株，目的性强，可以大大提高筛选效率，减少筛选所用时间及工作量。

Description

β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及生物工程的技术领域，具体说是一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法。
背景技术
β-胡萝卜素分子式为C40H55，是合成维生素A的前体物质，是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上具有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
目前生产β-胡萝卜素的方法主要有植物提取法，化学合成法，微生物发酵法。植物提取法是指从胡萝卜等富含β-胡萝卜素的植物中提取β-胡萝卜素，化学合成法是以化学原料化学法合成β-胡萝卜素。微生物发酵法是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物发酵生产β-胡萝卜素。其中，以三孢布拉氏霉发酵生产β-胡萝卜素最具工业应用前景。
三孢布拉氏霉属于霜霉目，白锈科，拉丁名是Blakeseleatrispora，有性无性繁殖，有（+）（）两种接合型，即正负两种菌株，单独的（+）或（）菌发酵产β-胡萝卜素的能力很低，低于45mg/L。（+）、（）菌株在PDA平板上形成白色菌落，没有明显的产色素能力。
正负菌株按不同比例混合后发酵，会产生较多的β-胡萝卜素。其中，正负菌株按1:4混合后产量最高，达到了350mg/L。
三孢布拉氏霉在平板上生长呈蔓延状，菌丝生长快，较难挑取纯菌落。在培养基中添加0.05%的OP乳化剂，限制菌丝蔓延，获得较规则的菌落，便于挑取得到较纯菌株。
US7252965B2公开了一种利用六十细胞仪来筛选β-胡萝卜素高产菌种的方法。将孢子悬液经紫外线照射后，用流式细胞仪来处理诱变后的孢子液。通过分析孢子产生的特定荧光强弱，来判断其产β-胡萝卜素能力的大小。荧光越强，生产能力越强。利用这种方法，筛选到了一株高产菌株，产量达到9g/L。
CN104805167A公开了一种生产β-胡萝卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下步骤：培养大肠杆菌基因工程菌，从发酵液中获得β-胡萝卜素，所述的大肠杆菌基因工程菌是含有外源的含四个β-胡萝卜素合成基因的表达载体的大肠杆菌，该四个β-胡萝卜素合成基因分别是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大肠杆菌基因工程菌还含有含四个MEP途径基因的表达载体，该四个MEP途径基因分别是：dxs、idi、ispD和ispF。本发明过表达MEP途径中的4个酶，构建不同强度启动子的MEP途径，从而提高β-胡萝卜素的产量。
CN101096355一种从胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的方法，公开了一种从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素的工艺。所述的方法是新鲜胡萝卜经过绞汁以后，倒入高压均质机中均质，均质后的胡萝卜浓汁中加入沉淀剂CaCl2·2H2O和稳定剂氨水/乙醇，经过离心，弃去上清液，得到橙红色沉淀；将沉淀经过冷冻干燥机冷冻干燥，得到粉末状干燥的沉淀，在沉淀中加入有机溶剂石油醚萃取其中的β-胡萝卜素，之后旋转蒸发浓缩，回收有机溶剂，得到β-胡萝卜素油状物。所提得的β-胡萝卜素纯度达90％，提取量达180mg/100g，提取率可达80％以上。该法具有工艺新颖，操作简单，成本低等特点，对研究开发从新鲜胡萝卜中提取天然β-胡萝卜素具有很高的参考价值。
CN1558953公开了三孢布拉霉的β－胡萝卜素的生物合成基因，其编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(carRP)和八氢番茄红素脱氢酶(carB)。carRP基因，其特征在于DNA序列SEQIDNO：1，编码氨基酸序列SEQIDNO：3，其具有番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQIDNO：2，编码氨基酸序列SEQIDNO：4，其具有八氢番茄红素脱氢酶活性。本发明还涉及(i)构建表达附加拷贝的所述基因的质粒的方法和(ii)在所述基因的启动子控制下表达异源基因的方法。
CN103951600A一种提取盐藻中β-胡萝卜素的方法，公开了一种提取盐藻中的β-胡萝卜素的方法，包括步骤有：(1)将盐藻泥或盐藻粉与蒸馏水以质量比1:5的比例充分混合，以盐酸调节pH值至5-6.5；(2)将蛋白酶与上述盐藻液按质量比1:33.3～54.5混合后充分溶解，保温、钝化；(3)将提取液经离心后取沉淀；(4)将沉淀与植物油以质量比1:5的比例混合后加热、保持、静置冷却，过滤得油溶液。本发明方法采用添加少量的蛋白酶即可以起到破坏细胞膜的作用，操作简便，节省了成本，适合于大规模工业化生产，同时省去了提纯后需要再用油悬浮的工艺，本方法环境友好，可大规模推广使用。
上述方法中，植物法提取具有消耗原材料多，成本高，受原料影响较大等缺点。化学合成法会合成对人体有害的中间产物，且不易分离。因此，微生物发酵法具有更广阔的应用前景。而三孢布拉氏霉具有菌体生长快，生长条件要求低，β-胡萝卜素含量较高等优点，最具前景。三孢布拉氏霉因其菌种的特殊性，用基因工程技术改造菌株难度较大，因此，较好的改造方法还是选用诱变筛选的方法。一般的筛选方法盲目性较大，原理模糊，筛选工作量大，效率低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，在PDA培养基中添加三孢酸，生成筛选培养基；将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变；将诱变后的孢子于筛选培养基中培养并形成菌落，挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
本发明还可以采用以下技术措施：
按筛选培养基质量的0.05%向筛选培养基中加入OP乳化剂。
PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液，其制备过程为：将三孢布拉霉出发菌株的正负菌株按1:4比例混合，在发酵培养基中发酵6天，得到发酵液；取100ML发酵液并用稀盐酸调至pH2.0，然后7000r/min，离心10min后，留取上清溶液；在上述上清溶液中，加入等体积氯仿，震荡萃取，分液，保留氯仿层；向氯仿层中加入相同体积的4%NaHCO3溶液萃取，留取NaHCO3层；再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0，加入相同体积氯仿，充分震荡，萃取；将氯仿层旋转蒸干，得到三孢酸粗提物；三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中，-20℃保藏。
发酵培养基中按质量百分比包括以下组分：玉米淀粉3.0%，黄豆饼粉2.0%，KH2PO40.25%，MgSO4.7H2O0.02%,，豆油3.0%，工业玉米浆2.0%，VB10.005%，柠檬酸三钠0.3%，曲拉通1000.1%，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%；pH值自然。
按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉，并于121℃灭菌20min。
PDA培养基的制备方法为，将土豆去皮，切成丁状，称取200g加入适量水中，煮沸20min，用8层滤布过滤取清液，定容至1L，加入20g葡萄糖，琼脂粉20g，加热融化后，分装至试管中，每只试管装液6-8mL，121℃灭菌20min后，即得PDA培养基。
将保藏的三孢布拉霉正负菌株取出，挑取少量菌体，涂于PDA培养中，27℃培养6-8天，待孢子成熟后，保藏于4℃；将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下，用血球计数板计数后，稀释至106个/mL；正负菌株按照1:4的比例，相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发酵培养基中，27℃，220r/min，6天，获得菌体及发酵液；制备孢子液，取5mL孢子液于放有转子的平板中，将平板置于磁力搅拌器上，转动中紫外照射4min，取0.1mL的处理后孢子液涂布于筛选培养基上，生长2-4天，挑取目的菌落。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法中，在PDA培养基中添加三孢酸，刺激菌体生产β-胡萝卜素，从而使菌落在筛选培养基上形成黄色菌落。经过诱变处理后的菌体，会因为生产β-胡萝卜素能力不同而形成颜色深浅不一的菌落。菌落的黄色越深，代表其生产β-胡萝卜素能力越强。从黄色较深的菌落中挑选菌落为高产β-胡萝卜素菌株，目的性强，可以大大提高筛选效率，减少筛选所用时间及工作量。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，在PDA培养基中添加三孢酸，生成筛选培养基；将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变；将诱变后的孢子于筛选培养基中培养并形成菌落，挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
实施例中所述三孢布拉霉Blakesleatrispora已于2015年10月28日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(邮编100101)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.11551。
按筛选培养基质量的0.05%向筛选培养基中加入OP乳化剂。
PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液，其制备过程为：将三孢布拉霉出发菌株的正负菌株按1:4比例混合，在发酵培养基中发酵6天，得到发酵液；取100ML发酵液并用稀盐酸调至pH2.0，然后7000r/min，离心10min后，留取上清溶液；在上述上清溶液中，加入等体积氯仿，震荡萃取，分液，保留氯仿层；向氯仿层中加入相同体积的4%NaHCO3溶液萃取，留取NaHCO3层；再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0，加入相同体积氯仿，充分震荡，萃取；将氯仿层旋转蒸干，得到三孢酸粗提物；三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中，-20℃保藏。
发酵培养基中按质量百分比包括以下组分：玉米淀粉3.0%，黄豆饼粉2.0%，KH2PO40.25%，MgSO4.7H2O0.02%,，豆油3.0%，工业玉米浆2.0%，VB10.005%，柠檬酸三钠0.3%，曲拉通1000.1%，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%；pH值自然。
按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉，并于121℃灭菌20min。
PDA培养基的制备方法为，将土豆去皮，切成丁状，称取200g加入适量水中，煮沸20min，用8层滤布过滤取清液，定容至1L，加入20g葡萄糖，琼脂粉20g，加热融化后，分装至试管中，每只试管装液6-8mL，121℃灭菌20min后，即得PDA培养基。
将保藏的三孢布拉霉正负出发菌株取出，挑取少量菌体，涂于PDA培养中，27℃培养6-8天，待孢子成熟后，保藏于4℃；将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下，用血球计数板计数后，稀释至106个/mL；正负菌株按照1:4的比例，相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发酵培养基中，27℃，220r/min，6天，获得菌体及发酵液；制备孢子液，取5mL孢子液于放有转子的平板中，将平板置于磁力搅拌器上，转动中紫外照射4min，取0.1mL的处理后孢子液涂布于筛选培养基上，生长2-4天，挑取目的菌落。
用800目尼龙滤布过滤发酵液，保留目的菌体；真空泵抽干获得菌体；称重；取0.03g目的菌体加入乙酸乙酯用研钵研磨至菌体无色；吸取全部研磨液至25mL容量瓶，乙酸乙酯定容至25mL；吸取上述溶液1mL于10mL容量瓶，乙酸乙酯定容至10mL；以乙酸乙酯为空白样，454nm下测其吸光OD值，根据标准曲线计算β-胡萝卜素含量。
取三孢布拉霉负出发菌株在PDA培养基上培养6-8天，至孢子成熟；将负菌孢子用无菌生理盐水洗下，制备孢子悬液；用血球计数板计数后，稀释至106个/mL；取5mL孢子液于5cM平板中，置于紫外灯下照射4min；去1mL上述孢子液，稀释涂布于筛选培养基平板上，使每个平板上长出约10个菌落；挑选两组菌落颜色比出发菌株更深更黄的菌落分别作为目的菌落1和目的菌落2；分别在PDA培养基中培养6-8天至孢子成熟；将筛选所得的负菌株与正菌株按4:1的比例混合，接种于发酵培养基，27℃，220r/min，发酵6天，测其两组β-胡萝卜素含量。
对照例1：
出发菌株正负菌株按1:4比例接种于发酵培养基，27℃，220r/min，发酵6天，测其β-胡萝卜素含量。
对比结果如表1：
表1正负菌株发酵后生产的β-胡萝卜素含量对照表
组别 β-胡萝卜素含量 较出发菌株提高%
对照例1 350.42mg/L
目的菌落1 512.46mg/L 46.24%
目的菌落2 577.71mg/L 65.01%
从表1结果可以看出，使用本方明的方法，能够有效筛选到较出发菌株的β-胡萝卜素生产能力增强的菌株，筛选目的较强，筛选效率高，大大节省了前期菌种筛选工作。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：在PDA培养基中添加三孢酸，生成筛选培养基；将三孢布拉氏霉的菌株制备为孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变；将诱变后的孢子于筛选培养基中培养并形成菌落，挑取颜色深于出发菌株的菌落即为目的菌落。
2.根据权利要求1所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：按筛选培养基质量的0.05%向筛选培养基中加入OP乳化剂。
3.根据权利要求1或2所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：PDA培养基内加入的三孢酸为三孢酸粗提物溶液，其制备过程为：将三孢布拉霉出发菌株的正负菌株按1:4比例混合，在发酵培养基中发酵6天，得到发酵液；取100ML发酵液并用稀盐酸调至pH2.0，然后7000r/min，离心10min后，留取上清溶液；在上述上清溶液中，加入等体积氯仿，震荡萃取，分液，保留氯仿层；向氯仿层中加入相同体积的4%NaHCO3溶液萃取，留取NaHCO3层；再将上述溶液的pH用稀盐酸调至2.0，加入相同体积氯仿，充分震荡，萃取；将氯仿层旋转蒸干，得到三孢酸粗提物；三孢酸粗提物溶于100ML蒸馏水中，-20℃保藏。
4.根据权利要求3所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：发酵培养基中按质量百分比包括以下组分：玉米淀粉3.0%，黄豆饼粉2.0%，KH2PO40.25%，MgSO4.7H2O0.02%,，豆油3.0%，工业玉米浆2.0%，VB10.005%，柠檬酸三钠0.3%，曲拉通1000.1%，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%；pH值自然。
5.根据权利要求4所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：按PDA培养基质量的1%向PDA培养基内添加三孢酸粗提物溶液。
6.根据权利要求5所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：按PDA培养基质量的2%向筛选培养基中添加琼脂粉，并于121℃灭菌20min。
7.根据权利要求6所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：PDA培养基的制备方法为，将土豆去皮，切成丁状，称取200g加入适量水中，煮沸20min，用8层滤布过滤取清液，定容至1L，加入20g葡萄糖，琼脂粉20g，加热融化后，分装至试管中，每只试管装液6-8mL，121℃灭菌20min后，即得PDA培养基。
8.根据权利要求1或7所述的β-胡萝卜素高产菌株的筛选方法，其特征在于：将保藏的三孢布拉霉正负菌株取出，挑取少量菌体，涂于PDA培养中，27℃培养6-8天，待孢子成熟后，保藏于4℃；将正负菌孢子用无菌生理盐水洗下，用血球计数板计数后，稀释至106个/mL；正负菌株按照1:4的比例，相对发酵培养基体积10%的比例接种于100mL发酵培养基中，27℃，220r/min，6天，获得菌体及发酵液；制备孢子液，取5mL孢子液于放有转子的平板中，将平板置于磁力搅拌器上，转动中紫外照射4min，取0.1mL的处理后孢子液涂布于筛选培养基上，生长2-4天，挑取目的菌落。
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