CN105296464A - 筛选25羟基维生素d3高产菌株和发酵培养基中聚山梨酯-80含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为筛选25羟基维生素D3高产菌株和发酵培养基中聚山梨酯-80含量的方法，解决诱变育种正突变率低，筛选工作量大，费时费力，从而不易筛选到高产菌株的问题。将能够改变25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌细胞膜通透性的物质聚山梨酯-80加入到分离培养基中，观察菌株对聚山梨酯-80的耐受情况，确定其最低耐受剂量，选用出发菌株在高浓度下不能生长的聚山梨酯-80的量，作为筛选模型。经过诱变后的自养假诺卡氏菌菌种，用所建立的筛选模型进行筛选。
Description
技术领域：
本发明涉及一种筛选25羟基维生素D3高产菌株和发酵培养基的方法。
背景技术：
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）日益成为严重威胁老年人的健康的一种慢性疾病；维生素D类药物中的25羟基维生素D3是自然存在人体内的维生素D3的活性代谢产物；多年来，25羟基维生素D3主要用于治疗老年人骨质疏松症等各种慢性骨紊乱，以及与慢性肾衰竭有关的代谢性骨疾病，低钙血病，另外，近年也作为饲料添加剂用于饲料行业。
25羟基维生素D3的制备有化学合成和生物发酵两种方法；化学合成反应步骤繁多、需要昂贵试剂、反应过程中会产生外消旋体，需要进行复杂的拆分过程，不仅大大影响收率，而且难以拆分完全，而且化学合成生产25羟基维生素D3会对环境产生较大的污染。而微生物发酵的方式能够利用微生物细胞内的酶特异性的解决25羟基维生素D3的手性结构问题，其生产条件温和，收率高，成本低廉，环境友好，成为一种有效替代化学合成的方法。
随着25羟基维生素D3市场需求量正日益扩大，优良的25羟基维生素D3高产菌株就成为发酵生产25羟基维生素D3的关键。
从当前国内生物技术产业来看，目前高产的工业生产菌种的获得主要还是采用随机选育，包括自然选育、诱变育种和以原生质体融合为代表的杂交育种技术，常常正突变率低，导致筛选工作量大，费时费力，从而不易筛选到高产菌株。
由于细胞膜对底物和产物的透性屏障作用，常导致微生物细胞的转化效率低下。主要表现为细胞催化效率一般比酶催化效率低10到100倍。此外，如果产物不能及时从细胞中释放出来而在其中过度积累，通常会造成反馈抑制效应，使目标产物的得率下降。因此，有必要采取措施来改善细胞膜对底物及产物的传质阻力，利用细胞膜通透性的变化来提高微生物的代谢通量，提高菌体发酵过程中的催化效率，从而提高目标产物的产量。利用细胞膜通透性的变化来提高微生物的代谢产物产量已经逐步应用到发酵产业中。例如，汪江波（汪江波.调控细胞通透性以提高透明质酸的产量和分子量.华西药学杂志，2006，2l（5）：465~467）报道了诱变选育甘油缺陷型菌株，添加甘油调控使得细胞膜的通透性大大增加，大幅提高了透明质酸的产量。魏娜（魏娜.γ-亚麻酸产生菌深黄被孢霉细胞膜通透性调控的研究（硕士学位论文）.上海水产大学,2007）报道了以深黄被孢霉SHFU-13为出发菌株，通过低频超声波4min与制霉菌素0.05ml方法使得菌体细胞膜通透性的增加，从而提高了γ-亚麻酸产率。胡炎华（胡炎华.逐级诱变及细胞膜通透性调节改造谷氨酸棒杆菌.2011年国际氨基酸产业创新与联盟发展高峰论坛论文集，152~156）报道了通过香豆素抗性筛选，增加细胞膜通透性提高了谷氨酸产量。
发明内容：
本发明的目的是提供了一种培养基原料来源广，成本低，出发菌株正突变株的几率高、突变株25羟基维生素D3效价高的筛选25羟基维生素D3高产菌株的方法。
本发明的另一个目的是提供了一种25羟基维生素D3高产菌株生产25羟基维生素D3的发酵培养基中聚山梨酯-80含量的筛选方法。
本发明是这样实现的：
筛选25羟基维生素D3高产菌株的方法，包括如下步骤：
（1）初筛：将诱变处理的自养假诺卡氏菌单孢子悬浮液稀释后涂布于含有聚山梨酯-80含量为15-20g/L的分离培养基做成的若干平板上，在29℃培养箱中培养144-192h，从若干平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面培养基制成的若干斜面上，在29℃培养箱中培养168h，斜面成熟后挖块种入三角瓶中的种子培养基中，同时将用于诱变处理的出发菌株斜面也挖块种入三角瓶中的种子培养基中，作为对照，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后，种入发酵培养基，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定两种菌的发酵效价，与出发菌株相比，选出自养假诺卡氏菌突变株相对发酵效价较高的菌株若干支进行复筛，
（2）复筛：将发酵效价较高的若干菌株接种于若干三角瓶中的种子培养基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后接种于若干个三角瓶中的发酵培养基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定若干个三角瓶中的发酵培养基发酵效价，挑选出一个三角瓶中发酵效价最高的一支菌株为最终产品。
25羟基维生素D3高产菌株生产25羟基维生素D3的发酵培养基中聚山梨酯-80含量的筛选方法，将种子培养基装入3个250ml三角瓶中，每瓶30ml，灭菌后，从25羟基维生素D3高产菌株的斜面挖块接入3个三角瓶种子培养基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养72h，将3个三角瓶中的种子液分别移入含有不同含量聚山梨酯-80的若干个三角瓶中的发酵培养基中进行发酵试验，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测定发酵效价，确定一个三角瓶中的发酵效价最高的发酵培养基，其聚山梨酯-80的含量为最佳值。
所述的步骤（1）中所述分离培养基成分和含量为：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，聚山梨酯-8015g/L，pH7.0。
所述的步骤（1）中所述斜面培养基成分和含量为：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，pH7.0。
所述的种子培养基成分和含量为：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH7.2。
所述的含聚山梨酯-80量不同的发酵培养基，聚山梨酯-80含量分别为1-9g/L中之一，其他成分和含量均为：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，倍他环糊精3g/L，pH7.2。
步骤（1）中所述诱变处理为将出发菌株自养假诺卡氏菌成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单孢子悬液约10ml于无菌培养皿中，使其孢子的终浓度达到120-130个/ml，紫外功率30W，灯距25cm照射30s。
步骤（1）中所述诱变处理为将出发菌株自养假诺卡氏菌成熟斜面用pH7.0的磷酸钠缓冲液成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单孢子悬液约10ml，使其孢子的终浓度达到120-130个/ml，加入烷化剂甲基磺酸乙酯EMS，终浓度为3%，振荡处理30min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡20min。
发酵培养基中聚山梨酯-80的含量为3-8g/L。
针对随机选育正突变率低，工作量大，不易筛选到高产菌株的缺点，本发明提供了一种筛选25羟基维生素D3高产菌株的方法，该方法在常规诱变选育的基础上，结合调控细胞膜通透性的方法，能有效地提高获得正突变株的几率，为25羟基维生素D3发酵生产提供优良菌种，从而提高25羟基维生素D3发酵生产水平。
表面活性剂主要是通过影响细胞膜上脂质分子间和脂质分子与膜蛋白之间的相互作用，来改变细胞膜通透性。本发明中，将表面活性剂聚山梨酯-80加入到分离培养基中进行筛选发现：能耐受聚山梨酯-80的25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌突变株其产生正突变株的几率最高。因此选用聚山梨酯-80作为筛选模型来进行25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌高产菌株的筛选。
观察25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌菌株对聚山梨酯-80的耐受情况，以平板上有无菌落生长为判定标准，确定其最低耐受剂量。其耐受剂量的确定采用如下方法：将经过诱变后的25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌单孢子悬液经稀释后分别涂布在含有不同浓度聚山梨酯-80的分离培养基上进行培养，出发菌株作为对照品同时培养。观察不同浓度平板上菌落的生长情况，如果某个浓度的平板上无菌落生长，就可确定该浓度为聚山梨酯-80的最低抑制浓度。选用出发菌株25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌在高浓度下不能生长的聚山梨酯-80，作为筛选模型。
本发明就是基于以上的原理而进行试验；将能够改变25羟基维生素D3产生菌自养假诺卡氏菌细胞膜通透性的物质聚山梨酯-80加入到分离培养基中，观察菌株对聚山梨酯-80的耐受情况，确定其最低耐受剂量，选用出发菌株在高浓度下不能生长的聚山梨酯-80的量，作为筛选模型。经过诱变后的自养假诺卡氏菌菌种，用所建立的筛选模型进行筛选，对出发菌株因不能耐受高浓度聚山梨酯-80而生长的模型，如果在诱变后能生长，说明自养假诺卡氏菌突变株对这种浓度的聚山梨酯-80能耐受，自养假诺卡氏菌突变株就能适应细胞膜通透性更大的改变，就有可能筛选得到25羟基维生素D3高产的自养假诺卡氏菌突变株。
本发明提供了一种培养基原料来源广，成本低，出发菌株正突变株的几率高、突变株25羟基维生素D3效价高的聚山梨酯-80耐受性模型筛选25羟基维生素D3高产菌株的方法。
本发明提供的25羟基维生素D3高产菌株生产25羟基维生素D3的发酵培养基的25羟基维生素D3发酵效价高。
本发明具有以下有益效果：
所提供的筛选方法操作简便易行，所涉及的培养基原料来源广，成本低，非常适合工业生产的需要；在本发明中能有效地提高获得自养假诺卡氏菌正突变株的几率，自养假诺卡氏菌正突变株的25羟基维生素D3发酵效价高，本发明为25羟基维生素D3发酵生产提供高产自养假诺卡氏菌菌株和25羟基维生素D3发酵效价高的发酵培养基，从而提高25羟基维生素D3发酵生产水平。
具体实施方式：
实施例1：
诱变：将自养假诺卡氏菌（Pseudonocardiaautotrophica）单孢子悬液通过UV诱变：将出发菌株成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散，无菌过滤收集单孢子悬液，于无菌培养皿中，紫外光照射30s，紫外灯功率30W，灯距25-30cm；
初筛：按照如下配方配制分离培养基2L：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，聚山梨酯-8015g/L，pH7.0。准备无菌培养皿100个，培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。
将诱变处理后的单孢子悬浮液1ml稀释后涂布于平板上，29℃培养箱中培养144h。
按照如下配方配制斜面培养基1.8L：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，pH7.0。准备试管120支，制成斜面备用。
在含有高浓度聚山梨酯-80平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面上，在29℃培养箱中培养168h。斜面成熟后挖块种入种子培养基中，同时将用于诱变处理的出发菌株斜面也挖块种入种子培养基中，作为对照，种子培养基成分和含量为：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH7.2。摇床转速为280r/min，29℃培养72h后，种入发酵培养基，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定发酵效价，与出发菌株相比，自养假诺卡氏菌突变株相对效价分布情况见表1，挑选出发酵效价较高的菌株20支进行复筛。
表1自养假诺卡氏菌突变株相对效价分布
从表1可知，采用该模型进行筛选，获得自养假诺卡氏菌正突变的比例较高，达到30%
复筛：将挑选出的效价较高的20支菌株接种到种子培养基，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后种入发酵培养基中，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定发酵效价，挑选出效价最高的菌株1支，保存，备用。
发酵培养基试验：将效价最高的菌株进行发酵培养基试验。按如下配方配制种子培养基100ml：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH7.2。将种子培养基装入3个250ml三角瓶中，每瓶30ml。灭菌后，从斜面菌株挖块接入种子培养基中，摇床转速为280r/min，29℃培养72h，将种子液分别接入含有不同浓度聚山梨酯-80的发酵培养基中进行发酵试验，接种量为10%（V/V）。
按照如下配方配制发酵培养基：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，倍他环糊精3g/L，聚山梨酯-801.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0g/L，pH7.2。摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测定发酵效价，所对应的测定结果见表2。
HPLC方法：色谱柱为Kromasil正相硅胶柱(250×4.6mmi.d，5um)，流动相为异丙醇-正己烷(1∶9)，流速1.5ml/min，柱温为40℃，检测波长265nm。
对含有不同聚山梨酯-80浓度的培养基进行综合比较，筛选出最佳发酵配方。
表2实验测定结果
从表2中可以看出，配方中聚山梨酯-80的浓度在3-8g/L时，25羟基维生素D3的效价较高，7g/L时25羟基维生素D3效价最高。
实施例2：
诱变：将自养假诺卡氏菌（Pseudonocardiaautotrophica）单孢子悬液通过EMS诱变：将出发菌株成熟斜面用pH7.0的磷酸钠缓冲液制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单孢子悬液约10ml（使其孢子的终浓度达到120—130个/ml），加入烷化剂EMS，终浓度为3%，振荡处理30min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡20min。
初筛：按照如下配方配制分离培养基2L：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，聚山梨酯-8015g/L，pH7.0。准备无菌培养皿100个，培养基灭菌后倒入培养皿中做成平板。
将诱变处理后的单孢子悬浮液1ml稀释后涂布于平板上，29℃培养箱中培养168h。
按照如下配方配制斜面培养基2L：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，pH7.0。准备试管120支，制成斜面备用。
在含有高浓度聚山梨酯-80平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面上，在29℃培养箱中培养168h。斜面成熟后挖块种入种子培养基中，同时将用于诱变处理的出发菌株斜面也挖块种入种子培养基中，作为对照，种子培养基成分和含量为：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH7.2，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后种入发酵培养基，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定发酵效价，与出发菌株相比，自养假诺卡氏菌突变株相对效价分布情况见表3，挑选出发酵效价较高的菌株20支进行复筛。
表3自养假诺卡氏菌突变株相对效价分布
从表3可知，采用该模型进行筛选，获得自养假诺卡氏菌正突变的比例较高，达到33.3%
复筛：将挑选出的效价较高的20支菌株接种到种子培养基，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后种入发酵培养基中，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定发酵效价，挑选出效价最高的菌株1支，保存，备用。
发酵培养基试验：将效价最高的菌株进行发酵培养基试验。按如下配方配制种子培养基100ml：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH7.2。将种子培养基装入3个250ml三角瓶中，每瓶30ml。灭菌后，从斜面菌株挖块接入种子培养基中，29℃培养72h，将种子液分别接入含有不同浓度聚山梨酯-80的发酵培养基中进行发酵试验，接种量为10%（V/V）。
按照如下配方配制发酵培养基：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，倍他环糊精3g/L，聚山梨酯-801.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0g/L，pH7.2。摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测定发酵效价，所对应的测定结果见表4。
HPLC方法：色谱柱为Kromasil正相硅胶柱(250×4.6mmi.d，5um)，流动相为异丙醇-正己烷(1∶9)，流速1.5ml/min，柱温为40℃，检测波长265nm。
对含有不同聚山梨酯-80浓度的培养基进行综合比较，筛选出最佳发酵配方。
表4实验测定结果
从表4中可以看出，配方中聚山梨酯-80的浓度在3-8g/L时，25羟基维生素D3的效价较高，7g/L时25羟基维生素D3效价最高。
Claims (9)
1.筛选25羟基维生素D3高产菌株的方法，包括如下步骤：
（1）初筛：将诱变处理的自养假诺卡氏菌单孢子悬浮液稀释后涂布于含有聚山梨酯-80含量为15-20g/L的分离培养基做成的若干平板上，在29℃培养箱中培养144-192h，从若干平板中挑选生长和产孢良好的菌株接种于斜面培养基制成的若干斜面上，在29℃培养箱中培养168h，斜面成熟后挖块种入三角瓶中的种子培养基中，同时将用于诱变处理的出发菌株斜面也挖块种入三角瓶中的种子培养基中，作为对照，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后，种入发酵培养基，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定两种菌的发酵效价，与出发菌株相比，选出自养假诺卡氏菌突变株相对发酵效价较高的菌株若干支进行复筛，
（2）复筛：将发酵效价较高的若干菌株接种于若干三角瓶中的种子培养基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养72h后接种于若干个三角瓶中的发酵培养基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养72h，停止发酵，测定若干个三角瓶中的发酵培养基发酵效价，挑选出一个三角瓶中发酵效价最高的一支菌株为最终产品。
2.25羟基维生素D3高产菌株生产25羟基维生素D3的发酵培养基中聚山梨酯-80含量的筛选方法，其特征在于将种子培养基装入3个250ml三角瓶中，每瓶30ml，灭菌后，从25羟基维生素D3高产菌株的斜面挖块接入3个三角瓶种子培养基中，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养72h，将3个三角瓶中的种子液分别移入含有不同含量聚山梨酯-80的若干个三角瓶中的发酵培养基中进行发酵试验，将三角瓶置于摇床上，摇床转速为280r/min，29℃培养48h后，补入维生素D3，使得维生素D3在发酵液中的终浓度为500ug/ml，继续培养3天，停止发酵，测定发酵效价，确定一个三角瓶中的发酵效价最高的发酵培养基，其聚山梨酯-80的含量为最佳值。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（1）中所述分离培养基成分和含量为：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，聚山梨酯-8015g/L，pH7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（1）中所述斜面培养基成分和含量为：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，玉米浆3g/L，氯化钠4g/L，琼脂15g/L，pH7.0。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的种子培养基成分和含量为：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，pH7.2。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的含聚山梨酯-80量不同的发酵培养基，聚山梨酯-80含量分别为1-9g/L中之一，其他成分和含量均为：蛋白胨15g/L，玉米浆15g/L，葡萄糖15g/L，黄豆粉4g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2g/L，倍他环糊精3g/L，pH7.2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述诱变处理为将出发菌株自养假诺卡氏菌成熟斜面用生理盐水制成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单孢子悬液约10ml于无菌培养皿中，使其孢子的终浓度达到120-130个/ml，紫外功率30W，灯距25cm照射30s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述诱变处理为将出发菌株自养假诺卡氏菌成熟斜面用pH7.0的磷酸钠缓冲液成单孢子悬液，经振荡，玻璃珠分散30min，无菌过滤收集单孢子悬液约10ml，使其孢子的终浓度达到120-130个/ml，加入烷化剂甲基磺酸乙酯EMS，终浓度为3%，振荡处理30min，加入硫代硫酸钠终止反应，振荡20min。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于发酵培养基中聚山梨酯-80的含量为3-8g/L。
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