CN106987577A - 一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法，包括：菌种活化、培养基制备、种子制备、接种、变温发酵、后处理等单元操作。该方法是集菌种活化、培养基制备、种子制备、接种、发酵、后处理等为一体，整个过程是在洁净或无菌环境中进行，不会产生跑、冒、滴、漏等不良现象，易于达到GMP要求。与传统法相比，本发明具有如下特点：巧妙的多组分培养基组方设计，为纳豆激酶产生菌的生长提供了良好的物质基础；表面活性剂的采用，使纳豆激酶的产生与分泌明显提高；变温发酵方法及工艺的应用，使纳豆激酶的产率提高6‑38%；工艺合理先进，便于扩大再生产，产量和质量明显提高，且利于环保。本发明可广泛用于纳豆激酶及其它相关产品的研发和生产。

Description

一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法
技术领域
本发明属生物工程与技术领域，具体涉及一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法。
背景技术
纳豆是日本人最爱吃的传统大豆发酵食品，纳豆激酶（Nattokinase，NK）是用大豆发酵制备的一种具有多种生物活性的蛋白酶，人们已对其进行了相当广泛深入的研究。现代科学研究已表明，它的结构为无空间折叠的线性氨基酸链，特征性作用底物为纤维蛋白，其溶栓作用优于蛇毒纤溶酶、尿激酶（UK）和蚓激酶，具有4倍大于纤溶酶的纤溶活性，分子量远远小于尿激酶、蚓激酶，且可由肠道吸收。据报道，纳豆激酶可以有效地溶解血栓，另外还具有降低血液粘度，抑制血小板凝固，降血脂、降胆固醇，改善血液循环状况，维持血细胞的正常形态和功能等多种生理功能。纳豆激酶不仅拥有纤溶酶原激活活性，而且还能直接消化利用有限的蛋白质纤维。纳豆激酶的体内外溶栓性质通过实验也已得到确定，在体内作用迅速，持续时间长，还能激活体内的纤维蛋白酶，使之温和、持续地提高血液的溶纤活性。其溶解血栓作用上的优点是它的持续性。目前临床上常用的血栓溶解剂（溶栓药物）大都是注射剂，无论是哪种注入体内，其作用时间(半衰期)都很短，只有4～20分钟，而纳豆激酶的作用时间可长达4～8小时。所以，纳豆激酶不仅有望成为临床治疗血栓病的首选治疗剂，其不同级别不同类型的制剂在预防和保健领域也将发挥重要作用。
虽然人们已对纳豆激酶的理化特性和生理药理活性进行了相当多的研究，但在如何高效制备纳豆激酶的方法学方面的研发工作开展较少。经典的生产纳豆激酶所用的方法是仅仅以大豆为原料，经过浸泡、蒸煮、降温后接种后于开放环境下发酵即可，但大豆内部菌体不易生长，产率自然不会太高；CN102586141B公开了一种以黄豆蒸煮水为主原料辅之以2种无机盐的作为培养基的液态发酵法，这种情况原料的利用率难免太低；CN103205409B公开了一种以黑豆为原料制备高活性纳豆激酶的方法；CN106085991A公开了一种固态发酵制备纳豆激酶的方法，它提供了一种以花生粕为主要原料制备纳豆激酶的方法；上述专利虽为生产纳豆激酶提供了多种原料选择并对产酶量的提升做出了一定贡献，但普遍存在原料预处理不充分，所用培养基营养组分不太均衡或不足，原料利用率偏低，发酵工艺优化不足或有待改进，微生物生长不甚旺盛，产酶效率不高等问题。还有一个更重要的问题是，传统方法所用的培养基原料大都是以粗放型原料或微生物用培养基为主成分，辅之以无机盐，从原料的廉价性考虑较多，对原料的安全性考虑不足，致使所得产品存在较大安全隐患，基本不能直接作为产品食用或应用。
发明内容
为解决上述技术方法的不足或缺陷，本发明提供一种液态发酵法制备纳豆激酶的新方法。包括以下工艺步骤：⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化；⑵发酵培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；(6)后处理得产品；
其中，所述的发酵培养基：包括如下质量的成分（g/L）：大豆全粉10-180、葡萄糖2-40、蔗糖3-45、甘氨酸2-76、丙氨酸1-49、丝氨酸5-56、赖氨酸3-58、天门冬氨酸5-50、组氨酸2-46、亮氨酸1-38、大豆蛋白肽0.05-6.0、生物素0.01-1.8、Vc 0.05-4.0、Ve 0.04-4.0、Vb50.05-6.0、烟酸0.03-4.0、烟酰胺0.05-4.0、牛磺酸0.05-4.0、L-半胱氨酸或其盐酸盐0.05-4.0、L-胱氨酸0.04-4.0、肝素钠0.02-3.0、精氨酸0.03-4.0、谷氨酸0.02-4.0、吐温-800.05-4.0、酪蛋白酸钠0.8-18.0、辅酶Q10 0.02-4.0、 MgSO4·7H2O 0.3-6、CaCl2 0.2-4，余量：去离子水，pH值=6.8-7.4；
具体的方法步骤为：
⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化
在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36-38℃培养箱中培养24-32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36-38℃培养箱中培养24-32h后即可得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种；
⑵发酵培养基的制备
发酵培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：
.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在121℃灭菌20-40min；
.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；
⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备
在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2-5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10-20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10-20倍的放大倍数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；
⑷接种
将上述制备好的种子在无菌条件下按质量比为0.5-25%的比例接入制备好的发酵培养基中；
⑸变温发酵
将接过种的培养基置于液态控温发酵罐中，装料系数为0.6-0.85，然后在转速为100-240rpm温度为42-45℃发酵2-4h，36-38℃培养20-30h，20-28℃培养18-26h；
(6)后处理
采用的后处理的方法包括发酵结束后对其进行均质化处理，然后经调配灌装检验至得到产品；或对发酵液浓缩干燥粉碎后的固态产品；或对发酵液进行分离纯化以得到精细化产品。
其中，所述发酵培养基配方中的大豆全粉是指良好的干大豆经万能粉碎法破碎后的颗粒为40-100目的产品原料。
所述步骤⑵发酵培养基的制备中的培养基的制备方法中的步骤.中所述的适量的溶剂是指能将所需组分溶解的最低量的溶剂。
所述步骤(6)中所述的干燥是指将上述发酵产物在一定条件下进行喷雾干燥或浓缩后的真空冷冻干燥或真空干燥或低温干燥；所述的粉碎是指将上述干燥后的原料采用万能粉碎法或超微破碎法进行粉碎即得不同级别的产品。
其中，所述步骤(6)中的干燥方法条件为：喷雾干燥是在进口温度为160-220℃，出口温度为60-95℃条件下进行；真空冷冻干燥法是在真空度25-100Pa，温度20-40℃条件下冷冻真空干燥；或真空干燥法是在真空度0.01-0.085MPa，温度45-75℃条件下的真空干燥。
本发明与传统制备生产纳豆激酶的方法相比，具有如下特点：
（1）独创的发酵培养基配方及其制备方法 既有利于保护营养成分、降低养分损失，满足纳豆激酶产生菌——纳豆菌或纳豆芽孢杆菌的生长代谢需求，又有利于产物纳豆激酶的产生和分泌；同时，还有利于产品的后续加工和利用；不仅能明显提高纳豆激酶的产率与产量，还可保证产品的质量与安全性；
（2）设计的变温发酵方法及工艺能充分激活纳豆激酶产生菌——纳豆菌或纳豆芽孢杆菌的生长代谢活性，进一步提高产物纳豆激酶的产生与分泌；
（3）本发明的液态发酵法制备纳豆激酶的方法科学，工艺合理先进，利于环保；
（4）由于本发明制备方法中，所用原料除了食用大豆外，其它全为食品级以上的生化类或医药级组分，所以，发酵后的发酵醪仅仅做个均质化处理即可作为产品使用；同时，该发明方法得到的发酵产物还有利于后续健康无害化的不同类型不同级别的纳豆激酶制品的研发与生产；
（5）本发明方法便于扩大再生产，提高产量和质量。
本发明所公开的一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法的有益效果是：
（1）均衡全面的多组分培养基配方为纳豆激酶产生菌的生长提供了良好的物质基础；
（2）吐温-80等高效安全表面活性剂的采用，使纳豆激酶的产生与分泌明显提高；
（3）变温发酵方法及工艺的应用，使纳豆激酶的产率提高6-38%；
（4）集菌种活化、培养基的制备、种子制备、接种、发酵等工艺技术为一体，整个过程是在洁净或无菌环境中进行，不会产生跑、冒、滴、漏等不良现象，易于达到国家GMP的要求。
具体实施方式
以下介绍本发明的实施例。
实施例1：
一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法，包括以下工艺步骤：
⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化
在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36-38℃培养箱中培养24-32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36-38℃培养箱中培养24-32h后即可得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种；
⑵发酵培养基的制备
其中，所需的发酵培养基配方（g/L）为：大豆全粉100、葡萄糖25、蔗糖20、甘氨酸38、丙氨酸28、丝氨酸27、赖氨酸29、天门冬氨酸25、组氨酸23、亮氨酸18、大豆蛋白肽3.0、生物素0.5、Vc 2.0、Ve 2.0、Vb5 3.0、烟酸2.0、烟酰胺2.0、牛磺酸2.0、L-半胱氨酸或其盐酸盐2.0、L-胱氨酸2.0、肝素钠0.3、精氨酸2.0、谷氨酸2.0、吐温-80 2.0、酪蛋白酸钠9.0、辅酶Q10 2.0、 MgSO4·7H2O 2.0、CaCl2 1，余量：去离子水，pH值=7.2；
发酵培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：
.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在121℃灭菌20-40min；
.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；
⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备
在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2-5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10-20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10-20倍的放大倍数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；
⑷接种
将上述制备好的种子在无菌条件下按质量比为8%的比例接入制备好的发酵培养基中；
⑸变温发酵
将接过种的培养基置于液态控温发酵罐中，装料系数为0.75，然后在转速为180rpm温度为43℃发酵3h，37℃培养25h，24℃培养20h；发酵结果表明，与传统法相比，纳豆激酶的产率提高38%；
(6)后处理
采用的后处理的方法是发酵结束后对其进行均质化处理，然后经调配灌装检验至得到产品。
实施例2：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
a. 工艺步骤⑵发酵培养基的制备中的发酵培养基的组成是（g/L）：大豆全粉10、葡萄糖40、蔗糖3、甘氨酸76、丙氨酸1、丝氨酸56、赖氨酸3、天门冬氨酸50、组氨酸2、亮氨酸38、大豆蛋白肽0.05、生物素1.8、Vc 0.05、Ve 4.0、Vb5 0.05、烟酸4.0、烟酰胺0.05、牛磺酸4.0、L-半胱氨酸或其盐酸盐0.05、L-胱氨酸4.0、肝素钠0.02、精氨酸4.0、谷氨酸0.02、吐温-804.0、酪蛋白酸钠0.8、辅酶Q10 0.02、 MgSO4·7H2O 6.0、CaCl2 0.2，余量：去离子水，pH值=7.4；
b. 工艺步骤（1）和⑶纳豆芽孢杆菌菌种活化和种子制备的方法条件为：在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于38℃培养箱中培养24h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，38℃培养箱中培养24h后得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种，在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的种子培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按20倍的放大系数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；
c. 工艺步骤⑷接种中的接种量为：种子与制备好的发酵培养基按质量百分比为0.5%；
d. 工艺步骤⑸变温发酵条件为：将接过种的培养基置于液态控温发酵罐中，装料系数为0.6，在搅拌转速为240rpm条件下于45℃发酵2h，38℃培养20h，28℃培养18h即可；发酵结果表明，与传统法相比，纳豆激酶的产率提高8%；
e. 工艺步骤（6）后处理的方法为：对发酵液浓缩干燥粉碎后得到固态产品。
实施例3：
与实施例1的步骤相同，所不同的是：
a. 工艺步骤⑵发酵培养基的制备中的发酵培养基的组成是（g/L）：大豆全粉180、葡萄糖2、蔗糖45、甘氨酸2、丙氨酸49、丝氨酸5、赖氨酸58、天门冬氨酸5、组氨酸46、亮氨酸1、大豆蛋白肽6.0、生物素0.01、Vc 4.0、Ve 0.04、Vb5 6.0、烟酸0.0、烟酰胺4.0、牛磺酸0.05、L-半胱氨酸或其盐酸盐4.0、L-胱氨酸0.04、肝素钠3.0、精氨酸0.03、谷氨酸4.0、吐温-800.05、酪蛋白酸钠18.0、辅酶Q10 4.0、 MgSO4·7H2O 0.3、CaCl2 4，余量：去离子水，pH值=6.8；
b. 工艺步骤（1）和⑶纳豆芽孢杆菌菌种活化和种子制备的方法条件为：在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36℃培养箱中培养32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36℃培养箱中培养32h后得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种，在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的种子培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10-20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10倍的放大系数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；
c. 工艺步骤⑷接种中的接种量为：种子与制备好的发酵培养基按质量百分比为25%；
d. 工艺步骤⑸变温发酵条件为：将接过种的培养基置于液态控温发酵罐中，装料系数为0.85，然后在搅拌转速为100rpm条件下于42℃发酵4h，36℃培养30h，20℃培养26h即可；发酵结果表明，与传统法相比，纳豆激酶的产率提高25%；
e. 工艺步骤（6）后处理的方法为：对发酵液采用硫酸铵分级沉淀和柱色谱进行分离纯化以得到精细化产品。

Claims (5)

1.一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化；⑵发酵培养基的制备；⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备；⑷接种；⑸变温发酵；(6)后处理得产品；
其中，所述的发酵培养基：包括如下质量的成分（g/L）：大豆全粉10-180、葡萄糖2-40、蔗糖3-45、甘氨酸2-76、丙氨酸1-49、丝氨酸5-56、赖氨酸3-58、天门冬氨酸5-50、组氨酸2-46、亮氨酸1-38、大豆蛋白肽0.05-6.0、生物素0.01-1.8、Vc 0.05-4.0、Ve 0.04-4.0、Vb50.05-6.0、烟酸0.03-4.0、烟酰胺0.05-4.0、牛磺酸0.05-4.0、L-半胱氨酸或其盐酸盐0.05-4.0、L-胱氨酸0.04-4.0、肝素钠0.02-3.0、精氨酸0.03-4.0、谷氨酸0.02-4.0、吐温-800.05-4.0、酪蛋白酸钠0.8-18.0、辅酶Q10 0.02-4.0、 MgSO4·7H2O 0.3-6、CaCl2 0.2-4，余量：去离子水，pH值=6.8-7.4；
具体的方法步骤为：
⑴纳豆芽孢杆菌菌种的活化
在无菌环境下，将保藏的纯种纳豆芽孢杆菌菌种用接种环挑取1环在常规试管斜面培养基上划线接种，于36-38℃培养箱中培养24-32h后，挑取生长良好的单菌落涂布到新的试管斜面上，36-38℃培养箱中培养24-32h后即可得到活化的纳豆芽孢杆菌菌种；
⑵发酵培养基的制备
发酵培养基的制备方法：包含以下工艺步骤：
.按本专利所述的配方和配方量分别称取或量取各组分并将其按对温度的敏感性分为3组：A组（耐高温——包括配方中的大豆全粉、大豆蛋白肽、氨基酸和无机盐），B组（较耐高温——包括配方中的2种糖、吐温-80 和酪蛋白酸钠）和C组（敏感组分——包括配方中的全部维生素），备用；
.将称取或量取的A组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在121℃灭菌20-40min；
.将称取或量取的B组各组分在无菌条件下混合在一起，加入适量的水混合均匀后在115℃灭菌15-30min；
.将称取或量取的C组各组分在无菌条件下根据其溶解性用适量的溶剂溶解后无菌过滤，将所得滤液收集在一起，备用；
.在无菌条件下，将C组滤液加入到灭过菌的A+B组组分中，搅拌混合均匀即得所述生产纳豆激酶的培养基，备用；
⑶纳豆芽孢杆菌种子的制备
在无菌条件下，向活化后的纳豆芽孢杆菌斜面试管里加入2-5ml无菌水制备菌悬液，然后，分装到1～2个装有灭过菌的发酵培养基的三角瓶中，在38℃、180r/min条件下振荡培养10-20h作为发酵种子，备用；此后，根据生产规模的大小，按10-20倍的放大倍数进行发酵用种子的1、2、3级扩培；
⑷接种
将制备好的种子在无菌条件下按质量比为0.5-25%的比例接入发酵培养基中；
⑸变温发酵
将接过种的培养基置于液态控温发酵罐中，装料系数为0.6-0.85，然后在转速为100-240rpm温度为42-45℃发酵2-4h，36-38℃培养20-30h，20-28℃培养18-26h；
(6)后处理
采用的后处理的方法包括发酵结束后对其进行均质化处理，然后经调配灌装检验至得到产品；或对发酵液浓缩干燥粉碎后的固态产品；或对发酵液进行分离纯化以得到精细化产品。
2.根据权利要求1所述的液态发酵法制备纳豆激酶法，其特征在于：所述发酵培养基配方中的大豆全粉是指良好的干大豆经万能粉碎法破碎后的颗粒为40-100目的产品原料。
3.根据权利要求1所述的液态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤⑵发酵培养基的制备中的培养基的制备方法中的步骤.中所述的适量的溶剂是指能将所需组分溶解的最低量的溶剂。
4.根据权利要求1所述的液态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述的干燥是指将上述发酵产物在一定条件下进行喷雾干燥或浓缩后的真空冷冻干燥或真空干燥或低温干燥；所述的粉碎是指将上述干燥后的原料采用万能粉碎法或超微破碎法进行粉碎即得不同级别的产品。
5.根据权利要求4所述的液态发酵法制备纳豆激酶的方法，其特征在于：所述步骤(6)后处理中的干燥方法条件为：喷雾干燥是在进口温度为160-220℃，出口温度为60-95℃条件下进行；真空冷冻干燥法是在真空度25-100Pa，温度20-40℃条件下冷冻真空干燥；或真空干燥法是在真空度0.01-0.085MPa，温度45-75℃条件下的真空干燥。
CN201710398211.9A 2017-05-31 2017-05-31 一种液态发酵法制备纳豆激酶的方法 Pending CN106987577A (zh)

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