CN108546647A - 一种双歧杆菌冻干制剂及其专用保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，涉及一种双歧杆菌冻干制剂及其专用保护剂，所述双歧杆菌冻干制剂，是在双歧杆菌菌体中加入上述的保护剂后，经冷冻干燥后得到的。所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，其特征在于，由下述重量份的组分组成：低聚木糖3‑5份，乳糖4‑8份，聚乙二醇0.5‑1.5份，丙氨酸1.5‑3份，赖氨酸0.5‑1份，脱脂乳粉3‑5份，水苏糖2‑4份，吉林人参低聚肽0.1‑0.5份，碳酸氢钠0.4‑0.6份，抗坏血酸钠0.7‑1.2份，水80‑100份。
Description
技术领域：
本发明属于生物领域，具体涉及一种双歧杆菌冻干菌剂及其专用保护剂。
背景技术：
双歧杆菌（Bifidobacterium）是1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，末端常常分叉，故名双歧杆菌。双歧杆菌归属于放线菌科双歧杆菌属，专性厌氧，革兰氏阳性，成杆状，不形成芽孢，不运动。因为它能发酵糖类，产生大量乳酸，又称为乳酸菌。它可利用葡萄糖，乳糖，半乳糖和果糖。一般将果糖作为碳源，将氮作为唯一可利用的氮源。与人类相关的双歧杆菌菌株有：双歧杆菌，长双歧杆菌，婴儿双歧杆菌，短双歧杆菌，青春双歧杆菌，梭形双歧杆菌，链状双歧杆菌，假链状双歧杆菌和齿状双歧杆菌。双歧杆菌是健康人肠道数量最多、最常见的正常菌群之一，具有以下治疗效果：1、维护肠道正常细菌菌群平衡，抑制病原菌的生长，防止便秘，下痢和胃肠障碍等；2、抗肿瘤；3、在肠道内合成维生素、氨基酸和提高机体对钙离子的吸收；4、降低血液中胆固醇水平，防治高血压；5、改善乳制品的耐乳糖性，提高消化率；6、增强人体免疫机能，预防抗生素的副作用，抗衰老，延年益寿。
双歧杆菌等微生态制品具有保健以及预防和治疗疾病的作用，主要依赖制品的功能活菌的存在，而如何提高发酵生产的活菌数，以及保持产品活菌的存活稳定性，对于制品的作用效果来说是一个非常关键的问题。双歧杆菌菌剂的制备方法主要有喷雾干燥技术，真空干燥技术及真空冷冻干燥技术。真空冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低的温度(一般为－10℃～－50℃)下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术，乳酸菌可通过这种干燥技术保持较高的生理特性，并可直接投入食品生产中。但在真空冷冻干燥过程中，双歧杆菌要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，导致菌体死亡，影响其冻干存活率及菌粉活菌数的因素中，冻干保护剂是最为复杂、最难选择的关键因素，它不仅影响双歧杆菌在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性，目前，常用的微生物冻干保护剂有海藻糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脱脂奶粉、糊精等，并且，现有双歧杆菌冻干制剂的制备所涉及的配方相当复杂，一个配方往往会涉及多种微生物冻干保护剂，复杂的配方对微生物冻干保护剂原料的安全性提出了更高的要求，同时大大增加了在制备过程中污染的风险，进而对消费者构成了潜在的威胁。此外，随着生活质量的不断提高，与我们每个人日常生活息息相关的双歧杆菌制剂所采用的微生物冻干保护剂(糊精等)的食品安全问题越来越受到消费 者的重视，而目前市场上非常匮乏天然、安全、健康的双歧杆菌冻干制剂。因此，寻找的新型乳酸菌冻干制剂的制备方法和产品将是未来双歧杆菌冻干制剂制备的重要研究方向之一。
吉林人参低聚肽是人参蛋白经蛋白酶类水解后制得的低聚肽类产品，一般包含3-10个氨基酸分子，何丽霞、刘睿等研究了吉林人参低聚肽的免疫调节作用（参见科技导报2015年18期），鲍雷、王军波等研究了吉林人参低聚肽抗疲劳作用（参见科技导报2015年13期），但将吉林人参低聚肽用于微生物冻干保护剂尚未见报道。
发明内容：
本发明的目的是提供一种双歧杆菌冻干制剂及其专用保护剂，提供一种能显著提高双歧杆菌冻干存活率及菌粉活菌数的冻干复合保护剂及其应用方法，解决了双歧杆菌菌粉在冻干过程中存在的冻干存活率低，活菌数少等问题，提高了菌粉的保健功能。
本发明所提供的用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成：低聚木糖 3-5份，乳糖4-8份，聚乙二醇0.5-1.5份，丙氨酸1.5-3份，赖氨酸0.5-1份，脱脂乳粉3-5份，水苏糖 2-4份，吉林人参低聚肽0.1-0.5份，碳酸氢钠0.4-0.6份，抗坏血酸钠0.7-1.2份，水80-100份。
优选地，用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成：低聚木糖4份，乳糖6份，聚乙二醇0.9份，丙氨酸3份，赖氨酸1份，脱脂乳粉4份，水苏糖 3份，吉林人参低聚肽0.3份，碳酸氢钠0.5份和抗坏血酸钠 0.9份，水90份。
所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂由以下方法制备得到：第一，按重量份称取各原料；第二，将低聚木糖、乳糖、聚乙二醇、丙氨酸、赖氨酸，脱脂乳粉、水苏糖、碳酸氢钠、抗坏血酸钠和水混合，加热至55-60℃，搅拌混匀，冷却至25-30℃，而后利用0.22μm的滤器（Millipore）过滤除菌；第三，向过滤除菌的滤液中加入吉林人参低聚肽，搅拌均匀即制得所述的双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂。
本发明提供的双歧杆菌冻干制剂，是在双歧杆菌菌体中加入上述的保护剂后，经冷冻干燥后得到的。
本发明所述的双歧杆菌冻干制剂经以下方法制备得到：第一，采用液体培养的方式培养双歧杆菌：将双歧杆菌活化三次后 按2％(V/V)的接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；第二，将培养好的双歧杆菌培养液进行离心分离，8000rpm，离心12min得双歧杆菌菌泥；第三，按照1g菌泥：5mL双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的比例，将菌体与专用保护剂混合均匀，然后在低温冰箱中于-40℃预冻3-12h，然后放入冻干机于温度-50--60℃，真空度为4-6Pa下冷冻干燥18-24h，即得所述的双歧杆菌冻干制剂。
本发明具有如下优点和有益效果：
本发明中首次创新地将吉林人参低聚肽用于制备双歧杆菌的冻干保护剂，尽管目前其对于双歧杆菌冻干保护的机理尚不明确，然而经试验证明，添加吉林人参低聚肽后，双歧杆菌的冻干存活率得到了显著的提高；另外，本发明中严格控制丙氨酸和赖氨酸的比例为3:1，其对于双歧杆菌冻干也具有一定积极的意义。本发明所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂是将低聚木糖、乳糖、聚乙二醇、丙氨酸、赖氨酸，脱脂乳粉、水苏糖、碳酸氢钠、抗坏血酸钠和吉林人参低聚肽按照比例有机组合而成，利用该复合保护剂对双歧杆菌进行冷冻干燥，冻干存活率达90％以上，解决了在开发高活性双歧杆菌冻干菌粉过程中的重大关键技术问题，制备的高活性菌粉可作为添加剂、发酵剂用于开发两歧双歧杆菌功能性食品和医药制剂。
具体实施方式：
实施例1：一种双歧杆菌冻干制剂，经以下方法制备得到：第一，采用液体培养的方式培养双歧杆菌：将双歧杆菌活化三次后 按2％(V/V)的接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；第二，将培养好的双歧杆菌培养液进行离心分离，8000rpm，离心12min得双歧杆菌菌泥；第三，按照1g菌泥：5mL双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的比例，将菌体与专用保护剂混合均匀，然后在低温冰箱中于-40℃预冻7h，然后放入冻干机于温度-55℃，真空度为4-6Pa下冷冻干燥20h，即得所述的双歧杆菌冻干制剂。
所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成：低聚木糖4份，乳糖6份，聚乙二醇0.9份，丙氨酸3份，赖氨酸1份，脱脂乳粉4份，水苏糖 3份，吉林人参低聚肽0.3份，碳酸氢钠0.5份和抗坏血酸钠 0.9份，水90份。所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂由以下方法制备得到：第一，按重量份称取各原料；第二，将低聚木糖、乳糖、聚乙二醇、丙氨酸、赖氨酸，脱脂乳粉、水苏糖、碳酸氢钠、抗坏血酸钠和水混合，加热至58℃，搅拌混匀，冷却至25℃，而后利用0.22μm的滤器（Millipore）过滤除菌；第三，向过滤除菌的滤液中加入吉林人参低聚肽，搅拌均匀即制得所述的双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂。
实施例2：一种双歧杆菌冻干制剂，经以下方法制备得到：第一，采用液体培养的方式培养双歧杆菌：将双歧杆菌活化三次后 按2％(V/V)的接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；第二，将培养好的双歧杆菌培养液进行离心分离，8000rpm，离心12min得双歧杆菌菌泥；第三，按照1g菌泥：5mL双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的比例，将菌体与专用保护剂混合均匀，然后在低温冰箱中于-40℃预冻7h，然后放入冻干机于温度-55℃，真空度为4-6Pa下冷冻干燥20h，即得所述的双歧杆菌冻干制剂。
所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成：低聚木糖3份，乳糖4份，聚乙二醇1.5份，丙氨酸1.5份，赖氨酸0.5份，脱脂乳粉5份，水苏糖4份，吉林人参低聚肽0.2份，碳酸氢钠0.6份，抗坏血酸钠 0.7份，水80份。所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂由以下方法制备得到：第一，按重量份称取各原料；第二，将低聚木糖、乳糖、聚乙二醇、丙氨酸、赖氨酸，脱脂乳粉、水苏糖、碳酸氢钠、抗坏血酸钠和水混合，加热至58℃，搅拌混匀，冷却至25℃，而后利用0.22μm的滤器（Millipore）过滤除菌；第三，向过滤除菌的滤液中加入吉林人参低聚肽，搅拌均匀即制得所述的双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂。
实施例3：一种双歧杆菌冻干制剂，经以下方法制备得到：第一，采用液体培养的方式培养双歧杆菌：将双歧杆菌活化三次后 按2％(V/V)的接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；第二，将培养好的双歧杆菌培养液进行离心分离，8000rpm，离心12min得双歧杆菌菌泥；第三，按照1g菌泥：5mL双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的比例，将菌体与专用保护剂混合均匀，然后在低温冰箱中于-40℃预冻7h，然后放入冻干机于温度-55℃，真空度为4-6Pa下冷冻干燥20h，即得所述的双歧杆菌冻干制剂。
所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成：低聚木糖5份，乳糖7份，聚乙二醇1.5份，丙氨酸2.1份，赖氨酸0.7份，脱脂乳粉5份，水苏糖4份，吉林人参低聚肽0.5份，碳酸氢钠0.6份，抗坏血酸钠1.2份，水100份；所述用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂由以下方法制备得到：第一，按重量份称取各原料；第二，将低聚木糖、乳糖、聚乙二醇、丙氨酸、赖氨酸，脱脂乳粉、水苏糖、碳酸氢钠、抗坏血酸钠和水混合，加热至58℃，搅拌混匀，冷却至25℃，而后利用0.22μm的滤器（Millipore）过滤除菌；第三，向过滤除菌的滤液中加入吉林人参低聚肽，搅拌均匀即制得所述的双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂。
实施例4：双歧杆菌冻干保护试验
双歧杆菌菌泥的制备：采用液体培养的方式培养双歧杆菌：将双歧杆菌活化三次后 按2％(V/V)的接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；而后，将培养好的双歧杆菌培养液进行离心分离，8000rpm，离心12min得双歧杆菌菌泥。
活菌计数采用平板涂布计数法：取1g菌泥加入到10mL无菌生理盐水中，用十倍梯度稀释法稀释，选择适宜的三个稀释梯度进行测定。分别吸取样品稀释液0.1mL，每个稀释度做三个平板，倒置于37℃恒温箱中培养36h，计数，并按如下公式计算。
双歧杆菌菌泥活菌数(CFU/g)＝每平皿平均菌体数(CFU)×10×稀释倍数
双歧杆菌冻干制剂的制备：按照1g菌泥：5mL双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的比例，将菌体与专用保护剂混合均匀，然后在低温冰箱中于-40℃预冻7h，然后放入冻干机于温度-55℃，真空度为4-6Pa下冷冻干燥20h，即得所述的双歧杆菌冻干制剂。
双歧杆菌冻干制剂的复活：取一份双歧杆菌冻干制剂（即由1g菌泥制备得到的双歧杆菌冻干制剂），接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；而后采用平板涂布计数法计算每份双歧杆菌冻干制剂中的活菌数，即对应每克菌泥经冻干后的存活菌的数量。
双歧杆菌存活率=一份双歧杆菌冻干制剂中的活菌数/1g双歧杆菌菌泥活菌数*100%。
在本实验中采用了实施例1-3的冻干保护剂分别进行了试验，同时还设置了以下对照组：
对照组1：冻干保护剂采用如下配方的保护剂进行替换，低聚木糖 3份，乳糖4份，聚乙二醇1.5份，丙氨酸1.5份，赖氨酸0.5份，脱脂乳粉5份，水苏糖4份，碳酸氢钠0.6份，抗坏血酸钠 0.7份，水80份。其他条件同实施例1。
对照组2：冻干保护剂采用如下配方的保护剂进行替换，低聚木糖 3份，乳糖4份，聚乙二醇1.5份，丙氨酸2份，赖氨酸0.3份，脱脂乳粉5份，水苏糖4份，碳酸氢钠0.6份，抗坏血酸钠 0.7份，水80份。其他条件同实施例1。
对照组3：冻干保护剂采用如下配方的保护剂进行替换，低聚木糖 3份，乳糖4份，聚乙二醇1.5份，脱脂乳粉5份，水苏糖4份，吉林人参低聚肽0.3份碳酸氢钠0.6份，抗坏血酸钠 0.7份，水80份。其他条件同实施例1。
对照组4：市售的微生物冻干保护剂，根据冻干保护剂使用说明使用。
经试验检测，具体结果如下表1：
表1 双歧杆菌冻干存活试验
| 组别 | 1g菌泥活菌（1011cfu/g） | 冻干制剂相应于1g菌泥的活菌数（1011cfu/g） | 冻干后的存活率 |
| 实施例1 | 2.02 | 1.92 | 94.6% |
| 实施例2 | 2.02 | 1.87 | 92.6% |
| 实施例3 | 2.02 | 1.83 | 90.6% |
| 对照组1 | 2.02 | 1.52 | 75.3% |
| 对照组2 | 2.02 | 1.38 | 68.3% |
| 对照组3 | 2.02 | 1.49 | 73.8% |
| 对照组4 | 2.02 | 1.69 | 83.7% |
由以上结果可知，本发明实施例1-3的冻干保护剂，其对于双歧杆菌由预料不到的保护作用，采用实施例1-3制得的双歧杆菌冻干制剂的双歧杆菌存活率高达94.6%，最低的存活率为90.6%，其相比对照组4（市售的冻干保护剂）83.7%的存活率要高出6.9%，说明本发明的保护剂相比市售的保护剂具有突出的优势。而相比对照组1（没有添加吉林人参低聚肽）75.3%的存活率、以及对照组2（没有添加吉林人参低聚肽以及丙氨酸、赖氨酸比例不为3:1）68.3%而言，本发明实施例1-3的存活率要高出近20%以上，说明在本发明中吉林人参低聚肽的添加以及丙氨酸和赖氨酸的比例对于双歧杆菌的冻存保存具有重要的保护作用；相比对照组2（没有添加吉林人参低聚肽以及丙氨酸、赖氨酸比例不为3:1）和对照组3（没有添加丙氨酸和赖氨酸）而言，本发明实施例1-3的存活率也要远远高于以上两组，说明丙氨酸和赖氨酸的添加及比例对于双歧杆菌的冻存保护具有重要的意义。综合以上结果，可以得知，正是吉林人参低聚肽、丙氨酸和赖氨酸的添加以及丙氨酸和赖氨酸的比例控制使得本发明取得了预料不到的技术效果，制得了具有高活性的双歧杆菌冻干制剂。
Claims (5)
1.一种用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，其特征在于，由下述重量份的组分组成：低聚木糖 3-5份，乳糖4-8份，聚乙二醇0.5-1.5份，丙氨酸1.5-3份，赖氨酸0.5-1份，脱脂乳粉3-5份，水苏糖 2-4份，吉林人参低聚肽0.1-0.5份，碳酸氢钠0.4-0.6份，抗坏血酸钠0.7-1.2份，水80-100份。
2.根据权利要求1所述的用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂，优选地，由下述重量份的组分组成：低聚木糖4份，乳糖6份，聚乙二醇0.9份，丙氨酸3份，赖氨酸1份，脱脂乳粉4份，水苏糖 3份，吉林人参低聚肽0.3份，碳酸氢钠0.5份和抗坏血酸钠 0.9份，水90份。
3.一种制备权利要求1-2任一项所述的用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的方法，其特征在于，由以下方法制备得到：第一，按重量份称取各原料；第二，将低聚木糖、乳糖、聚乙二醇、丙氨酸、赖氨酸，脱脂乳粉、水苏糖、碳酸氢钠、抗坏血酸钠和水混合，加热至55-60℃，搅拌混匀，冷却至25-30℃，而后利用0.22μm的滤器（Millipore）过滤除菌；第三，向过滤除菌的滤液中加入吉林人参低聚肽，搅拌均匀即制得所述的双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂。
4.一种双歧杆菌冻干制剂，其特征在于：其是在双歧杆菌菌体中加入权利要求1-2所述的用于双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂后，经冷冻干燥后得到的。
5.一种制备权利要求4所述的双歧杆菌冻干制剂的方法，其特征在于，经以下方法制备得到：第一，采用液体培养的方式培养双歧杆菌：将双歧杆菌活化三次后 按2％(V/V)的接种量接入含0.5g/L半胱氨酸盐酸盐的MRS培养基中培养18h；第二，将培养好的双歧杆菌培养液进行离心分离，8000rpm，离心12min得双歧杆菌菌泥；第三，按照1g菌泥：5mL双歧杆菌冻干制剂的专用保护剂的比例，将菌体与专用保护剂混合均匀，然后在低温冰箱中于-40℃预冻3-12h，然后放入冻干机于温度-50--60℃，真空度为4-6Pa下冷冻干燥18-24h，即得所述的双歧杆菌冻干制剂。
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| CN111534434A (zh) * | 2020-06-28 | 2020-08-14 | 江南大学 | 一种冻干保护剂及其在冻干青春双歧杆菌中的应用 |
| CN111534434B (zh) * | 2020-06-28 | 2022-07-05 | 江南大学 | 一种冻干保护剂及其在冻干青春双歧杆菌中的应用 |
| CN113767164A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-12-07 | 科丝美诗纽芝丽株式会社 | 用于提高益生菌肠道存活率和粘附性的益生菌冻干物再激活组合物 |
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| CN113151109A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-07-23 | 天津大学 | 一种益生菌低温冷冻复合保护剂及其应用 |
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