CN101016527A - 一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双歧杆菌活菌制剂的制备方法及其专用保护剂。该保护剂，由下述重量份的组分组成：甘油0.01－5.0份；聚乙烯吡咯烷酮0.1－6.0份；聚乙二醇0.1－5.0份；脱脂奶粉1.0－10.0份；海藻糖0.5－15.0份；谷氨酸钠0.1－5.0份，L－天冬氨酸0.1－5.0份；维生素C钠0.1－5.0份；鸟氨酸盐酸盐0.1－5.0份。本发明的方法，解决了常规方法生产的双歧杆菌制品常温保存困难的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂。
背景技术
双歧杆菌(Lactobacillus bifidus)是一类革兰氏阳性厌氧菌，它是健康人肠道数量最多、最常见的正常菌群之一。1899年由法国巴斯德研究所的Tissier博士首次从健康的母乳喂养的婴儿粪便中分离得到。之后，以日本为主以及包括欧洲国家在内各国家的研究人员通过30多年的研究，渐渐发现了双歧杆菌对人体的有益作用，并已成为衡量机体健康、评价改善胃肠菌群的功能性食品的标志之一。双歧杆菌在健康成年人及长寿老人胃肠道是优势菌，其随年龄变化呈动态趋势，并与许多病理毒理现象有密切相关，当肌体患病或衰老时肠道的双歧杆菌数量较正常少。大量的研究表明，双歧杆菌数量上的多少对人的生理与健康有着重要影响，对于维持肠道菌群平衡和防治各种肠道疾病有重要意义。在肠道内，双歧杆菌具有如下几种生理功能：1.通过细胞上的磷酸与肠黏膜上皮细胞特异性地结合，从而占据肠粘膜表面，形成与肠上皮细胞相连接的细菌生物膜(膜菌群)，构成生物学屏障，阻止各种致病菌、条件致病菌的定植和入侵。2.营养作用：在肠内发酵后可产生乳酸和醋酸，可提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收。3.抗肿瘤作用：由于双歧杆菌的存在及其生成的代谢产物优化了肠道菌群的组合，所以增强免役功能，抑制了肿瘤细胞的增殖和致癌物质的产生，并能激活机体吞噬细胞的吞噬活性，促进特异性和非特异性IgA抗体的产生，增强免役系统的功能，提高抗体抗病能力。此外双歧杆菌还有抗感染、降低胆固醇、延缓肌体衰老等作用。
双歧杆菌等微生态制品具有保健以及预防和治疗疾病的作用，主要依赖制品的功能活菌的存在，而如何提高发酵生产的活菌数，以及保持产品活菌的存活稳定性，对于制品的作用效果来说是一个非常关键的问题。由于双歧杆菌是专性厌氧菌，对空气和温度十分敏感，因此在实际应用中也出现一些问题。菌种在生产、运输和保存的过程中，容易失活。为了使产品的活菌数保持在一定的水平，国内外的研究人员做了大量关菌种基因改造、微囊技术、菌体包埋技术等方面的研究，但从目前来看，产品常常被要求在低温下保存，绝大多数含双歧杆菌的产品都没有解决常温保存的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种双歧杆菌活菌制剂及其专用保护剂。
本发明所提供的用于双歧杆菌活菌制剂的专用保护剂，由下述重量份的组分组成：甘油0.01-5.0份；聚乙烯吡咯烷酮0.1-6.0份；聚乙二醇0.1-5.0份；脱脂奶粉1.0-10.0份；海藻糖0.5-15.0份；谷氨酸钠0.1-5.0份，L-天冬氨酸0.1-5.0份；维生素C钠0.1-5.0份；鸟氨酸盐酸盐0.1-5.0份。
所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂，优选由下述重量份的组分组成：甘油2.5份；聚乙烯吡咯烷酮3.0份；聚乙二醇3.0份；脱脂奶粉8.0份；海藻糖5.0份；谷氨酸钠0.5份，L-天冬氨酸0.5份；维生素C钠0.5份；鸟氨酸盐酸盐3.0份。
所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂的各组分以溶液形式存在，所述甘油溶液为含有质量百分含量为0.01-5.0％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为含有质量百分含量为0.1-6.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液为含有质量百分含量为0.1-5.0％聚乙二醇的溶液；所述脱脂奶粉溶液为含有质量百分含量为1.0-10.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液为含有质量百分含量为0.5％-15.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％谷氨酸钠和质量百分含量为0.1％-5.0％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液。
所述甘油溶液优选为含有质量百分含量优选为2.5％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液优选为含有质量百分含量为3.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液优选为含有质量百分含量为3.0％聚乙二醇溶液；所述脱脂奶粉溶液优选为含有质量百分含量为8.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液优选为含有质量百分含量为5.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液优选为含有质量百分含量为0.5％谷氨酸钠和质量百分含量为0.5％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液优选为含有质量百分含量为0.5％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液优选为含有质量百分含量为3.0％鸟氨酸盐酸盐溶液。
本发明提供的双歧杆菌活菌制剂，是在双歧杆菌菌体中加入上述的保护剂后，经冷冻干燥后得到的。
所述保护剂按照1.0×108-1.0×1012cfu/L菌体的量加入所述双歧杆菌菌体中并混合均匀。
所述冷冻干燥是将添加了保护剂套剂后的双歧杆菌菌体冻结后，依次进行下述三个步骤的进行干燥：1)在-20-30℃，真空度为10-30Pa，升华干燥4-48小时；2)加热使双歧杆菌菌体温度为-10℃-50℃，真空度为10-30Pa，干燥2-24小时；3)在真空为10Pa以下，温度为26-29℃，干燥2-24小时。
所述冷冻干燥的步骤1)中的干燥温度优选为-5℃，干燥时间优选为12小时；步骤2)中的干燥温度优选为26℃-28℃，干燥时间优选为4小时；步骤3)中的干燥温度优选为28℃，干燥时间优选为4小时。
所述双歧杆菌菌体是用改良BS培养基或改良TPY培养基在温度33-40℃，压力为0.05MPa～0.08MPa，厌氧发酵双歧杆菌菌株6-24小时后，收集菌体得到的；
所述改良BS培养基是由下述组分制成：西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温801g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g；
所述复合盐溶液为含有K2HPO4 1.0g，CaCl2 0.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g的溶液；
所述改良TPY培养基是由下述组分制成：胰蛋白胨12g/L，示胨3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，麦芽低聚糖5g/L，酵母浸出粉5g/L，吐温-801.0g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L，牛肝浸液200mL/L，西红柿汁100mL/L，混合盐溶液5mL/L，蒸馏水675mL/L，维生素B1 10mg/L，维生素B6 10mg/L，维生素B12 0.1mg/L；
所述混合盐溶液为1L中含有K2HPO4 20.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O 2.5g，CaCl2 1.5g，FeCl3 0.5g。
所述双歧杆菌菌株的发酵温度优选为37℃。
实验表明，本发明的双歧杆菌活菌制剂在常温下保存24个月活菌数仍保持在较高的水平，并且在温度较高(37℃)的环境下，可以保持较长时间(10个月以上)有效。本发明的方法简便、易操做，适合大批量制备所有株型的双歧杆菌制剂，解决了用常规方法生产的双歧杆菌制品常温保存困难的问题，具有很高的应用价值。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、双歧杆菌活菌制剂的制备及其保存时间测试
一、双歧杆菌活菌制剂的制备
1、双歧杆菌菌种活化
将菌种青春双歧杆菌DM8504(购自大连医学院)接种于改良BS琼脂斜面培养基上。然后在放进厌氧培养箱中，在37±0.5℃的温度下厌氧培养48-72hr。
改良BS培养基的组分：西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温80 1g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g(配制固体培养基用时使用)。其中复合盐溶液的组分为：K2HPO4 1.0g，CaCl2 0.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g。
上述改良BS培养基配制方法为：称取大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、胰酶解酪沅、牛肉膏、可溶性淀粉放入烧杯中，加入配制总量100～200的纯化水，用药勺搅匀，置于电炉上加热，边加热边搅拌至溶解，把烧杯从电炉上取下，称取L-半胱氨酸盐酸盐，趁热加入烧杯中，搅拌至溶解。加入西红柿液、牛肝浸出液、复合盐溶液、吐温80混合。加纯化水定容至所需总体积1000ml。将pH调至7.0-7.2，高压蒸汽121℃灭菌20min。配置固体培养基时加入琼脂后在灭菌。
其中复合盐溶液的制备方法为：将CaCl2和MgSO4·7H2O在3ml蒸馏水中混合溶解，加500ml水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。搅拌至溶解，加入200ml蒸馏水，混合后储存于冰箱中。
2、双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
取上述已活化培养的斜面种子，将菌落洗脱，以无菌操作法加入改良BS液体培养基(培养基的成分与斜面相同)，37℃厌氧培养36小时，得到一级种子液。
2)二级种子液的培养
将一级种子液，接入改良BS液体培养基，接种量10％(体积比)，培养温度37℃，厌氧培养24小时，即为二级种子液。
3)发酵增殖培养
改良BS培养基经高压蒸汽121℃灭菌20min后，充入氮气并冷却至37℃后备用。将二级种子液，接入充入氮气并冷却的改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)， 发酵温度37±0.5℃，罐压为0.05MPa～0.08Mpa，厌氧发酵18小时发酵成熟(活菌数：1.0×107-1.0×1010cfu/L)。
3、双歧杆菌活菌制剂的制备
1)收集菌体
将步骤4得到发酵成熟后的发酵液通过管道导入离心机，在低温(2-10℃)的条件下，用大容量离心机离心，8000rpm，离心15分钟。收集离心筒中的泥状菌体。
2)添加保护剂
制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂的组成为：
含有质量百分含量为2.5％甘油溶液；含有质量百分含量为3.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；含有质量百分含量为3.0％药用聚乙二醇(PEG)的溶液；含有质量百分含量为8.0％脱脂奶粉的溶液；含有质量百分含量为5.0％海藻糖的溶液；含有质量百分含量为0.5％谷氨酸钠和质量百分含量为0.5％L-天冬氨酸的溶液；含有质量百分含量为0.5％维生素C钠(Vc-Na)的溶液；含有质量百分含量为3.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液；
将上述保护剂的各组分等体积混合，得到保护剂。
将收集的菌体，加入由上述保护剂均按照1.0×108菌体的量加入，搅拌混匀后，得到菌体悬浮液。
上述保护剂配制完成后，放置于2-8℃冰柜中冷却，备用。
3)冷冻干燥
将步骤2)得到的菌体悬浮液，过滤，将含菌体的分装到冻干盘中，进行冷冻干燥。
冷冻干燥时，制品在搁板温度为20℃时入箱，并冻结至-40℃以下，保持4小时，干箱真空度达到20Pa时，开始第一阶段干燥，加热使温度升为-5℃，干燥箱真空度控制在10-30Pa，进行升华干燥12小时。升华干燥结束后，开始第二阶段干燥，加热使温度升至28℃，至制品温度升至26℃以上，干燥箱真空度控制在10-30Pa，保温4小时。最后进入真空控制在10Pa以下，温度28℃，干燥4小时，得到青春双歧杆菌DM8504活菌菌粉。
4)包装
将步骤3)冷冻干燥后的双歧杆菌菌粉分装入铝膜袋中，进行抽真空包装。
二、双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测
将按照步骤一的方法制备青春双歧杆菌DM8504(购自大连医学院)活菌菌粉三个批次制剂B-1、B-2、B-3，分别分成两份，放置于37℃或25℃留样箱，37℃放置的样品每个月取样检测一次活菌数和活菌指数，25℃放置的菌粉每三个月取样检测一次活菌数和活菌指数，与常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉作为对照。常规冻干保护剂作为敷料的青春双歧杆菌DM8504(三个批次制剂A-1、A-2、A-3)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
活菌数检测方法：
1.充分振摇液体样品，吸取3ml液体样品于三角瓶中(或称取3.0克菌粉)，加入27ml稀释液，盖上胶塞，按充分振摇，即成1∶10供试液；
2.稀释：吸取9ml稀释液到三角瓶中，盖上胶塞。吸取1∶10的供试液1ml，到装有9ml稀释液的三角瓶里，振摇均匀，使成1∶100的稀释度，重复上述操作，作10倍系列稀释，直至所需的稀释度；
3.滴样：吸取所需测定的稀释度(一般是最后一稀释度)的菌液0.1ml滴于BS平板培养基，用玻璃棒涂布均匀，共做3个平皿；
4.培养：将涂布均匀的平板正放于厌氧培养箱中，37℃厌氧培养48小时；
5.菌落计数：培养后观察每个平皿菌落的生长情况并在平皿上点计菌落数，如有2个或2个以上菌落重叠在一起，应全部计数，注意平皿菌落数应在10-300个之间，否则应调整稀释级，重新测定，点计后，按公式计算活菌数，填写记录。
6.计算公式：
活菌指数＝lg(活菌数)
以《中国生物制品规程》2000版对双歧杆菌菌粉活菌数的规定(1g菌粉的活菌数应不低于1.0×109CFU)作为参照标准，符合这个规定即为有效。
25℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表1所示，结果表明，步骤一的方法制备的活菌菌粉制剂，在室温24个月后仍有效，活菌数均在450亿CFU/g以上，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉制剂，保藏6-9个月后菌剂就低于1.0×109CFU/g了，表明本发明的方法制备的活菌制剂在室温的条件下，比常规方法制备的活菌制剂具有更高的菌存活能力，有效期远比常规方法长。
37℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表2所示，结果表明，应用本发明活菌制品，37℃放置半年后仍高于1.0×109CFU/g，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉，保藏2个月后活菌数就低于1.0×109CFU/g，表明步骤一的方法制备的活菌制剂在室内温度较高的情况下，有效期远比常规方法长。
表1：本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉室温保藏情况比较
| 制剂批号 | 指标 | 保藏时间(月) | ||||||||
| 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | 24 | ||
| A-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 2045 | 167 | 7.6 | 0.7 | 0.03 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.31 | 10.22 | 8.88 | 7.85 | 6.48 | - | - | - | - | |
| A-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2851 | 236 | 34 | 2.4 | 0.35 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.45 | 10.37 | 9.53 | 8.38 | 7.54 | - | - | - | - | |
| A-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2619 | 187 | 37 | 1.9 | 0.44 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.42 | 10.27 | 9.57 | 8.28 | 7.64 | - | - | - | - | |
| B-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 1947 | 1427 | 876 | 788 | 763 | 624 | 586 | 515 | 467 |
| 活菌指数(lgN) | 11.29 | 11.15 | 10.94 | 10.90 | 10.88 | 10.80 | 10.77 | 10.71 | 10.67 | |
| B-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2856 | 1316 | 976 | 893 | 821 | 680 | 613 | 611 | 584 |
| 活菌指数(lgN) | 11.46 | 11.12 | 10.99 | 10.95 | 10.91 | 10.83 | 10.79 | 10.79 | 10.77 | |
| B-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2418 | 1524 | 1047 | 904 | 796 | 693 | 599 | 583 | 531 |
| 活菌指数(lgN) | 11.38 | 11.18 | 11.02 | 10.96 | 10.90 | 10.84 | 10.78 | 10.77 | 10.73 |
(表中“—”表示菌粉活菌数低于1.0×106CFU/g)。
表2：本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉37℃加速试验比较
| 制剂批号 | 指标 | 保藏时间(月) | ||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| A-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 2045 | 143 | 4.2 | 0.08 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.31 | 10.16 | 8.62 | 6.90 | - | - | - | - | - | - | - | |
| A-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2851 | 127 | 6.80 | 0.16 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.45 | 10.10 | 8.83 | 7.20 | - | - | - | - | - | - | - | |
| A-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2619 | 214 | 9.3 | 0.43 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.42 | 10.33 | 8.79 | 7.63 | - | - | - | - | - | - | - | |
| B-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 1947 | 1658 | 879 | 246 | 119 | 79 | 27 | 11 | 3.8 | 1.7 | 0.6 |
| 活菌指数(lgN) | 11.29 | 11.22 | 10.94 | 10.39 | 10.08 | 9.90 | 9.43 | 9.04 | 8.58 | 8.23 | 7.78 | |
| B-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2856 | 1071 | 753 | 368 | 134 | 63 | 34 | 15 | 5.5 | 2.1 | 0.9 |
| 活菌指数(lgN) | 11.46 | 11.03 | 10.88 | 10.57 | 10.13 | 9.80 | 9.53 | 9.18 | 8.74 | 8.32 | 7.95 | |
| B-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2418 | 1566 | 741 | 247 | 127 | 78 | 43 | 20 | 6.1 | 2.8 | 1.1 |
| 活菌指数(lgN) | 11.38 | 11.19 | 10.87 | 10.39 | 10.10 | 9.89 | 9.63 | 9.30 | 8.79 | 8.45 | 8.04 |
(表中“—”表示制品活菌数低于1.0×106CFU)。
实施例2、双歧杆菌活菌制剂的制备及其保存时间测试
一、双歧杆菌活菌制剂的制备
1、双歧杆菌菌种活化
将菌种婴儿双歧杆菌ATCC 15697(购自美国ATCC菌种保藏中心)接种于改良TPY培养基斜面培养基上。然后在放进厌氧培养箱中，在37±0.5℃的温度下厌氧培养48-72hr。
上述改良TPY培养基是由下述组分制成：胰蛋白胨12g/L，示胨3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，麦芽低聚糖5g/L，酵母浸出粉5g/L，吐温-801.0g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L，牛肝浸液200mL/L，西红柿汁100mL/L，混合盐溶液5mL/L，蒸馏水675mL/L，调pH至7.0-7.2，121℃，灭菌15-20分钟。
混合盐溶液：K2HPO4 20.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H20 2.5g，CaCl2 1.5g，FeCl3 0.5g。
上述培养基灭菌后，在使用之前，在无菌条件下加入维生素：维生素B1 10mg/L，维生素B6 10mg/L，维生素B12 0.1mg/L。
西红柿汁的制作：新鲜西红柿洗净后切块榨汁，然后按1∶1(质量比)加蒸馏水，隔水煮沸20分钟，补足蒸发损失量，经六层纱布过滤后(2次)，分装入点滴瓶中，以115℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
肝浸液的制作：新鲜牛肝剔去大的血管、筋腱和脂肪，经斩拌机斩碎，按1∶2(重量比)加入水浸泡，在2-8℃冰箱放置24小时，隔水煮沸2小时，补足蒸发损失量，经六层纱布过滤后(2次)，分装入点滴瓶中，以115-121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。
2、双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
取上述已活化培养的斜面种子，将菌落洗脱，以无菌操作法加入改良BS液体培养基(培养基的成分与斜面相同)，33.0℃厌氧培养24小时，得到一级种子液。
2)二级种子液的培养
将一级种子液，接入改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)，培养温度33.0℃，厌氧培养12小时，即为二级种子液。
3)发酵增殖培养
改良BS培养基经高压蒸汽121℃灭菌20min后，充入氮气并冷却至33℃后备用。将二级种子液，接入充入氮气并冷却的改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)，发酵温度37±0.5℃，罐压为0.05MPa～0.08Mpa，厌氧发酵24小时发酵成熟。
3、双歧杆菌活菌制剂的制备
制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂的组成为：
含有质量百分含量为0.01％甘油溶液；含有质量百分含量为6.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；含有质量百分含量为0.1％药用聚乙二醇(PEG)的溶液；含有质量百分含量为1.0％脱脂奶粉的溶液；含有质量百分含量为0.5％海藻糖的溶液；含有质量百分含量为0.1％谷氨酸钠和质量百分含量为5.0％L-天冬氨酸的溶液；含有质量百分含量为0.1％维生素C钠(Vc-Na)的溶液；含有质量百分含量为0.1％鸟氨酸盐酸盐的溶液。
将上述保护剂的各组分等体积混合，得到保护剂。
将收集的菌体，加入由上述保护剂均按照1.0×1012cfu/L菌体的量加入，搅拌混匀后，得到菌体悬浮液。
上述保护剂配制完成后，放置于2-8℃冰柜中冷却。
3)冷冻干燥
将步骤2)得到的菌体悬浮液，过滤，将含菌体的滤液分装到冻干盘中，进行冷冻干燥。
冷冻干燥时，制品在搁板温度为30℃时入箱，并冻结至-40℃以下，保持4小时，干箱真空度达到10-30Pa时，开始第一阶段干燥，加热使温度升为-20℃，干燥箱真空度控制在20-25Pa，进行升华干燥4小时。升华干燥结束后，开始第二阶段干燥，加热使温度升至-10℃，至制品温度升至-10℃以上，干燥箱真空度控制在10-15Pa，保温2小时。最后进入真空控制在10Pa以下，温度28℃，干燥4小时，得到婴儿双歧杆菌ATCC 15697活菌菌粉。
4)包装
将步骤3)冷冻干燥后的双歧杆菌菌粉分装入铝膜袋中，进行抽真空包装。
二、双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测
将按照步骤一的方法制备婴儿双歧杆菌ATCC 15697(购自美国ATCC菌种保藏中心)活菌菌粉三个批次制剂B-1、B-2、B-3，分别分成两份，放置于37℃或25℃留样箱，37℃放置的样品每个月取样检测一次活菌数和活菌指数，25℃放置的菌粉每三个月取样检测一次活菌数和活菌指数，与常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉作为对照。常规冻干保护剂作为敷料的婴儿双歧杆菌ATCC 15697(三个批次制剂A-1、A-2、A-3)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
按照实施例1的方法进行活菌数和活菌指数的检测；
以《中国生物制品规程》2000版对双歧杆菌菌粉活菌数的规定(1g菌粉的活菌数应不低于1.0×109CFU)作为参照标准，符合这个规定即为有效。
25℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表3所示，结果表明，步骤一的方法制备的活菌菌粉制剂，在室温24个月后仍有效，活菌数均在505CFU/g以上，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉制剂，保藏12个月后菌剂就低于1.0×109CFU/g了，表明本发明的方法制备的活菌制剂在室温的条件下，比常规方法制备的活菌制剂具有更高的菌存活能力，有效期远比常规方法长。
37℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表4所示，结果表明，应用本发明活菌制品，37℃放置4后仍高于1.0×109CFU/g，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉，保藏4个月后活菌数就低于1.0×109CFU/g，表明步骤一的方法制备的活菌制剂在室内温度较高的情况下，有效期远比常规方法长。
表3：本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉室温保藏情况比较
| 制剂 | 指标 | 保藏时间(月) |
| 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | 24 | ||
| A-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 2001 | 179 | 6.6 | 0.7 | 0.03 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.31 | 10.22 | 8.88 | 7.85 | 6.48 | - | - | - | - | |
| A-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2851 | 236 | 34 | 2.4 | 0.35 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.45 | 10.37 | 9.53 | 8.38 | 7.54 | - | - | - | - | |
| A-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2544 | 187 | 38 | 1.7 | 0.55 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.42 | 10.27 | 9.57 | 8.28 | 7.64 | - | - | - | - | |
| B-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 1947 | 1427 | 876 | 788 | 763 | 624 | 586 | 515 | 507 |
| 活菌指数(lgN) | 11.29 | 11.15 | 10.94 | 10.90 | 10.88 | 10.80 | 10.77 | 10.71 | 10.71 | |
| B-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2711 | 1316 | 976 | 893 | 821 | 680 | 610 | 614 | 587 |
| 活菌指数(lgN) | 11.46 | 11.12 | 10.99 | 10.95 | 10.91 | 10.83 | 10.79 | 10.79 | 10.14 | |
| B-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2418 | 1524 | 1047 | 904 | 796 | 693 | 599 | 583 | 555 |
| 活菌指数(1gN) | 11.38 | 11.18 | 11.02 | 10.96 | 10.90 | 10.88 | 10.79 | 10.74 | 10.65 |
(表中“—”表示菌粉活菌数低于1.0×106CFU/g)。
表4：本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉37℃加速试验比较
| 制剂批号 | 指标 | 保藏时间(月) | ||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| A-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 2045 | 143 | 4.2 | 0.08 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.31 | 10.16 | 8.62 | 6.90 | - | - | - | - | - | - | - | |
| A-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2851 | 127 | 6.80 | 0.16 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.45 | 10.10 | 8.83 | 7.20 | - | - | - | - | - | - | - | |
| A-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2619 | 211 | 9.3 | 0.55 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.42 | 10.33 | 8.79 | 7.73 | - | - | - | - | - | - | - | |
| B-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 1947 | 1658 | 879 | 246 | 119 | 77 | 27 | 17 | 3.8 | 1.0 | 0.6 |
| 活菌指数(lgN) | 11.29 | 11.22 | 10.94 | 10.39 | 10.08 | 9.10 | 9.04 | 9.04 | 8.50 | 8.03 | 7.08 | |
| B-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2856 | 1006 | 778 | 347 | 134 | 63 | 34 | 17 | 5.8 | 2.7 | 0.5 |
| 活菌指数(lgN) | 11.46 | 11.03 | 10.88 | 10.57 | 10.13 | 9.60 | 9.53 | 9.18 | 8.74 | 8.32 | 7.95 | |
| B-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2418 | 1566 | 741 | 247 | 127 | 78 | 47 | 22 | 8.4 | 3.8 | 2.0 |
| 活菌指数(lgN) | 11.38 | 11.19 | 10.87 | 10.39 | 10.10 | 9.89 | 9.61 | 9.34 | 8.89 | 8.45 | 7.88 |
(表中“—”表示制品活菌数低于1.0×106CFU)。
实施例3、双歧杆菌活菌制剂的制备及其保存时间测试
一、双歧杆菌活菌制剂的制备
1、双歧杆菌菌种活化
将菌种青春型双歧杆菌CGMCC 1.2190(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)接种于改良BS琼脂斜面培养基上。然后在放进厌氧培养箱中，在37±0.5℃的温度下厌氧培养48-72hr。
改良BS培养基的组分：西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温80 1g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g(配制固体培养基用时使用)。其中复合盐溶液的组分为：K2HPO4 1.0g，CaCl2 0.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO4 1.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g。
上述改良BS培养基配制方法为：称取大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、胰酶解酪沅、牛肉膏、可溶性淀粉放入烧杯中，加入配制总量100～200的纯化水，用药勺搅匀，置于电炉上加热，边加热边搅拌至溶解，把烧杯从电炉上取下，称取L-半胱氨酸盐酸盐，趁热加入烧杯中，搅拌至溶解。加入西红柿液、牛肝浸出液、复合盐溶液、吐温80混合。加纯化水定容至所需总体积1000ml。将pH调至7.0-7.2，高压蒸汽121℃灭菌20min。配置固体培养基时加入琼脂后在灭菌。
其中复合盐溶液的制备方法为：将CaCl2和MgSO4·7H2O在3ml蒸馏水中混合溶解，加500ml水，一边搅拌一边缓慢加入其它盐类。搅拌至溶解，加入200ml蒸馏水，混合后储存于冰箱中。
2、双歧杆菌的发酵培养
1)一级种子液的培养
取上述已活化培养的斜面种子，将菌落洗脱，以无菌操作法加入改良BS液体培养基(培养基的成分与斜面相同)，40.0℃厌氧培养48小时，得到一级种子液。
2)二级种子液的培养
将一级种子液，接入改良BS液体培养基，接种量1％(体积比)，培养温度38.0℃，厌氧培养48小时，即为二级种子液。
3)发酵增殖培养
改良BS培养基经高压蒸汽121℃灭菌20min后，充入氮气并冷却至40℃后备用。将二级种子液，接入充入氮气并冷却的改良BS液体培养基，接种量15％(体积比)，发酵温度37±0.5℃，罐压为0.05MPa～0.08Mpa，厌氧发酵6小时发酵成熟。
3、双歧杆菌活菌制剂的制备
1)收集菌体
将步骤4得到发酵成熟后的发酵液通过管道导入离心机，在低温(2-10℃)的条件下，10℃，14000RPM连续流离心15-20分钟。收集离心筒中的泥状菌体。
2)添加保护剂
制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂的组成为：
含有质量百分含量为5.0％甘油；含有质量百分含量为6.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液；含有质量百分含量为5.0％药用聚乙二醇(PEG)的溶液；含有质量百分含量为10.0％脱脂奶粉的溶液；含有质量百分含量为15.0％海藻糖的溶液；含有质量百分含量为5.0％谷氨酸钠和质量百分含量为5.0％L-天冬氨酸的溶液；含有质量百分含量为5.0％维生素C钠(Vc-Na)的溶液；含有质量百分含量为5.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液；
将上述保护剂的各组分等体积混合，得到保护剂。
将收集的菌体，加入由上述保护剂均按照1.0×1010菌体的量加入，搅拌混匀后，得到菌体悬浮液。
上述保护剂配制完成后，放置于2-8℃冰柜中冷却，备用。
3)冷冻干燥
将步骤2)得到的菌体悬浮液，过滤，将含菌体的滤液分装到冻干盘中，进行冷冻干燥。
冷冻干燥时，制品在搁板温度为20℃时入箱，并冻结至-40℃以下，保持4小时，干箱真空度达到20Pa时，开始第一阶段干燥，加热使温度升为30℃，干燥箱真空度控制在10-30Pa，进行升华干燥48小时。升华干燥结束后，开始第二阶段干燥，加热使温度升至50℃，至制品温度升至48℃以上，干燥箱真空度控制在10-30Pa，保温24小时。最后进入真空控制在10Pa以下，温度28℃，干燥24小时，得到青春型双歧杆菌CGMCC 1.2190活菌菌粉。
4)包装
将步骤3)冷冻干燥后的双歧杆菌菌粉分装入铝膜袋中，进行抽真空包装。
二、双歧杆菌活菌制剂的稳定性检测
将按照步骤一的方法制备青春型双歧杆菌CGMCC 1.2190(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)活菌菌粉三个批次制剂B-1、B-2、B-3，分别分成两份，放置于37℃或25℃留样箱，37℃放置的样品每个月取样检测一次活菌数和活菌指数，25℃放置的菌粉每三个月取样检测一次活菌数和活菌指数，与常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉作为对照。常规冻干保护剂作为敷料的青春型双歧杆菌CGMCC1.2190(三个批次制剂A-1、A-2、A-3)(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)活菌制剂。
按照实施例1的方法进行活菌数和活菌指数的检测；
以《中国生物制品规程》2000版对双歧杆菌菌粉活菌数的规定(lg菌粉的活菌数应不低于1.0×109CFU)作为参照标准，符合这个规定即为有效。
25℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表5所示，结果表明，步骤一的方法制备的活菌菌粉制剂，在室温24个月后仍有效，活菌数均在511CFU/g以上，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉制剂，保藏12个月后菌剂就低于1.0×109CFU/g了，表明本发明的方法制备的活菌制剂在室温的条件下，比常规方法制备的活菌制剂具有更高的菌存活能力，有效期远比常规方法长。
37℃放置的菌粉制剂的活菌数和活菌指数的检测结果如表6所示，结果表明，应用本发明活菌制品，37℃放置4个月后仍高于1.0×109CFU/g，而以常规冻干保护剂作为敷料制备的菌粉，保藏2个月后活菌数就低于1.0×109CFU/g，表明步骤一的方法制备的活菌制剂在室内温度较高的情况下，有效期远比常规方法长。
表5：本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉25℃加速试验比较
| 制剂批号 | 指标 | 保藏时间(月) | ||||||||
| 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 | 18 | 21 | 24 | ||
| A-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 2001 | 179 | 6.5 | 0.6 | 0.05 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.41 | 10.45 | 8.54 | 7.85 | 6.48 | - | - | - | - | |
| A-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2401 | 236 | 34 | 2.4 | 0.35 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.45 | 10.57 | 9.43 | 8.38 | 7.84 | - | - | - | - | |
| A-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2544 | 187 | 35 | 1.7 | 0.55 | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.42 | 10.27 | 9.57 | 8.28 | 7.64 | - | - | - | - | |
| B-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 1947 | 1427 | 856 | 758 | 763 | 624 | 586 | 515 | 511 |
| 活菌指数(lgN) | 11.20 | 11.15 | 10.94 | 10.90 | 10.58 | 10.50 | 10.50 | 10.44 | 10.44 | |
| B-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2701 | 1310 | 976 | 893 | 821 | 680 | 660 | 654 | 545 |
| 活菌指数(lgN) | 11.40 | 11.12 | 10.99 | 10.95 | 10.91 | 10.83 | 10.79 | 10.79 | 10.14 | |
| B-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2410 | 1520 | 1047 | 904 | 796 | 693 | 599 | 583 | 555 |
| 活菌指数(lgN) | 11.38 | 11.18 | 11.02 | 10.90 | 10.90 | 10.88 | 10.79 | 10.74 | 10.65 |
(表中“—”表示菌粉活菌数低于1.0×106CFU/g)。
表6：本发明制备的菌粉与常规方法制备的菌粉37℃加速试验比较
| 制剂批号 | 指标 | 保藏时间(月) | ||||||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| A-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 2137 | 169 | 4.7 | 0.08 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.77 | 10.16 | 8.62 | 6.90 | - | - | - | - | - | - | - | |
| A-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2051 | 127 | 6.80 | 0.16 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.40 | 10.10 | 8.43 | 7.20 | - | - | - | - | - | - | - | |
| A-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2619 | 211 | 9.3 | 0.47 | - | - | - | - | - | - | - |
| 活菌指数(lgN) | 11.40 | 10.33 | 8.79 | 7.43 | - | - | - | - | - | - | - | |
| B-1 | 活菌数(亿CFU/g) | 1947 | 1458 | 879 | 200 | 119 | 70 | 27 | 13 | 3.3 | 1.4 | 0.4 |
| 活菌指数(lgN) | 11.40 | 11.22 | 10.94 | 10.39 | 10.01 | 9.10 | 9.04 | 9.04 | 8.41 | 8.00 | 7.58 | |
| B-2 | 活菌数(亿CFU/g) | 2456 | 1406 | 774 | 347 | 134 | 63 | 34 | 17 | 5.8 | 2.7 | 0.5 |
| 活菌指数(lgN) | 11.46 | 11.03 | 10.88 | 10.57 | 10.14 | 9.60 | 9.53 | 9.18 | 8.74 | 8.32 | 7.95 | |
| B-3 | 活菌数(亿CFU/g) | 2418 | 1546 | 741 | 240 | 120 | 70 | 47 | 24 | 7.6 | 3.2 | 1.0 |
| 活菌指数(lgN) | 11.38 | 11.19 | 10.47 | 10.39 | 10.10 | 9.49 | 9.60 | 9.30 | 8.80 | 8.40 | 7.80 | |
(表中“—”表示制品活菌数低于1.0×106CFU)。
Claims (10)
1、一种用于制备双歧杆菌活菌制剂的保护剂，由下述重量份的组分组成：甘油0.01-5.0份；聚乙烯吡咯烷酮0.1-6.0份；聚乙二醇0.1-5.0份；脱脂奶粉1.0-10.0份；海藻糖0.5-15.0份；谷氨酸钠0.1-5.0份，L-天冬氨酸0.1-5.0份；维生素C钠0.1-5.0份；鸟氨酸盐酸盐0.1-5.0份。
2、根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于：所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂，由下述重量份的组分组成：甘油2.5份；聚乙烯吡咯烷酮3.0份；聚乙二醇3.0份；脱脂奶粉8.0份；海藻糖5.0份；谷氨酸钠0.5份，L-天冬氨酸0.5份；维生素C钠0.5份；鸟氨酸盐酸盐3.0份。
3、根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于：所述双歧杆菌活菌制剂的保护剂的各组分以溶液形式存在，所述甘油溶液为含有质量百分含量为0.01-5.0％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为含有质量百分含量为0.1-6.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液为含有质量百分含量为0.1-5.0％聚乙二醇的溶液；所述脱脂奶粉溶液为含有质量百分含量为1.0-10.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液为含有质量百分含量为0.5％-15.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％谷氨酸钠和质量百分含量为0.1％-5.0％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液为含有质量百分含量为0.1％-5.0％鸟氨酸盐酸盐的溶液。
4、根据权利要求3所述的保护剂，其特征在于：所述甘油溶液为含有质量百分含量为2.5％甘油溶液；所述聚乙烯吡咯烷酮溶液为含有质量百分含量为3.0％聚乙烯吡咯烷酮溶液；所述聚乙二醇溶液为含有质量百分含量为3.0％聚乙二醇溶液；所述脱脂奶粉溶液为含有质量百分含量为8.0％脱脂奶粉溶液；所述海藻糖溶液为含有质量百分含量为5.0％海藻糖溶液；所述谷氨酸钠溶液或L-天冬氨酸溶液为含有质量百分含量为0.5％谷氨酸钠和质量百分含量为0.5％L-天冬氨酸的溶液；所述维生素C钠溶液为含有质量百分含量为0.5％维生素C钠的溶液；所述鸟氨酸盐酸盐溶液为含有质量百分含量为3.0％鸟氨酸盐酸盐溶液。
5、一种双歧杆菌活菌制剂，是在双歧杆菌菌体中加入权利要求1-4中任一所述的保护剂后，经冷冻干燥后得到的。
6、根据权利要求5所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于：所述保护剂按照1.0×108-1.0×1012cfu/L菌体的量加入所述双歧杆菌菌体中并混合均匀。
7、根据权利要求6所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于：所述冷冻干燥是将添加了保护剂套剂后的双歧杆菌菌体冻结后，依次进行下述三个步骤的进行干燥：1)在-20-30℃，真空度为10-30Pa，升华干燥4-48小时；2)加热使双歧杆菌菌体温度为-10℃-50℃，真空度为10-30Pa，干燥2-24小时；3)在真空为10Pa以下，温度为26-29℃，干燥2-24小时。
8、根据权利要求7所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于：所述冷冻干燥的步骤1)中的干燥温度为-5℃，干燥时间为12小时；步骤2)中的干燥温度为26℃-28℃，干燥时间为4小时；步骤3)中的干燥温度为28℃，干燥时间为4小时。
9、根据权利要求8所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于：所述双歧杆菌菌体是用改良BS培养基或改良TPY培养基在温度33-40℃，压力为0.05MPa～0.08MPa，厌氧发酵双歧杆菌菌株6-24小时后，收集菌体得到的；
所述改良BS培养基是由下述组分制成：西红柿汁200ml，大豆蛋白胨15g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，吐温80 1g，胰蛋白胨10g，牛肉膏0.3g，可溶性淀粉0.5g，牛肝浸出液5ml，复合盐溶液4.0ml，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g；
所述复合盐溶液为含有K2HPO4 1.0g，CaCl2 0.2g，MgSO4·7H2O 0.48g，KH2PO41.0g，NaHCO3 10.0g，NaCl 2.0g的溶液；
所述改良TPY培养基是由下述组分制成：胰蛋白胨12g/L，示胨3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，麦芽低聚糖5g/L，酵母浸出粉5g/L，吐温-801.0g/L，L-半胱氨酸盐酸0.5g/L，牛肝浸液200mL/L，西红柿汁100mL/L，混合盐溶液5mL/L，蒸馏水675mL/L，维生素B1 10mg/L，维生素B6 10mg/L，维生素B12 0.1mg/L；
所述混合盐溶液为1L中含有K2HPO4 20.0g，MgCl2·6H2O 5.0g，ZnSO4·7H2O 2.5g，CaCl2 1.5g，FeCl3 0.5g。
10、根据权利要求9所述的双歧杆菌活菌制剂，其特征在于：所述双歧杆菌菌株的发酵温度为37℃。
Priority Applications (1)
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