CN108559768A - 一种含mva和/或mep代谢途径的微生物的筛选方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法及应用，属于生物合成和发酵工程领域。上述筛选方法包括以下步骤：将微生物的孢子悬液接种于培养容器培养，得微生物的单菌落，于充有乙烯的混合气体的封闭环境下培育24‑48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。微生物包括导入了外源MVA和/或MEP代谢途径的基因工程菌，及天然含有上述代谢途径的微生物中的任意一种。混合气体包括乙烯和空气。此方法成本低廉、操作简便、显色明显，兼具筛选通量高、周期短的优势。将上述筛选方法用于优选产β‑胡萝卜素或产番茄红素的三孢布拉霉菌种，可使菌种在短时间内显色，利于对具有高通量类胡萝卜素代谢流的菌株进行识别，高效便捷。

Description

一种含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法及应用

技术领域

本发明涉及生物合成和发酵工程领域，且特别涉及一种含MVA代谢途径和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法及应用。

背景技术

类胡萝卜素是一种极具经济价值的天然色素，尤其是其中的β-胡萝卜素和番茄红素，由于其高度抗氧化，清除人体内自由基的特性，已作为功能性原料在食品，保健品中广泛使用。番茄红素已知的强抗氧化特性还可以用于预防癌症，进一步凸显了其医药价值和经济前景。

三孢布拉霉发酵法是目前唯一一个被大规模、产业化用于生物发酵优产类胡萝卜素的方法。该方法保证了类胡萝卜素天然来源的同时，还可以根据市场需要调整工艺，具体产出β-胡萝卜素或番茄红素，具有相当的灵活度，因而被生产企业所认可。因此，提高三孢布拉霉的发酵效率一直是类胡萝卜素发酵行业的目标。而优选出高产菌种正是最基础，持续时间最长的工作。

现有的三孢布拉霉菌种选育仍停留在传统的用三孢布拉霉的孢子悬液分离纯化出单菌落后，通过观察菌落形态，或产孢量来判断其发酵潜力进行初筛，再进行小规模摇瓶发酵验证产量。“类胡萝卜素高产菌株高效筛选及合成代谢调控研究”(华中科技大学博士学位论文)中用四红氮唑等液体指示剂进行菌落染色，根据颜色变化的深浅找出优势菌，再进行摇瓶验证。前者主观性较强，工作量较大；后者操作繁琐，中间环节较多，结果受指示剂影响较大。二者受工作量制约，无论是筛选量还是筛选速度都明显低效。

因此，需对现有的产类胡萝卜素的三孢布拉霉菌种的筛选方法进行改进。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法，该筛选方法成本低廉、操作简便、显色明显，兼具筛选通量高、周期短的优势。其中，MVA代谢途径代表甲羟戊酸途径，MEP代谢途径代表非甲羟戊酸途径。

本发明的另一目的在于提供一种上述筛选方法的应用，例如当微生物为三孢布拉霉菌种时，该菌种天然具有MVA代谢途径，上述筛选方法可用于优选产β-胡萝卜素或产番茄红素的三孢布拉霉菌种，以使三孢布拉霉在短时间内显色，利于对具有高通量类胡萝卜素代谢流的菌株进行识别，高效便捷。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法，包括以下步骤：

将微生物的孢子悬液接种于培养容器培养，得微生物的单菌落，于充有乙烯的混合气体的封闭环境下培育24-48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。

微生物包括导入了外源MVA和/或MEP代谢途径的基因工程菌，及天然含有MVA和/或MEP代谢途径的微生物中的任意一种。

混合气体包括乙烯和空气。

优选地，混合气体中含有0.1-2vt％的乙烯。

本发明还提出一种上述筛选方法的应用，当微生物为三孢布拉霉菌种时，其可用于优选产β-胡萝卜素或产番茄红素的三孢布拉霉菌种。

本发明较佳实施例提供的含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法及应用的有益效果是：

(1)筛选通量高，最复杂的操作仅为涂布平板，其工作量不受后续环节制约。

(2)筛选时间高度可控，可依据所有菌株自身的代谢基础调整气筛时长。

(3)筛选连续性好，无需按菌种个数计算工作批次。

(4)显色明显，起变色为自身代谢所为，不受外界变量，例如显色指示剂影响。方便直接观察代谢时的菌落形态，甚至直接挑取菌丝进行显微镜观察。

(5)所筛选的菌种易保存，因无其它接触性操作，可直接将经摇瓶验证后的变色单菌落转接斜面保存。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。所涉及质量百分比为wt％单位，体积百分比为vt％单位。

下面对本发明实施例的含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法及应用进行具体说明。

本发明实施例提供的含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法包括以下步骤：将微生物的孢子悬液接种于培养容器培养，得微生物的单菌落，于充有乙烯的混合气体的封闭环境下培育24-48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。

微生物包括导入了外源MVA和/或MEP代谢途径的基因工程菌，及天然含有MVA和/或MEP代谢途径的微生物中的任意一种。

混合气体包括乙烯和空气。

优选地，混合气体中含有0.1-2vt％的乙烯。

较佳地，以微生物为三孢布拉霉菌种为例，上述筛选方法尤其适用于优选产β-胡萝卜素和/或产番茄红素的三孢布拉霉菌种，筛选而得的三孢布拉霉菌种能得到较高产量的β-胡萝卜素和/或番茄红素，并且所得的菌种性状较为稳定。

具体地，筛选三孢布拉霉菌种的筛选方法可以包括以下步骤：将三孢布拉霉的孢子悬液接种于培养容器培养，得三孢布拉霉的单菌落，加入用于激活单菌落代谢的代谢激活剂，于充有乙烯的混合气体的封闭环境下培育24-48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落，即为优产类胡萝卜素的三孢布拉霉菌。

作为可选地，本发明实施例中的培养容器例如可以采用培养皿，将其灭菌后倒平板。平板中含有用于分离三孢布拉霉单菌落的分离培养基，分离培养基包括常规固体PDA培养基组分，此外，还包括脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物组分。于PDA培养基中加入脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物可起到限制单菌落生长速率的作用，避免多个单菌落生长较快而相互连接，确保所挑取单菌落的生物遗传性状一致。

优选地，上述脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物在整个分离培养基中的浓度为0.01-1wt％；更优地，脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物在整个分离培养基中的浓度为0.01-0.1wt％；最优地，脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物在整个分离培养基中的浓度为0.05wt％。

作为可选地，上述孢子悬液中的孢子为三孢布拉霉正菌的孢子或三孢布拉霉负菌的孢子。

具体地，孢子悬液的制备可包括以下步骤：将常规PDA培养基倒入试管中制成斜面，然后接种三孢布拉霉正菌或三孢布拉霉负菌，于26-30℃的条件下培养5-7天，经此条件下培养后的三孢布拉霉具有较佳的孢子量。于斜面加入无菌水，用灭菌后的接种器具将无菌水和孢子搅拌混匀，然后倒入含无菌水的锥形瓶中，打散孢子，得到孢子悬液。值得说明的是，上述孢子可根据实际需要进行诱变处理。

在孢子倒入锥形瓶前，对含有无菌水的锥形瓶进行灭菌处理，例如可以在121℃的条件下灭菌40min。较佳地，上述装有无菌水的锥形瓶还可以放置玻璃珠，以辅以外力作用便于充分分散孢子。

接种时，可将上述孢子悬液稀释100-1000倍，再接种于分离培养基中，接种优选采用涂布方式进行。

培养容器中长出三孢布拉霉单菌落后，将用于激活单菌落代谢的代谢激活剂加入培养容器中。作为可选地，代谢激活剂包括异性菌种液上清液、三孢酸或三孢酸的衍生物中的至少一种，优选为异性菌种液上清液。异性菌种液上清液中的异性菌为与孢子悬液中三孢布拉霉的性别相反的三孢布拉霉。

因三孢布拉霉具有正菌(+)和负菌(-)之分，不同性别的三孢布拉霉的生物特性不同。其中，三孢布拉霉正菌具有生物量增长较快的特点，三孢布拉霉负菌具有代谢能力强、单位时间内可以产更多类胡萝卜素的特点。实际类胡萝卜素生产中也需要正负菌结合后发酵，故，本发明实施例中用不同性别的三孢布拉霉相互筛选，易于得到相互适应性更好的菌种。此外，三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌有性结合后，可大量产生性激素三孢酸，该物质为类胡萝卜素代谢前体物质，可加大类胡萝卜素的代谢通量，益于显色，同时使用种液上清比单独提取三孢酸后添加操作更简便。

优选地，上述代谢激活剂与脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物的质量比为1-30：0.01-1；更优地，代谢激活剂与脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物的质量比为2-10：0.01-0.1；最优地，代谢激活剂与脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物的质量比为5：0.05。

具体地，当代谢激活剂包括异性菌种液上清液时，该异性菌种液上清液可经以下步骤得到：取三孢布拉霉的孢子接种于种子培养基，于26-30℃的条件下培养40-50h，得异性菌种液，然后取异性菌种液的上清液即可。较佳地，培养可于28℃的条件下培养48h。优选地，培养过程还可伴有振荡，如在200-240rpm，优选220rpm的振荡条件下进行。

作为可选地，上述种子培养基例如可以包括1-3wt％的葡萄糖、2-4wt％的玉米浆干粉、0.5-1.5wt％的酵母浸膏、0.04-0.1wt％的磷酸二氢钾、0.005-0.015wt％的硫酸镁、0.02-0.04wt％的谷氨酸钠以及2-4wt％的豆毛油。

进一步地，上述种子培养基可包括2wt％的葡萄糖、3wt％的玉米浆干粉、1wt％的酵母浸膏、0.07wt％的磷酸二氢钾、0.01wt％的硫酸镁、0.03wt％的谷氨酸钠以及3wt％的豆毛油。

将加有代谢激活剂的三孢布拉霉的单菌落进行气筛，优选地，气筛所用气体为混合气体，混合气体包括乙烯和空气。其中，乙烯可用于刺激八氢番茄红素合成酶表达，从而可以大量合成八氢番茄红素。八氢番茄红素是三孢布拉霉的菌体合成β-胡萝卜素以及番茄红素的必备前提物质，因此，混合气体中含有乙烯可加速积累类胡萝卜素，达到更快显色的目的，缩短筛选时间。

较佳地，混合气体中含有0.1-2vt％的乙烯，该浓度范围下的乙烯浓度适中，不仅能够利于提高类胡萝卜素的产率，而且使用安全。

进一步地，本发明实施例的筛选过程中还加入有对类胡萝卜素的代谢具有阻断作用的阻断剂，阻断剂包括含N杂环类物质，优选为烟碱或咪唑。其中烟碱用于通入混合气体中，咪唑用于加入至培养容器。优选地，本发明实施例中的阻断剂采用通入混合气体中的烟碱。其原理在于：烟碱可以高效阻断番茄红素环化酶，使类胡萝卜素的代谢停留在合成番茄红素上，加之番茄红素显红色，与菌体原本的颜色(浅黄色)差异显著，因此便于观察，提高筛选的便捷性。

当阻断剂为烟碱时，混合气体可由空气与烟碱的水溶液混合，然后再与乙烯混合而得。较佳地，与空气混合前，预热烟碱的水溶液至38-42℃，便于烟碱随水汽挥发。

作为可选地，气筛过程的封闭环境可由密封培养箱提供。与现有的培养箱不同的是，本发明实施例中的密封培养箱安装有进气阀、出气阀以及乙烯检测设备。其中，进气阀和出气阀用于控制气体的进出流量，乙烯检测设备用于检查环境中乙烯的浓度，确保乙烯浓度在爆炸极限以下，避免安全隐患。优选地，进气阀的入口端还接有气体过滤器，以过滤乙烯、烟碱和空气中的杂质或其它微生物。出气阀的出口端还接有酸性溶液，用于中和混合气中的残余的烟碱。

优选地，本发明实施例中气筛的封闭环境所具有的压力为0.02-0.05MPa，相对湿度为30-80％，温度为24-30℃。值得说明的是，气筛前，需对密封培养箱进行杀菌处理，如用紫外灯灭菌30min。

综上，本发明实施例在制备孢子悬液后，涂布分离平板，所涂平板可一次性进行混合气体筛选，数百平板，上万单菌落进行一次性筛选，结果可受变色时间及变色程度双重筛选。例如若24h时发现已有数十单菌落变色，且颜色相近，则将该数十单菌落转接分离平板继续混合气筛选，8h后即观察最先变色者相对为代谢型菌株。

进一步地，在筛选出呈橘黄或红色的菌落后，还可对上述菌落进行摇瓶发酵培养，以验证筛选而得的菌落是否能够高产类胡萝卜素。

具体地，摇瓶发酵培养可以按以下步骤进行：挑取部分筛选而得的单菌落，接种于种子培养基中，于26-30℃、200-240rpm的条件下培养48-60h。相对应所选单菌落，接异性菌入种子培养基，于26-30℃、200-240rpm的条件下培养48-60h。然后按照三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌的重量比为1：3-15(优选为1：5)接入发酵瓶中，例如可将总计6mL的三孢布拉霉正菌与三孢布拉霉负菌接入至装液量20vt％的250mL发酵瓶中，然后于26-30℃、200-240rpm的条件下培养24h，添加代谢激活剂，继续培养至36h，根据需要添加阻断剂。

下摇瓶后，用紫外分光光度计或高效液相色谱对发酵液中β-胡萝卜素或番茄红素的含量进行测定，具体地，当测定物质为β-胡萝卜素时，采用紫外分光光度计于454nm进行测定；当测定物质为番茄红素时，采用高效液相色谱于472nm进行测定。所测数据如有±5％以上的变化率，则可视为变量带来的显著差异，否则仅视为系统误差。

作为可选地，上述发酵过程中的发酵培养基例如可以含有1-3wt％的葡萄糖、0.8-1.2wt％的淀粉、1-2wt％的酵母浸膏、1-3wt％的玉米浆干粉、1-3wt％的豆毛油、0.05-0.15wt％的磷酸二氢钾。较佳地，上述发酵培养基含有2wt％的葡萄糖、1wt％的淀粉、1.5wt％的酵母浸膏、2wt％的玉米浆干粉、2wt％的豆毛油、0.1wt％的磷酸二氢钾。发酵培养基的初始pH优选为7.0。

值得说明的是，其它属于本发明方案保护范围内的导入了外源MVA和/或MEP代谢途径的基因工程菌以及天然含有MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法可直接参照上述产β-胡萝卜素或产番茄红素的三孢布拉霉菌种的筛选方法进行相应调整。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

将常规PDA培养基倒入试管制成斜面，接种三孢布拉霉正菌，于26℃的条件下培养7天，然后加入无菌水，混合后倒入于121℃的条件下灭菌40min的含无菌水的锥形瓶(含玻璃珠)中，打散孢子，得到孢子悬液。

将上述孢子悬液稀释100倍后，涂布于含分离培养基的平板培养至长出三孢布拉霉的单菌落。其中，分离培养基包括常规固体PDA培养基以及浓度为0.01wt％的脱氧胆酸钠。

取三孢布拉霉负菌的孢子接种于种子培养基，然后于26℃、200rpm的条件下培养50h，得到异性菌种液。种子培养基含有1wt％的葡萄糖、2wt％的玉米浆干粉、0.5wt％的酵母浸膏、0.04wt％的磷酸二氢钾、0.005wt％的硫酸镁、0.02wt％的谷氨酸钠以及2wt％的豆毛油。

取异性菌种液的上清液滴加于单菌落，异性菌种液的上清液与脱氧胆酸钠的质量比为1：0.01，于充有混合气体(经过滤)的封闭环境下培育24h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。其中，混合气体包括0.1vt％的乙烯以及99.9vt％的空气，封闭环境所具有的压力为0.02MPa，湿度为30％，温度为24℃。

实施例2

将常规PDA培养基倒入试管制成斜面，接种三孢布拉霉负菌，于30℃的条件下培养5天，然后加入无菌水，混合后倒入于121℃的条件下灭菌40min的含无菌水的锥形瓶(含玻璃珠)中，打散孢子，得到孢子悬液。

将上述孢子悬液稀释1000倍后，涂布于含分离培养基的平板培养至长出三孢布拉霉的单菌落。其中，分离培养基包括常规固体PDA培养基以及浓度为1wt％的脱氧胆酸钠的衍生物。

取三孢布拉霉正菌的孢子接种于种子培养基，然后于30℃、240rpm的条件下培养40h，得到异性菌种液。种子培养基含有3wt％的葡萄糖、4wt％的玉米浆干粉、1.5wt％的酵母浸膏、0.1wt％的磷酸二氢钾、0.015wt％的硫酸镁、0.04wt％的谷氨酸钠以及4wt％的豆毛油。

取异性菌种液的上清液滴加于单菌落，异性菌种液的上清液与脱氧胆酸钠的衍生物的质量比为30：1，于充有混合气体(经过滤)的封闭环境下培育48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。其中，混合气体包括2vt％的乙烯以及98vt％的烟碱与空气的混合气，封闭环境所具有的压力为0.05MPa，湿度为80％，温度为30℃。

然后对筛选而得的菌落进行摇瓶发酵培养，采用紫外分光光度计于454nm测定发酵液中β-胡萝卜素的含量，或采用高效液相色谱于472nm测定发酵液中番茄红素的含量，验证筛选而得的菌落是否能够高产类胡萝卜素。

实施例3

将常规PDA培养基倒入试管制成斜面，接种三孢布拉霉正菌，于28℃的条件下培养6天，然后加入无菌水，混合后倒入于121℃的条件下灭菌40min的含无菌水的锥形瓶(含玻璃珠)中，打散孢子，得到孢子悬液。

将上述孢子悬液稀释1000倍后，涂布于含分离培养基的平板培养至长出三孢布拉霉的单菌落。其中，分离培养基包括常规固体PDA培养基以及浓度为0.01wt％的脱氧胆酸钠。

取三孢布拉霉负菌的孢子接种于种子培养基，然后于28℃、220rpm的条件下培养48h，得到异性菌种液。种子培养基含有2wt％的葡萄糖、3wt％的玉米浆干粉、1wt％的酵母浸膏、0.07wt％的磷酸二氢钾、0.01wt％的硫酸镁、0.03wt％的谷氨酸钠以及3wt％的豆毛油。

取异性菌种液的上清液滴加于单菌落并于单菌落的培养基中加入咪唑，异性菌种液的上清液与脱氧胆酸钠的质量比为2：0.01，于充有混合气体(经过滤)的封闭环境下培育36h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。其中，混合气体包括1vt％的乙烯以及99vt％空气。封闭环境所具有的压力为0.03MPa，湿度为55％，温度为26℃。

然后对筛选而得的菌落进行摇瓶发酵培养，采用紫外分光光度计于454nm测定发酵液中β-胡萝卜素的含量，或采用高效液相色谱于472nm测定发酵液中番茄红素的含量，验证筛选而得的菌落是否能够高产类胡萝卜素。

实施例4

将常规PDA培养基倒入试管制成斜面，接种三孢布拉霉正菌，于28℃的条件下培养6天，然后加入无菌水，混合后倒入于121℃的条件下灭菌40min的含无菌水的锥形瓶(含玻璃珠)中，打散孢子，得到孢子悬液。

将上述孢子悬液稀释100倍后，涂布于含分离培养基的平板培养至长出三孢布拉霉的单菌落。其中，分离培养基包括常规固体PDA培养基以及浓度为0.1wt％的脱氧胆酸钠的衍生物。

取三孢布拉霉负菌的孢子接种于种子培养基，然后于28℃、220rpm的条件下培养45h，得到异性菌种液。种子培养基含有2wt％的葡萄糖、3wt％的玉米浆干粉、1wt％的酵母浸膏、0.07wt％的磷酸二氢钾、0.01wt％的硫酸镁、0.03wt％的谷氨酸钠以及3wt％的豆毛油。

取异性菌种液的上清液滴加于单菌落，异性菌种液的上清液与脱氧胆酸钠的衍生物的质量比为10：0.1，于充有混合气体(经过滤)的封闭环境下培育36h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。其中，混合气体包括1vt％的乙烯以及99vt％的烟碱(水溶液)与空气的混合气，封闭环境所具有的压力为0.04MPa，湿度为60％，温度为28℃。

然后对筛选而得的菌落进行摇瓶发酵培养，采用紫外分光光度计于454nm测定发酵液中β-胡萝卜素的含量，或采用高效液相色谱于472nm测定发酵液中番茄红素的含量，验证筛选而得的菌落是否能够高产类胡萝卜素。

实施例5

将常规PDA培养基倒入试管制成斜面，接种三孢布拉霉正菌，于28℃的条件下培养6天，然后加入无菌水，混合后倒入于121℃的条件下灭菌40min的含无菌水的锥形瓶(含玻璃珠)中，打散孢子，得到孢子悬液。

将上述孢子悬液稀释1000倍后，涂布于含分离培养基的平板培养至长出三孢布拉霉的单菌落。其中，分离培养基包括常规固体PDA培养基以及浓度为0.05wt％的脱氧胆酸钠。

取三孢布拉霉负菌的孢子接种于种子培养基，然后于28℃、220rpm的条件下培养48h，得到异性菌种液。种子培养基含有2wt％的葡萄糖、3wt％的玉米浆干粉、1wt％的酵母浸膏、0.07wt％的磷酸二氢钾、0.01wt％的硫酸镁、0.03wt％的谷氨酸钠以及3wt％的豆毛油。

取异性菌种液的上清液滴加于单菌落，异性菌种液的上清液与脱氧胆酸钠的衍生物的质量比为5：0.05，于充有混合气体(经过滤)的封闭环境下培育48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落。其中，混合气体包括0.5vt％的乙烯以及99.5vt％的烟碱(水溶液)与空气的混合气，封闭环境所具有的压力为0.04MPa，湿度为60％，温度为28℃。

然后对筛选而得的菌落进行摇瓶发酵培养，采用紫外分光光度计于454nm测定发酵液中β-胡萝卜素的含量，或采用高效液相色谱于472nm测定发酵液中番茄红素的含量，验证筛选而得的菌落是否能够高产类胡萝卜素。

实施例6

本实施例与实施例5的唯一区别在于，本实施例中的代谢激活剂为三孢酸。

实施例7

本实施例与实施例5的唯一区别在于，本实施例中的代谢激活剂为三孢酸的衍生物。

实施例8

本实施例与实施例5的唯一区别在于，本实施例中的代谢激活剂为异性菌种液上清液与三孢酸的混合物。

实施例9

本实施例与实施例5的唯一区别在于，本实施例中的代谢激活剂为异性菌种液上清液与三孢酸的衍生物的混合物。

实施例10

本实施例与实施例5的唯一区别在于，本实施例中的代谢激活剂为异性菌种液上清液、三孢酸以及三孢酸的衍生物的混合物。

试验例1

筛选产β-胡萝卜素的三孢布拉霉菌正菌(试验组)，选生长正常三孢布拉霉菌(+)制备孢子悬液，涂布分离平板后28℃恒温培养5天，再气筛24h。挑出最先变色呈微粉色的5个单菌落，然后进行摇瓶发酵验证。设置对照组，对照组为筛前起始三孢布拉霉(+)/(-)斜面进行摇瓶发酵。比较试验组与对照组的三孢布拉霉菌的β-胡萝卜素的产量，结果如表1所示。

表1β-胡萝卜素产量(g/L)

试验例2

筛选产番茄红素的三孢布拉霉菌正菌(试验组)，选生长正常三孢布拉霉菌(+)制备孢子悬液，涂布分离平板后28℃恒温培养7天，再气筛48h。挑出最先变色呈淡红色的5个单菌落，然后进行摇瓶发酵验证，摇瓶培养36h加入2wt‰的咪唑作为阻断剂。设置对照组，对照组为筛前起始三孢布拉霉(+)/(-)斜面进行摇瓶发酵。比较试验组与对照组的三孢布拉霉菌的番茄红素的产量，结果如表2所示。

表2番茄红素产量(g/L)

试验例3

筛选产β-胡萝卜素的三孢布拉霉菌负菌(试验组)，选生长正常三孢布拉霉菌(-)制备孢子悬液，涂布分离平板后28℃恒温培养6天，再气筛36h。挑出最先变色呈微粉色的5个单菌落，然后进行摇瓶发酵验证。设置对照组，对照组为筛前起始三孢布拉霉(+)/(-)斜面进行摇瓶发酵。比较试验组与对照组的三孢布拉霉菌的β-胡萝卜素的产量，结果如表3所示。

表3β-胡萝卜素产量(g/L)

试验例4

筛选产番茄红素的三孢布拉霉菌负菌(试验组)，选生长正常三孢布拉霉菌(-)制备孢子悬液，涂布分离平板后28℃恒温培养6天，再气筛42h。挑出最先变色呈淡红色的5个单菌落，然后进行摇瓶发酵验证，摇瓶培养36h加入2wt‰的咪唑作为阻断剂。设置对照组，对照组为筛前起始三孢布拉霉(+)/(-)斜面进行摇瓶发酵。比较试验组与对照组的三孢布拉霉菌的番茄红素的产量，结果如表4所示。

表4番茄红素产量(g/L)

试验例5

同时筛选产β-胡萝卜素的三孢布拉霉菌(+)/(-)(试验组)，选生长正常三孢布拉霉菌(-)制备孢子悬液，涂布分离平板后28℃恒温培养6天，再气筛24h。挑出最先变色呈微粉色的5个单菌落，然后进行摇瓶发酵验证。设置对照组，对照组为筛前起始三孢布拉霉(+)/(-)斜面进行摇瓶发酵。比较试验组与对照组的三孢布拉霉菌的β-胡萝卜素的产量，结果如表5所示。

表5β-胡萝卜素产量(g/L)

组别	对照组	1	2	3	4	5	6
								(+)	起始菌株	筛1	筛1	筛1	筛5	筛5	筛5
(-)	起始菌株	筛2	筛2	筛2	筛4	筛4	筛4
								β-胡萝卜素产量	3.17	4.36	4.23	4.26	3.97	4.04	4.11

试验例6

同时筛选产番茄红素的三孢布拉霉菌(+)/(-)(试验组)，选生长正常三孢布拉霉菌(-)制备孢子悬液，涂布分离平板后28℃恒温培养6天，再气筛24h。挑出最先变色呈微粉色的5个单菌落，然后进行摇瓶发酵验证，摇瓶培养36h加入2wt‰的咪唑作为阻断剂。设置对照组，对照组为筛前起始三孢布拉霉(+)/(-)斜面进行摇瓶发酵。比较试验组与对照组的三孢布拉霉菌的番茄红素的产量，结果如表6所示。

表6番茄红素产量(g/L)

组别	对照组	1	2	3	4	5	6
								(+)	起始菌株	筛1	筛1	筛1	筛5	筛5	筛5
(-)	起始菌株	筛2	筛2	筛2	筛4	筛4	筛4
								番茄红素产量	2.68	3.84	3.77	3.90	3.84	3.72	3.55

由表1-6可以看出，与对照组相比，采用本发明筛选方法筛选而得的三孢布拉霉菌所产β-胡萝卜素及番茄红素的量均较对照组更高，说明本发明方案提供的优产类胡萝卜素的三孢布拉霉菌种的筛选方法有效且实用。

试验例7

分别用三孢布拉霉菌正菌和三孢布拉霉菌负菌各自所具有的同一单菌落转接单菌落平板，然后通入具有不同浓度的乙烯的混合气体，测试三孢布拉霉菌正菌(+)和三孢布拉霉菌负菌(-)的平均变色时间，其结果如表7所示。

表7平均变色时间(h)

乙烯浓度	0.1vt％	0.5vt％	1vt％	3vt％
					(+)平均变色时间	60	52	47	45
(-)平均变色时间	45	40	32	20

由表7可以看出，综合安全要求、使用成本及工作时间安排，乙烯在混合气中2vt％左右为宜。

试验例8

设置不同浓度的异性菌种液上清液以及不同浓度的脱氧胆酸钠，测定分离平板中所含的异性菌种液上清液与脱氧胆酸钠的最适含量及配比，测定结果以平均单菌落长出的时间和直径为判断依据，结果如表8和表9所示。

表8平均单菌落长出时间(h)

表9单菌落平均直径(mm)

其中，“/”表示未长出单菌落。

由表8和表9可以看出，分离平板中所含的异性菌种液上清液与脱氧胆酸钠的最适含量为5wt％和0.05wt％，也即异性菌种液上清液与脱氧胆酸钠的最适配比为1：0.01。

此外，经对导入了外源MVA和/或MEP代谢途径的基因工程菌以及天然含有上述代谢途径的微生物(法夫酵母、雨生红球藻等)按照本发明筛选方案进行筛选，其结果显示，能较现有的常规筛选方法提高筛选效率，降低工作量，筛选而得的菌株性状更优。

综上所述，本发明提供的含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法筛选通量高，最复杂的操作仅为涂布平板，其工作量不受后续环节制约；筛选时间高度可控，可依据所有菌株自身的代谢基础调整气筛时长；筛选连续性好，无需按菌种个数计算工作批次；显色明显，起变色为自身代谢所为，不受外界变量，例如显色指示剂影响。方便直接观察代谢时的菌落形态，甚至直接挑取菌丝进行显微镜观察；所筛选的菌种易保存，因无其它接触性操作，可直接将经摇瓶验证后的变色单菌落转接斜面保存。将上述筛选方法用于优选产β-胡萝卜素或产番茄红素的三孢布拉霉菌种，可使菌种在短时间内显色，利于对具有高通量类胡萝卜素代谢流的菌株进行识别，高效便捷。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种含MVA和/或MEP代谢途径的微生物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述微生物的孢子悬液接种于培养容器培养，得所述微生物的单菌落，于充有乙烯的混合气体的封闭环境下培育24-48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落；

所述微生物包括导入了外源MVA和/或MEP代谢途径的基因工程菌，及天然含有MVA和/或MEP代谢途径的微生物中的任意一种；

所述混合气体包括乙烯和空气；

优选地，所述混合气体中含有0.1-2vt％的所述乙烯。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述微生物为三孢布拉霉菌种，所述筛选方法包括以下步骤：将三孢布拉霉的孢子悬液接种于培养容器培养，得三孢布拉霉的单菌落，加入用于激活所述单菌落代谢的代谢激活剂，于充有所述乙烯的所述混合气体的封闭环境下培育24-48h，筛选出呈橘黄或红色的菌落；

所述孢子悬液中的孢子为三孢布拉霉正菌的孢子或三孢布拉霉负菌的孢子。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，筛选过程中还加入有对类胡萝卜素的代谢具有阻断作用的阻断剂，所述阻断剂为含N杂环类物质；

优选地，所述阻断剂包括用于加入至所述培养容器中的咪唑或用于通入所述混合气体中的烟碱。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述混合气体由所述空气与所述烟碱的水溶液混合后再与所述乙烯混合而得；

优选地，与所述空气混合前，预热所述烟碱的水溶液至38-42℃。

5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述培养容器中含有用于分离三孢布拉霉的单菌落的分离培养基，所述分离培养基包括脱氧胆酸钠或脱氧胆酸钠的衍生物，所述脱氧胆酸钠或所述脱氧胆酸钠的衍生物在所述分离培养基中的浓度为0.01-1wt％；

更优地，所述脱氧胆酸钠或所述脱氧胆酸钠的衍生物在所述分离培养基中的浓度为0.01-0.1wt％。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述代谢激活剂包括异性菌种液上清液、三孢酸或三孢酸的衍生物中的至少一种；

所述异性菌种液上清液中的异性菌为与所述孢子悬液中三孢布拉霉的性别相反的三孢布拉霉；

优选地，所述代谢激活剂占比1-30wt％时，所述脱氧胆酸钠或所述脱氧胆酸钠的衍生物占比为0.01-1％；

更优地，所述代谢激活剂占比2-10wt％时，所述脱氧胆酸钠或所述脱氧胆酸钠的衍生物占比为0.01-0.1％。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述代谢激活剂包括异性菌种液上清液，所述异性菌种液上清液经以下步骤得到：取三孢布拉霉的孢子接种于种子培养基，于26-30℃的条件下培养40-50h，得异性菌种液，然后取所述异性菌种液的上清液；

所述种子培养基包括1-3wt％的葡萄糖、2-4wt％的玉米浆干粉、0.5-1.5wt％的酵母浸膏、0.04-0.1wt％的磷酸二氢钾、0.005-0.015wt％的硫酸镁、0.02-0.04wt％的谷氨酸钠以及2-4wt％的豆毛油；

优选地，所述异性菌种液上清液是于转速为200-240rpm的条件下培养得到。

8.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述三孢布拉霉的单菌落是于26-30℃的条件下培养5-7天得到。

9.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述封闭环境的压力为0.02-0.05MPa和/或所述封闭环境的湿度为30-80％和/或所述封闭环境的温度为24-30℃。

10.如权利要求1-9任一项所述的筛选方法的应用，其特征在于，所述微生物为三孢布拉霉菌种，所述筛选方法用于优选产β-胡萝卜素或产番茄红素的所述三孢布拉霉菌种。