CN105349580A - 一种提高番茄红素产量的微生物发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高番茄红素产量的微生物发酵生产方法。该方法的具体操作步骤如下：(1)在平板上分别培养三孢布拉氏霉菌(Blakeslea？trispora)(+)、(-)菌株，得到孢子悬液；(2)将三孢布拉氏霉菌(Blakeslea？trispora)(+)、(-)菌株分别接种到装有种子培养基的锥形瓶中；(3)将培养好的1瓶正菌、4瓶负菌种子液混合均匀，接入发酵培养基中发酵；(4)在发酵开始后的36-48小时加入乙烯利溶液继续培养至84小时结束。本发明的方法操作简单，缩短了生产周期，大幅度提高了番茄红素的产量、降低了生产成本，可应用于番茄红素的工业化生产。

Description

一种提高番茄红素产量的微生物发酵生产方法

技术领域

本发明涉及到一种提高由三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)生产番茄红素的方法，属于通过添加一种发酵促进剂来提高微生物液体发酵生产次级代谢产物的研究领域，特别涉及到添加乙烯利提高三孢布拉氏霉菌生产番茄红素的方法。其方法是微生物发酵培养到一定时间，添加一定浓度的乙烯利溶液，乙烯利缓慢释放出乙烯，乙烯促进了八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的表达，提高番茄红素前体物质-八氢番茄红素的合成量,并抑制番茄红素下游物质-β-胡萝卜素的合成，提高了生物合成量，使番茄红素的产量提高为原产量的1.3-2.0倍。同时发酵周期缩短了40％，由原来的5天将为了3天。本方法成本低廉、操作简便、效果明显，可以取代通过添加氧载体、表面活性剂、前体物质等各种发酵促进剂来提高番茄红素的产量，避免了其它发酵促进剂价格太高和对菌种的毒害性，为工业化生产提供了良好的依据。

背景技术

类胡萝卜素(β-胡萝卜素、番茄红素和叶黄素等)具有增强免疫功能、清除自由基、抗氧化、防治多种癌症等重要的生理功能，人类对类胡萝卜素的种类和产量需求越来越大。近年来研究发现,番茄红素抵抗自由基的能力，是乙型胡萝卜素的2倍，比维生素E强100倍，是维生素C的1000倍，从而引起了对其研究的热烈关注。对于番茄红素的生产方法，除了天然提取或化学合成，还可以采用藻类和真菌及酵母发酵生产类胡萝卜素，是获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径，不受环境条件限制，具有安全性、低成本及强着色力等优势在国内外受到格外的青睐。从品质、技术、生产、资源成本等分析，利用微生物技术生产番茄红素等天然类胡萝卜素是发展的主要方向。

但是目前制约发酵法工业化生产番茄红素的主要因素是微生物不能高水平的积累番茄红素，导致发酵产率低、生产成本较高。番茄红素合成途径复杂，构建番茄红素基因工程高产菌至今尚未取得突破性进展。因此，添加前体物质及发酵促进剂，并且对发酵条件进行优化，仍是提高番茄红素产量的主要手段。

发明内容

本发明的主要目的在于提高三孢布拉氏霉菌液体深层发酵生产番茄红素的产量。具体实施方法是在发酵液中添加乙烯利，缩短发酵周期，降低生产成本，提高番茄红素产量。其特征在于：在发酵开始之中在发酵液中添加乙烯利；加入乙烯利的浓度为0.5-0.7g/l起始发酵液体积；加入乙烯利的时间是发酵开始后36-48小时。

一种提高一种提高番茄红素产量的微生物发酵生产方法，其特征在于步骤如下：

1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存。

2)种子培养：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B₁，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。从三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于26-28℃，180-200rpm条件下避光培养36-40小时。

3)发酵培养：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。将培养好的三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％(v/v)的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26-28℃，200-220rpm条件下避光培养84小时。在发酵开始后36小时乙烯利，加入250μl体积浓度为10％的阻断剂烟碱。发酵84小时后，用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。

加入乙烯利的浓度为0.5-0.7g/l起始发酵液体积；加入乙烯利的时间是发酵开始后36-48小时。

番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.03-0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

附图说明

图1是本发明流程示意图。

具体实施方式

实施例1

1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存。

2)种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B₁，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。

3)发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。

4)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于27℃，转速为190rpm条件下避光培养40小时。

5)发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％(v/v)的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，在发酵开始36h时，准确量取1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、2.75、3、3.5mL的1％的乙烯利溶液，加入发酵培养基中，标记。于28℃，转速为210rpm条件下避光培养。在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10％的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。

6)番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.03g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

所得结果如下：

添加乙烯利浓度为0.5g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为820mg/l发酵液，比空白提高了52％。

添加乙烯利浓度为0.6g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为940mg/l发酵液，比空白提高了74％。

添加乙烯利浓度为0.7g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为907mg/l发酵液，比空白提高了68％。

实施例2

1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存。

2)种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B₁，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。

3)发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。

4)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于28℃，转速为180rpm条件下避光培养38小时。

5)发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌(Blakesleatrispora)(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％(v/v)的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26℃，转速为220rpm条件下避光培养。在发酵培养了0、12、24、36、42、48、60小时后分别加入3mL的浓度为1％的乙烯利溶液，在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10％的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。

6)番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

所得结果如下：

发酵开始后36小时添加浓度为0.6g/l起始发酵液体积的乙烯利，番茄红素产量为831mg/l发酵液，比空白提高了54％。

发酵开始后42小时添加浓度为0.6g/l起始发酵液体积的乙烯利，番茄红素产量为918mg/l发酵液，比空白提高了70％。

发酵开始后48小时添加浓度为0.6g/l起始发酵液体积的乙烯利，番茄红素产量为950mg/l发酵液，比空白提高了76％。

Claims (1)

1.一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法，其特征在于步骤如下：

1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂；115℃下灭菌30min，制得PDA培养基；取三孢布拉氏霉菌Blakesleatrispora(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存；

2)种子培养：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min；冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B₁，混匀后用氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30min；从三孢布拉氏霉菌Blakesleatrispora(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于26-28℃，180-200rpm条件下避光培养36-40小时；

3)发酵培养：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5；分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min；将培养好的三孢布拉氏霉菌Blakesleatrispora(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％体积的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26-28℃，200-220rpm条件下避光培养84小时；在发酵开始后36小时，加入乙烯利，加入250uL体积浓度为10％的阻断剂烟碱；发酵结束后，用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体；

加入乙烯利的浓度为0.5-0.7g/l起始发酵液体积；加入乙烯利的时间是发酵开始后36-48小时。