CN103276018B - 一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法。该方法的具体步骤如下：（1）在平板上分别培养三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株，得到孢子悬液；（2）将三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株分别接种到装有种子培养基的锥形瓶中；（3）将培养好的1瓶正菌、4瓶负菌种子液混合均匀，接入发酵培养基中发酵；（4）在发酵开始后的0-36小时加入氨基酸继续培养至84小时结束。本发明的方法简单易行、成本低廉、大大提高了番茄红素的产量。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，特别涉及添加氨基酸提高三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法。
背景技术
番茄红素是一种脂溶性不饱和碳氢化合物，是自然界中抗氧化性最强的类胡萝卜素。番茄红素具有很多优越的生理功能，它不仅具有抗癌抑癌的功效，而且对于预防心血管疾病以及动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统免疫力以及延缓衰老等都具有重要意义，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。
番茄红素的生产方法主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。从生产原料和成本、工艺以及产品活性和纯度等方面综合考虑，微生物发酵法具有明显的优势，是番茄红素理想的产业化生产方法。其中，利用三孢布拉氏霉菌生产番茄红素尤其受到关注，三孢布拉氏霉菌生产β-胡萝卜素已经实现工业化，在该菌发酵过程中，如果添加合适的含氮杂环化合物，可以阻断番茄红素环化形成β-胡萝卜素的过程，造成番茄红素的积累。许多成果已经转化为专利，如JP48016189，RU2102416，US3369974等。国内也有利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素相关的研究报道。如CN101838667A描述了一种基于三孢布拉氏霉菌生物学特征的罐批发酵方法；CN102251008A发明了一种添加异戊烯醇、香叶醇及甲羟戊酸内酯等物质提高番茄红素产量的方法。
氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质，与生物体的生命活动有着密切的关系。氨基酸还能够进一步分解代谢转化成糖类、脂类、α-酮酸、乙酰CoA等物质，并进入三羧酸循环。因此利用氨基酸的这种性质将其加入发酵液中，提供番茄红素生物合成的营养成分，促进菌体生长和产物合成。在发酵过程中添加氨基酸操作易行，成本较低，可以用于番茄红素的工业化生产中。
发明内容
本发明的主要目的在于提高三孢布拉氏霉菌液体深层发酵生产番茄红素的产量。具体实施方法是在发酵液中添加氨基酸，降低生产成本，提高番茄红素产量。其特征在于：在发酵开始之前或之中在发酵液中添加氨基酸；加入氨基酸的浓度为0.2-0.5g/l起始发酵液体积；加入氨基酸的时间是发酵开始后0-36小时。
一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的方法，其特征在于步骤如下：
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存。
2）种子培养：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于26-28℃，180 -200rpm条件下避光培养36-40小时。
3）发酵培养：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，加入NAD+前体物质，于26-28℃，200-220rpm条件下避光培养84小时。在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后，用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
氨基酸的加入量为0.2-0.5g/l起始发酵液体积；加入的时间是发酵开始后0-36小时。
番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.03-0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
具体实施方式
实施例1
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于27℃，转速为190rpm条件下避光培养40小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，在发酵开始时准确称取0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05g赖氨酸，加入发酵培养基中，标记。于28℃，转速为210rpm条件下避光培养。在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.03g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
添加赖氨酸浓度为0.2g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为758mg/l发酵液，比空白提高了40%。
添加赖氨酸浓度为0.3g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为824mg/l发酵液，比空白提高了52%。
添加赖氨酸浓度为0.5g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为745mg/l发酵液，比空白提高了37%。
实施例2
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养4天，4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于28℃，转速为200rpm条件下避光培养36小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，在发酵开始时准确称取0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05g苏氨酸，加入发酵培养基中，标记。于27℃，转速为220rpm条件下避光培养。在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.04g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
添加苏氨酸浓度为0.2g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为722mg/l发酵液，比空白提高了42%。
添加苏氨酸浓度为0.3g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为948mg/l发酵液，比空白提高了87%。
添加苏氨酸浓度为0.4g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为925mg/l发酵液，比空白提高了82%。
实施例3
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3天，4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于27℃，转速为190rpm条件下避光培养38小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，在发酵开始时准确称取0.005、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05g丙氨酸，加入发酵培养基中，标记。于28℃，转速为200rpm条件下避光培养。在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
添加丙氨酸浓度为0.3g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为854mg/l发酵液，比空白提高了54%。
添加丙氨酸浓度为0.4g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为964mg/l发酵液，比空白提高了74%。
添加丙氨酸浓度为0.5g/l起始发酵液体积时，番茄红素产量为903mg/l发酵液，比空白提高了63%。
实施例3
1）平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min，配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存。
2）种子培养基配制：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、 0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
3）发酵培养基配制：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30 min。
4）种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250 ml锥形瓶中，于28℃，转速为180rpm条件下避光培养38小时。
5）发酵培养：将培养好的三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）（+）、（-）菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10%（v/v）的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，于26℃，转速为220rpm条件下避光培养。在发酵培养了0、12、24、36、48、60小时后分别加入浓度为0.4g/l起始发酵液体积的丙氨酸，在发酵开始后36小时加入250μl体积浓度为10%的阻断剂烟碱。发酵84小时后收集菌体，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体。
6）番茄红素含量测定：将得到的干菌体称量后粉碎，准确称取0.05g干菌粉，石油醚萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。
所得结果如下：
发酵开始后12小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的丙氨酸，番茄红素产量为786mg/l发酵液，比空白提高了63%。
发酵开始后24小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的丙氨酸，番茄红素产量为806mg/l发酵液，比空白提高了68%。
发酵开始后36小时添加浓度为0.4g/l起始发酵液体积的丙氨酸，番茄红素产量为825mg/l发酵液，比空白提高了72%。
Claims (1)
1.一种提高三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)发酵生产番茄红素的方法，其特征在于步骤如下：
1)平板培养：取去皮土豆20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂；115℃下灭菌30min，制得PDA培养基；取三孢布拉氏霉菌Blakeslea trispora(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存；
2)种子培养：将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中，用去离子水定容至1000ml，于95℃下糊化40min；冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁，0.01g维生素B1，混匀后用氢氧化钠溶液调pH至6.5，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30min；从三孢布拉氏霉菌Blakesleatrispora(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌，分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中，于26-28℃，180-200rpm条件下避光培养36-40小时；
3)发酵培养：将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中，加入去离子水定容至1000ml，配制成发酵液，用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5；分装于500ml锥形瓶中，于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min；将培养好的三孢布拉氏霉菌Blakesleatrispora(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀，以10％体积的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，加入氨基酸，于26-28℃，200-220rpm条件下避光培养84小时；在发酵开始后36小时加入250uL体积浓度为10％的阻断剂烟碱；发酵结束后，用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤，将湿菌体置于真空干燥箱中，45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时得到干菌体；
加入氨基酸的浓度为0.2-0.5g/l起始发酵液体积；加入氨基酸的时间是发酵开始后0-36小时，所述氨基酸为赖氨酸、苏氨酸或丙氨酸。
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