CN102757995B - 一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，包括将三孢布拉氏霉菌ATCC14271（+）和ATCC14272（-）活化后，经过种子培养，在优选的发酵工艺条件下按一定的接种量和接种比接入发酵培养基中发酵，最终得到β-胡萝卜素含量较高的菌丝体。采用本发明的方法可以获得成本低、效价高且天然优质的β-胡萝卜素产品。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法。
背景技术
β- 胡萝卜素不仅是VA原，具有预防眼疾、保护视力的功能，而且还具有抑制细胞变异，抗癌、防癌、抗氧自由基、增强机体抵抗力、维护人体上皮组织正常的生理功能，以及促进儿童生长发育、美容等一系列重要作用，在世界许多国家被广泛用作食品营养强化剂及添加剂。
目前β- 胡萝卜素的制备方法主要包括以下几种：（1）天然β-胡萝卜素的提取。工业生产中常从胡萝卜、玉米、沙棘等富含 β-胡萝卜素的植物中提取 β-胡萝卜素。（2）β-胡萝卜素的化学合成。采用有机化工原料，通过化学反应合成 β-胡萝卜素。3、生物合成法。采用微生物发酵法生产胡萝卜素，从品质、技术、资源和成本等因素考虑均优于化学合成法。国内外微生物合成 β-胡萝卜素的研究主要集中在丝状真菌（三孢布拉氏霉菌）和红酵母方面。除此之外，也有杜氏盐藻提取法、螺旋藻提取法以及基因工程法用于β-胡萝卜素的生产研究。
利用三孢布拉氏霉菌发酵制备的β-胡萝卜素是顺反式β-胡萝卜素混合物，且利用三孢布拉氏霉菌发酵制备的β-胡萝卜素的培养基原料为天然物质，无毒无害。而人工合成的β-胡萝卜素几乎全为反式异构体，比如中国专利CN101088989A公开了一种利用C22二炔多烯化合物为原料，与格氏试剂反应生成双格氏化合物，所得的双格氏化合物与2，2，6-三甲基环几酮反应得到双去氧β-胡萝卜素，其还原反应得到反式β-胡萝卜素。还有中国专利CN101081829A公开了一种由维生素A衍生物与三苯基膦反应得到的有机膦盐，在氧化剂存在下，进行偶联反应得到反式β-胡萝卜素。又如中国专利CN1291608A公开了用砜的衍生物生产β-胡萝卜素的方法。另外，中国专利CN1215723A公开了一种利用维俤希反应制备类胡萝卜素的方法。中国专利CN1090271A公开了一种β-胡萝卜素的化学合成方法，其包括三个步骤，由维生素醋酸酯经氢氧化钠水溶液水解的到VA，在用氧化剂氧化VA得到维生素A醛，最后通过二价钛偶联维生素A醛而制得反式β-胡萝卜素。
在生物合成β-胡萝卜素法方面，中国专利CN101008000A公开了一种利用粘性红圆酵母生产β-胡萝卜素的方法，包括将粘性红圆酵母活化、发酵培养一定时间离心得到菌体，采用酸热法破碎菌体细胞，然后加入石油醚：丙酮（1:1）的混合液，28℃震荡1h一般可得389ug/g。但在使用该方法制备β-胡萝卜素得率太低。另外，中国专利CN1193048A公开了一种利用孢子接种在气升发酵罐中培养丝状真菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，该工艺包括一级种子培养和二级种子培养及发酵等工艺，然而发酵培养基中植物油添加量较大，从而造成成本过高。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用微生物生产β-胡萝卜素的方法。利用本发明的方法可以获得成本低、得率高且天然优质的β-胡萝卜素产品。
为了实现本发明，发明人通过大量试验反复研究，并终于获得了如下制备β-胡萝卜素的方法：
一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
（1）菌种活化：在无菌环境下将三孢布拉霉正负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，28℃培养4d，待三孢布拉霉正负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正负菌孢子悬液的浓度分别达到：正菌103个孢子/mL，负菌104个孢子/mL；
（2）种子培养：将正负菌分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在250mL的三角瓶中，装液量 50mL，培养温度为28℃，转速200 r/min，正菌培养时间为20h，负菌培养时间为24小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液；
（3）发酵培养：将达到对数生长期的正负菌种子液按1:5的比例在无菌的条件下混合，再以1%-10%的接种量接入发酵培养基中培养144-168h；所述发酵培养基的配制方法为：取40.8克麸皮，加入1000mL自来水，煮沸1h，双层纱布过滤，滤液定容到1000mL得到麸皮浸出液；取100mL麸皮浸出液，加入麦芽糖7.16克、硫酸镁0.04克，大豆粉1克，KH2PO4 0.2克，大豆油1克，VB10.001克，即得；
（4）β-胡萝卜素提取：将发酵培养后的培养物过滤洗清，-70℃~50℃恒温真空干燥过夜，得到干菌体，用研磨法粉碎细胞，加入体积比为1：1的丙酮-石油醚混合液后研磨萃取，直至菌体无色为止，过滤萃取后的上清液，得萃取液，结晶，干燥。
优选地，步骤（3）的发酵培养为摇瓶中发酵培养，接种量为6%，在温度为28℃，初始pH为6.5，摇床转速为200 r/min，装液量50 mL/250 mL三角瓶条件下，震荡培养144-168h。
优选地，步骤（3）的发酵培养为10L机械搅拌发酵罐培养，装液量为6-7L，转速为100-200rpm，通气量为1.5-2.0 VVM，罐压0.03-0.06MPa，灭完菌pH为6-7，罐温26-28℃，三孢布拉氏霉正负菌种子液按1:5，接种量为6%-10%，发酵35-40h后加入浓度为0.1%-0.5%β-紫罗兰酮，培养时间为144-168h。
优选地，步骤（3）的发酵培养为100L机械搅拌发酵罐培养，装液量为50-60 L，转速为0 rpm，通气量为1 VVM，罐压0.03-0.06MPa，灭完菌pH为6-7，罐温26-28℃，三孢布拉氏霉正负菌种子液按1:5接入，接种量为1%-3%，发酵35-40h后加入浓度为0.1%-0.5%β-紫罗兰酮，培养时间为144-168h。
优选地，步骤（2）的种子培养基配方为（W/V）:: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.02%、VB1 0.001%、pH 6.5。
进一步优选地，所述三孢布拉氏霉菌为三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271（+）和三孢布拉氏霉负菌ATCC 14272（-）。
与现有技术相比，本发明利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法具有如下优点和显著的进步性：
1）成本低。本方法加入了较低量的植物油，节省了成本与资源。所采用的培养基均为天然无毒无害的基质，且使用了廉价的农副产品（麸皮浸出液），培养基固形物含量低（大豆粉1%）。
2）得率高。利用本发明的工艺方法获得了较高的β-胡萝卜素得率（干菌丝体含量）：2%-5%。
附图说明
图1 利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的流程工艺图。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例一:摇瓶中发酵培养制备富含β-胡萝卜素菌株
1．菌株：
三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）
2．培养基：
1）斜面PDA培养基的制备及组成：取新鲜未发芽的土豆200g，去皮，切成3mm×3mm的块状，加入800-1000ml水，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液中加入蔗糖（或葡萄糖）20g， 琼脂15-20g，溶化后补水至1000ml，自然pH，分装到试管中（每管5ml），121℃灭菌30min，制成斜面。
2）种子培养基配方为（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.02%、VB1 0.001%、pH 6.5。
3）麸皮浸出液的制备方法：取40.8克麸皮，加入1000mL自来水，煮沸1h，双层纱布过滤，滤液定容到1000mL得到麸皮浸出液。
4）发酵培养基的配方：取100mL麸皮浸出液，加入麦芽糖7.16克、硫酸镁0.04克，大豆粉1克，KH2PO40.2克，大豆油1克，VB10.001克。
3. 菌种活化
在无菌环境下将三孢布拉霉正负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，28℃培养4d，待三孢布拉霉正负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正负菌孢子悬液的浓度分别达到：正菌103个孢子/mL，负菌104个孢子/mL。
4．种子扩大培养：
将正负菌分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在250mL的三角瓶中，装液量 50mL，培养温度为28℃，转速200 r/min，正菌培养时间为20h，负菌培养时间为24小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。
5.发酵培养：
将达到对数生长期的正负菌种子液按1:5的比例在无菌的条件下接入到发酵培养基，接种量为6%，在温度为28℃，初始pH为6.5，摇床转速为200 r/min，装液量50mL/250 mL三角瓶条件下，震荡培养144-168h。
6.菌丝体干重及色素测量
培养完毕后将培养物用2层纱布过滤洗清，恒温真空干燥过夜（-70℃），秤重，得到菌体干重。收集发酵液中的菌体，经恒温干燥后得到干菌体，用研磨法粉碎细胞，精确称取0.01g左右菌体，加入1：1（V:V)丙酮:石油醚混合液少许，在研钵中研磨，萃取直至菌体无色为止，用滤纸过滤萃取后的上清液，收集滤液并记录萃取液体积。然后用石油醚将萃取液稀释，根据β-胡萝卜素的特征吸收波长在450nm条件下，用分光光度法测定并利用回归方程计算出β-胡萝卜素含量。
7.结果
1）菌丝体干重：32.5g/L
2）β-胡萝卜素含量：2.6%
实施例二:10L机械搅拌发酵罐中发酵培养制备富含β-胡萝卜素菌株
1．菌株：
三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）
2．培养基：
1）斜面PDA培养基的制备及组成：取新鲜未发芽的土豆200g，去皮，切成3mm×3mm的块状，加入800-1000ml水，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液中加入蔗糖（或葡萄糖）20g， 琼脂15-20g，溶化后补水至1000ml，自然pH，分装到试管中（每管5ml），121℃灭菌30min，制成斜面。
2）种子培养基配方为（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.02%、VB1 0.001%、pH 6.5。
3）麸皮浸出液的制备方法：取40.8克麸皮，加入1000mL自来水，煮沸1h，双层纱布过滤，滤液定容到1000mL得到麸皮浸出液。
4）发酵培养基的配方：取100mL麸皮浸出液，加入麦芽糖7.16克、硫酸镁0.04克，大豆粉1克，KH2PO40.2克，大豆油1克，VB10.001克。
3. 菌种活化
在无菌环境下将三孢布拉霉正负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，28℃培养4d，待三孢布拉霉正负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正负菌孢子悬液的浓度分别达到：正菌103个孢子/mL，负菌104个孢子/mL。
4．种子扩大培养：
将一定量的正负菌分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在250mL的三角瓶中，装液量 50mL，培养温度为28℃，转速200 r/min，正菌培养时间为20h，负菌培养时间为24小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。
5．发酵培养
在10L机械搅拌发酵罐中将种子培养基接入发酵罐中，装液量为6-7L，转速为100-200rpm，通气量为1.5-2.0 VVM，罐压0.03-0.06MPa，灭完菌pH为6-7，罐温26-28℃，正负菌种子液按1:5接入，接种量为8%，发酵35-40h后加入浓度为0.3%β-紫罗兰酮，培养时间为144-168h。
6．菌丝体干重及色素测量
培养完毕后将培养物用2层纱布过滤洗清，恒温（50℃）真空干燥过夜，秤重，得到菌体干重。收集发酵液中的菌体，经恒温干燥后得到干菌体，用研磨法粉碎细胞，精确称取0.01g左右菌体，加入1：1（V:V)丙酮:石油醚混合液少许，在研钵中研磨，萃取直至菌体无色为止，用滤纸过滤萃取后的上清液，收集滤液并记录萃取液体积。然后用石油醚将萃取液稀释，根据β-胡萝卜素的特征吸收波长在450nm条件下，用分光光度法测定并利用回归方程计算出β-胡萝卜素含量。
7．结果
1）菌丝体干重：26.5g/L
2）β-胡萝卜素含量：3.1%
实施例三:100L机械搅拌发酵罐中发酵培养制备富含β-胡萝卜素菌株
1．菌株：
三孢布拉氏霉菌ATCC 14271（+）和ATCC 14272（-）
2．培养基：
1）斜面PDA培养基的制备及组成：取新鲜未发芽的土豆200g，去皮，切成3mm×3mm的块状，加入800-1000ml水，煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液中加入蔗糖（或葡萄糖）20g， 琼脂15-20g，溶化后补水至1000ml，自然pH，分装到试管中（每管5ml），121℃灭菌30min，制成斜面。
2）种子培养基配方为（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.02%、VB1 0.001%、pH 6.5。
3）麸皮浸出液的制备方法：取40.8克麸皮，加入1000mL自来水，煮沸1h，双层纱布过滤，滤液定容到1000mL得到麸皮浸出液。
4）发酵培养基的配方：取100mL麸皮浸出液，加入麦芽糖7.16克、硫酸镁0.04克，大豆粉1克，KH2PO40.2克，大豆油1克，VB10.001克。
3. 菌种活化
在无菌环境下将三孢布拉霉正负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，28℃培养4d，待三孢布拉霉正负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正负菌孢子悬液的浓度分别达到：正菌103个孢子/mL，负菌104个孢子/mL。
4．种子扩大培养：
将一定量的正负菌分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在250mL的三角瓶中，装液量 50mL，培养温度为28℃，转速200 r/min，正菌培养时间为20h，负菌培养时间为24小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液。
5．发酵培养
在100L机械搅拌发酵罐中将种子培养基接入发酵罐中，装液量为50-60L，转速为0rpm，通气量为1 VVM，罐压0.03-0.06MPa，灭完菌pH为6-7，罐温26-28℃，正负菌种子液按1:5接入，接种量为2%，发酵35-40h后加入浓度为0.3%β-紫罗兰酮，培养时间为144-168h。
6．菌丝体干重及色素测量
培养完毕后将培养物用2层纱布过滤洗清，恒温（-70℃）真空干燥过夜，秤重，得到菌体干重。收集发酵液中的菌体，经恒温干燥后得到干菌体，用研磨法粉碎细胞，精确称取0.01g左右菌体，加入1：1（V:V)丙酮:石油醚混合液少许，在研钵中研磨，萃取直至菌体无色为止，用滤纸过滤萃取后的上清液，收集滤液并记录萃取液体积。然后用石油醚将萃取液稀释，根据β-胡萝卜素的特征吸收波长在450nm条件下，用分光光度法测定并利用回归方程计算出β-胡萝卜素含量。
7．结果
1）菌丝体干重：21.5g/L
2）β-胡萝卜素含量：4.8%。
Claims (5)
1.一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）菌种活化：在无菌环境下将三孢布拉霉正负菌株分别接种到斜面PDA培养基中，置于培养箱内，28℃培养4d，待三孢布拉霉正负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正负菌孢子悬液的浓度分别达到：正菌103个孢子/mL，负菌104个孢子/mL；
（2）种子培养：将正负菌分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在250mL的三角瓶中，装液量 50mL，培养温度为28℃，转速200 r/min，正菌培养时间为20h，负菌培养时间为24小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液；
（3）发酵培养：将达到对数生长期的正负菌种子液按1:5的比例在无菌的条件下混合，再以1%-10%的接种量接入发酵培养基中培养144-168h；所述发酵培养基的配制方法为：取40.8克麸皮，加入1000mL自来水，煮沸1h，双层纱布过滤，滤液定容到1000mL得到麸皮浸出液；取100mL麸皮浸出液，加入麦芽糖7.16克、硫酸镁0.04克，大豆粉1克，KH2PO4 0.2克，大豆油1克，VB10.001克，即得；
（4）β-胡萝卜素提取：将发酵培养后的培养物过滤洗清，-70℃~50℃，恒温真空干燥过夜，得到干菌体，用研磨法粉碎细胞，加入体积比为1：1的丙酮-石油醚混合液后研磨萃取，直至菌体无色为止，过滤萃取后的上清液，得萃取液，结晶，干燥；
所述三孢布拉氏霉菌为三孢布拉氏霉正菌ATCC 14271（+）和三孢布拉氏霉负菌ATCC 14272（-）。
2.根据权利要求1所述利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：步骤（3）的发酵培养为摇瓶中发酵培养，接种量为6%，在温度为28℃，初始pH为6.5，摇床转速为200 r/min，装液量50 mL/250 mL三角瓶条件下，震荡培养144-168h。
3.根据权利要求1所述利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：步骤（3）的发酵培养为10L机械搅拌发酵罐培养，装液量为6-7L，转速为100-200rpm，通气量为1.5-2.0 VVM，罐压0.03-0.06MPa，灭完菌pH为6-7，罐温26-28℃，三孢布拉氏霉正负菌种子液按1:5，接种量为6%-10%，发酵35-40h后加入浓度为0.1%-0.5%β-紫罗兰酮，培养时间为144-168h。
4.根据权利要求1所述利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：步骤（3）的发酵培养为100L机械搅拌发酵罐培养，装液量为50-60 L，转速为0 rpm，通气量为1 VVM，罐压0.03-0.06MPa，灭完菌pH为6-7，罐温26-28℃，三孢布拉氏霉正负菌种子液按1:5接入，接种量为1%-3%，发酵35-40h后加入浓度为0.1%-0.5%β-紫罗兰酮，培养时间为144-168h。
5.根据权利要求1所述利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：步骤（2）的种子培养基配方为（W/V）: 玉米粉3%、大豆粉3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 0.02%、VB1 0.001%、pH 6.5。
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