CN112029811A - 一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法 - Google Patents
一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域,具体属于一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β‑胡萝卜素产量的方法。本发明在利用三孢布拉氏霉菌进行液体深层发酵时,添加一定浓度的乙烯利溶液,乙烯利缓慢释放出乙烯,乙烯在转录水平上对类胡萝卜素合成相关基因起到促进作用,从而促进了β‑胡萝卜素的大量积累,提高β‑胡萝卜素的发酵产量。本方法成本低廉、操作简便、效果明显,可以取代通过添加氧载体、表面活性剂、前体物质等各种发酵促进剂来提高β‑胡萝卜素的产量,避免了其它发酵促进剂价格太高和对菌种的毒害性,为工业化生产提供了良好的依据。本发明β‑胡萝卜素产量比空白对照组提高54%‑78%,同时发酵周期由原来的5天缩短为了3天,缩短了40%。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体属于一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法。
背景技术
现有技术中,三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素时,通常采用添加氧载体、表面活性剂、前体物质等各种发酵促进剂的方式来提高β-胡萝卜素的发酵产量,然而在发酵过程中添加上述物质的缺陷在于,上述发酵促进剂购置成本一般较高,同时部分促进剂对于发酵菌种具有毒害性。
发明内容
针对以上技术问题,本发明目的在于提供一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,利用三孢布拉氏霉菌进行液体深层发酵,来生产β-胡萝卜素,通过添加外源性促进剂乙烯利,刺激微生物大量富集代谢产物提高β-胡萝卜素的产量,成本低、安全无毒。
本发明所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,具体包括如下步骤:
(1)平板培养:三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板培养基上,置于28℃恒温培养箱中培养3-5天,4℃保存,得到三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板;
(2)种子培养:从三孢布拉氏霉菌菌株平板中各自用接种环挑取一环菌丝体,接种到有种子培养基的锥形瓶中,用棉塞封口后,于26-28℃,转速为200-220rpm条件下避光培养48h,得种子液;
(3)微生物发酵生产β-胡萝卜素:将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀,以10%体积的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中,于26-28℃,200-220rpm条件下避光振荡培养84小时;发酵24-42小时后将乙烯利溶液溶液加入到发酵培养基中,继续培养,得发酵培养液;
(4)β-胡萝卜素的提取:用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤,将湿菌体置于真空干燥箱中,干燥处理24小时得到干菌体;干菌体破碎,用乙醇萃取,旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇,获得β-胡萝卜素的纯品。
步骤(1)中PDA平板培养基的制备方法如下:取去皮土豆20g,加入200ml去离子水煮沸并保持20min,冷却后用四层纱布过滤,取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂,在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min,配制PDA培养基。
步骤(2)中种子培养基的制备方法如下:将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中,用去离子水定容至1000ml,于95℃下糊化40min,冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁,0.01g维生素B1,混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5,分装于250ml锥形瓶中,在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
步骤(3)中发酵培养基的制备方法如下:将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中,加入去离子水定容至1000ml,配制成发酵液,用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5,分装于500ml锥形瓶中,于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min所得。
步骤(3)中乙烯利溶液溶液的浓度为0.5%-2%。
步骤(3)中乙烯利溶液溶液的加入量为1-4mL。
步骤(3)中所述的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液的比例1:4(V/V)。
步骤(4)中所述的真空干燥箱中真空干燥的工艺条件为,温度为45℃、压力为0.08Mpa。
步骤(4)中乙醇为无水乙醇,萃取时萃取3次及以上。
本发明的原理为:本发明在利用三孢布拉氏霉菌进行液体深层发酵时,添加一定浓度的乙烯利溶液,乙烯利缓慢释放出乙烯,乙烯在转录水平上对类胡萝卜素合成相关基因起到促进作用,从而促进了β-胡萝卜素的大量积累,提高β-胡萝卜素的发酵产量。
本发明与现有技术相比,具有以下有益效果。
(1)本方法成本低廉、操作简便、效果明显,可以取代通过添加氧载体、表面活性剂、前体物质等各种发酵促进剂来提高β-胡萝卜素的产量,避免了其它发酵促进剂价格太高和对菌种的毒害性,为工业化生产提供了良好的依据;
(2)本发明β-胡萝卜素产量比空白对照组提高54%-78%,同时发酵周期由原来的5天缩短为了3天,缩短了40%。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)平板培养:取去皮土豆20g,加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤,取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min,配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上,于28℃恒温培养箱中培养3-5天,4℃保存。
(2)种子培养基配制:将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中,用去离子水定容至1000ml,于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁,0.01g维生素B1,混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5,分装于250ml锥形瓶中,在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(3)发酵培养基配制:将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中,加入去离子水定容至1000ml,配制成发酵液,用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中,于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(4)种子培养:分别从三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌,分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中,于28℃,转速为200-220rpm条件下避光培养48小时。
(5)发酵培养:将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀,以10%(v/v)的接种量分别接入到装3个有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中,在发酵开始36小时,准确量取2、3、4mL的1%的乙烯利溶液,分别加入到上述3个发酵培养基中,标记。于28℃,转速为200-220rpm条件下避光培养。
(6)β-胡萝卜素的提取:发酵84小时后收集菌体,将湿菌体置于真空干燥箱中,45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时,得到干菌体。干菌体用粉粹机破碎,用无水乙醇三次及以上萃取,然后旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇,获得β-胡萝卜素的纯品。
所得结果如下:
空白组(空白组发酵工艺与本实施例不同点在于,空白组未加入乙烯利溶液)β-胡萝卜素产量为520mg/l发酵液。
添加2ml的1%乙烯利时,β-胡萝卜素产量为801mg/l发酵液,比空白提高了54%。
添加3ml的1%乙烯利时,β-胡萝卜素产量为915mg/l发酵液,比空白提高了76%。
添加4ml的1%乙烯利时,β-胡萝卜素产量为878mg/l发酵液,比空白提高了69%。
实施例2
(1)平板培养:取去皮土豆20g,加入200ml去离子水煮沸并保持20min。冷却后用四层纱布过滤,取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂。在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min,配制PDA培养基。取三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板上,于28℃恒温培养箱中培养3-5天,4℃保存。
(2)种子培养基配制:将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中,用去离子水定容至1000ml,于95℃下糊化40min。冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁,0.01g维生素B1,混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5,分装于250ml锥形瓶中,在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(3)发酵培养基配制:将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中,加入去离子水定容至1000ml,配制成发酵液,用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5。分装于500ml锥形瓶中,于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
(4)种子培养:分别从三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板中用接种环挑取一环的正菌、负菌,分别接种到含有50ml种子培养基的250ml锥形瓶中,于28℃,转速为200-220rpm条件下避光培养48小时。
(5)发酵培养:将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀,以10%(v/v)的接种量分别接入到3个装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中。在分贝发酵培养了24、36、42小时后,将3ml的1%的乙烯利分别加入上述3个发酵培养基中标记。于28℃,转速为200-220rpm条件下避光培养。
(6)β-胡萝卜素的提取:发酵84小时后收集菌体,将湿菌体置于真空干燥箱中,45℃、0.08Mpa条件下干燥处理24小时,得到干菌体。干菌体用粉粹机破碎,用无水乙醇三次及以上萃取,然后旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇,获得β-胡萝卜素的纯品。
所得结果如下:
空白(空白组发酵工艺与本实施例不同点在于,空白组未加入乙烯利溶液)β-胡萝卜素产量为550mg/l发酵液。
发酵开始后24小时添加3ml的1%的乙烯利,β-胡萝卜素产量为847mg/l发酵液,比空白提高了54%。
发酵开始后36小时添加3ml的1%的乙烯利,β-胡萝卜素产量为979mg/l发酵液,比空白提高了78%。
发酵开始后42小时添加3ml的1%的乙烯利,β-胡萝卜素产量为775mg/l发酵液,比空白提高了41%。
Claims (9)
1.一种提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:具体包括如下步骤:
(1)平板培养:三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株孢子悬液分别涂布于PDA平板培养基上,置于28℃恒温培养箱中培养3-5天,4℃保存,得到三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株平板;
(2)种子培养:从三孢布拉氏霉菌菌株平板中各自用接种环挑取一环菌丝体,接种到有种子培养基的锥形瓶中,用棉塞封口后,于26-28℃,200-220rpm条件下避光震荡培养48h,得种子液;
(3)微生物发酵生产β-胡萝卜素:将培养好的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液按照正菌1瓶、负菌4瓶的比例混合均匀,以10%体积的接种量接入到装有50ml发酵培养基的500ml锥形瓶中,于26-28℃,200-220rpm条件下避光振荡培养84小时;发酵24-42小时后将乙烯利溶液溶液加入到发酵培养基中,继续培养,得发酵培养液;
(4)β-胡萝卜素的提取:用去离子水清洗收获的菌体并用纱布过滤,将湿菌体置于真空干燥箱中,干燥处理24小时得到干菌体;干菌体破碎,用乙醇萃取,旋转蒸发仪上真空蒸馏乙醇,获得β-胡萝卜素的纯品。
2.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(1)中PDA平板培养基的制备方法如下:取去皮土豆20g,加入200ml去离子水煮沸并保持20min,冷却后用四层纱布过滤,取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂,在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min,配制PDA培养基。
3.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(2)中种子培养基的制备方法如下:将40g玉米淀粉、20g葡萄糖、50g玉米浆加入到2升的烧杯中,用去离子水定容至1000ml,于95℃下糊化40min,冷却后加入1.5g磷酸二氢钾、0.1g七水硫酸镁,0.01g维生素B1,混匀后用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至6.5,分装于250ml锥形瓶中,在高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(3)中发酵培养基的制备方法如下:将30g葡萄糖、78g大豆饼粉、1.5g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、1g二丁基羟基甲苯加入到2升的烧杯中,加入去离子水定容至1000ml,配制成发酵液,用3mol/l的氢氧化钠溶液调pH至7.5,分装于500ml锥形瓶中,于高压蒸汽灭菌锅中115℃下灭菌30min所得。
5.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(3)中乙烯利溶液溶液的浓度为0.5%-2%。
6.根据权利要求1或5所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(3)中乙烯利溶液溶液的加入量为1-4mL。
7.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的三孢布拉氏霉菌(+)、(-)菌株种子液的比例1:4(V/V)。
8.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(4)中所述的真空干燥箱中真空干燥的工艺条件为,温度为45℃、压力为0.08Mpa。
9.根据权利要求1所述的提高三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量的方法,其特征在于:步骤(4)中乙醇为无水乙醇,萃取时萃取3次及以上。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112961897A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-06-15 | 衢州市锦润化工有限公司 | 一种天然β-胡萝卜素发酵生产工艺 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040152154A1 (en) * | 2002-01-29 | 2004-08-05 | Perez Javier Costa | Method of producing $g(b)-carotene by means of mixed culture fermentation using (+) and (—) strains of blakeslea trispora |
CN102757995A (zh) * | 2012-06-25 | 2012-10-31 | 湖北工业大学 | 一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法 |
CN104561211A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-04-29 | 厦门大学 | 利用有机酸提高三孢布拉氏霉菌生产β-胡萝卜素的方法 |
CN110684675A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-01-14 | 嘉必优生物技术(武汉)股份有限公司 | 一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品 |
-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040152154A1 (en) * | 2002-01-29 | 2004-08-05 | Perez Javier Costa | Method of producing $g(b)-carotene by means of mixed culture fermentation using (+) and (—) strains of blakeslea trispora |
CN102757995A (zh) * | 2012-06-25 | 2012-10-31 | 湖北工业大学 | 一种利用三孢布拉氏霉菌发酵制备β-胡萝卜素的方法 |
CN104561211A (zh) * | 2015-02-06 | 2015-04-29 | 厦门大学 | 利用有机酸提高三孢布拉氏霉菌生产β-胡萝卜素的方法 |
CN110684675A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-01-14 | 嘉必优生物技术(武汉)股份有限公司 | 一种三孢布拉氏霉菌发酵方法及其产品 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
杨雨濛: "乙烯促进三孢布拉氏霉菌类胡萝卜素合成机制的研究", 《万方学位论文数据库》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112961897A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-06-15 | 衢州市锦润化工有限公司 | 一种天然β-胡萝卜素发酵生产工艺 |
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