CN110923158A - 一种利用酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽的方法 - Google Patents

一种利用酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明利用一种新型的酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽，并对培养基的组成、发酵条件进行了研究，采取反胶团萃取技术对谷胱甘肽进行分离纯化，从而提高的谷胱甘肽的得率与纯化效果。本发明采用的酵母菌及原料价格低廉，生产效率高且提高了分离纯度。对提高谷胱甘肽的生产产业化有着十分重要的价值。

Description

一种利用酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽的 方法
技术领域
本发明涉及了一种利用新型酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽的方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前，在谷胱甘肽的研究中，多数学者利用酵母细胞发酵生产谷胱甘肽的方法，此方法在国内运用甚广。但是，不同的酵母细胞发酵生产谷胱甘肽的能力差别也较大。通过菌种筛选，选出了一种高效新型酵母菌种S.cerevisiae L5267用于生产谷胱甘肽，提高了谷胱甘肽的得率。
谷胱甘肽（GSH）是一种含有γ-酰胺键和巯基的三肽化合物，由谷氨酸、甘氨酸与半胱氨酸组成。其化学名称为γ-L谷氨酰--L-半胱氨酰-甘氨酸。存在于各种动植物与微生物中。谷胱甘肽分为氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽两种，但是自然界中大多数的谷胱甘肽都以还原型存在。谷胱甘肽可以和人体内的毒素进行结合，能够降低人体内的毒性物质；其次，谷胱甘肽作为人体内的还原剂，能够参与众多的氧化还原反应。目前，对于酵母细胞中谷胱甘肽的分离提取应用最多。
发酵法生产谷胱甘肽是在胞内产生的，分为两步：第一步是在Mg2+、ATP、γ-氨酰基半胱氨酸合成酶的作用下，使L-谷氨酸与L-半胱氨酸生成γ-L-氨酰基-L-半胱氨酸；第二步是在谷胱甘肽合成酶的作用下使γ-L-氨酰基-L-半胱氨酸和甘氨酸催化生成谷胱甘肽。但是，酵母菌发酵谷胱甘肽是胞内的产物，生产的谷胱甘肽对细胞内其合成酶GSH-Ⅰ的反馈抑制也增强了，因此限制了谷胱甘肽的生产。
酵母菌是一种单细胞真菌，在发酵生产谷胱甘肽中广泛应用。酵母菌种类的选取是生产谷胱甘肽的重要因素，目前较多学者们使用酿酒酵母生产谷胱甘肽。目前酿酒酵母的种类达到1500余种，多数的酿酒酵母都可用于发酵生产谷胱甘肽，但不同酿酒酵母发酵效果差别较大。
通过实验证明，酿酒酵母S.cerevisiae L5267是一种高效生产谷胱甘肽的酿酒酵母品种。通过谷胱甘肽常用的发酵方式进行发酵，经过反胶团萃取后，最终谷胱甘肽含量可达到11.765mg/g。
发明内容
本发明针对生产谷胱甘肽酵母细胞产量不足，提供了一种发酵生产谷胱甘肽的新型酿酒酵母S.cerevisiae L5267。通过优化培养基组成、发酵工艺条件控制以及利用S.cerevisiae L5267自身高产的特性生产谷胱甘肽，从而提高发酵法生产谷胱甘肽的效率。
本发明技术方案如下：
(1)选取酿酒酵母品种种类
通过对多种酿酒酵母菌的实验，最终选取了新型酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽。
(2)种子培养基扩配条件的优化
对酿酒酵母S.cerevisiae L5267进行扩培，扩培条件：摇床温度28～32℃、转速120r/min，pH自然，振荡培养38～46h,培养完毕后进行平板计数，调整酿酒酵母S.cerevisiae L5267数量级为5×108～8×108cfu/ml。
(3)培养基条件优化
酵培养基由以下原料制成：玉米胚粕和玉米淀粉黄浆糖化液100g(DE值大于90调节碳源)，加入蛋白胨2.5~2.7 g调节氮源、酵母粉2.2~2.5g、L-cys0.4~0.6 g、MgSO4 0.125~0.135 g、肌醇0.0375~0.045g、KCl 1.74~1.86g、蒸馏水250ml制成培养基，pH自然，灭菌。
(4)发酵培养条件优化
将步骤（2）中扩培后的酿酒酵母接入到培养基进行发酵，发酵条件：装液量为55～60mL，接种量为5.0～8.0%，培养温度为27～30℃，转速为130～150 r/min，培养时间 42～48h,培养完成后即为发酵液待用。
(5)反胶团萃取分离纯化
利用7mmol/L Aliquat 366溶于有机溶剂正庚醇制成反胶束对谷胱甘肽进行反胶团萃取，萃取条件：发酵液pH=2.5，反胶束与萃发酵液的体积比为2:1，K+浓度0.08～0.1mol/L，萃取时间12～15min得到萃取液；利用NaCl溶液对谷胱甘肽进行反萃取，反萃取条件：采用1.0-1.2 mol/L的NaCl水相进行反萃取，控制温度为20℃，调节pH值为5.6~5.9，得到反萃取液，利用纳滤设备将反萃取液中的盐离子脱去；再进行真空冷冻干燥，制得谷胱甘肽成品。
本发明有益效果：
(1)选取了一种新型高产谷胱甘肽的酵母菌种酿酒酵母S.cerevisiae L5267，提高了谷胱甘肽的产量。
(2)优化了酵母培养基配方，为新型酿酒酵母菌种S.cerevisiae L5267制备了培养基，提高了谷胱甘肽的产率。
(3)明确了新型酵母发酵培养条件，选取S.cerevisiae L5267为生产谷胱甘肽的酵母菌，提高了谷胱甘肽产率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。
实施例1
[(1)酿酒酵母菌种的选取
选取谷胱甘肽高产新型菌株酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽。
(2)种子培养基扩培条件优化
对实施例1（1）中酿酒酵母进行扩培，扩培条件：摇床温度28℃、转速120r/min，pH自然，振荡培养38h,培养完毕后分别进行平板计数。酿酒酵母S.cerevisiae L5267数目为7.89×108cfu/ml。
(3)培养基的优化
培养基由以下原料制成：玉米胚粕和玉米淀粉黄浆糖化液100g(DE值为90)，加入蛋白胨2.5g、酵母粉2.2g、L-cys0.4g、MgSO4 0.125 g、肌醇0.0375g、KCl 1.74g、蒸馏水250ml制成培养基，pH自然，灭菌。
(4)发酵条件优化
对实施例1（2）中扩培后的酿酒酵母接入到培养基进行发酵，发酵条件：装液量为55mL，接种量为5.0%，培养温度为27℃，转速为130 r/min，培养时间 42h,培养完成后即为发酵液待用。
(5)反胶团萃取分离纯化
利用7mmol/L Aliquat 366溶于有机溶剂正庚醇制成反胶束对谷胱甘肽进行反胶团萃取，萃取条件：发酵液pH=2.5，反胶束与发酵液的体积比为2:1，K+浓度0.08mol/L，萃取时间12min得到萃取液；利用NaCl溶液对谷胱甘肽进行反萃取，反萃取条件：采用1.0 mol/L的NaCl水相进行反萃取，控制温度为20℃，调节pH值为5.6，得到反萃取液，利用纳滤设备将反萃取液中的盐离子脱去；再进行真空冷冻干燥，制得谷胱甘肽成品，谷胱甘肽含量为10.421mg/g。
实施例2
(1)酵母菌种的选取
选取谷胱甘肽高产新型菌株酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽。
(2)种子培养基扩培条件优化
对酿酒酵母S.cerevisiae L5267分别进行进行扩培，扩培条件：摇床温度30℃、转速120r/min，pH自然，振荡培养42h,培养完毕后进行平板计数，酿酒酵母S.cerevisiae L5267扩培后数目为9.42×108cfu/ml。
(3)培养基优化
酵培养基由以下原料制成：玉米胚粕和玉米淀粉黄浆糖化液100g(DE值为91)，加入蛋白胨2.6g、酵母粉2.3g、L-cys0.5g、MgSO4 0.130 g、肌醇0.0400g、KCl 1.80g、蒸馏水250ml制成发酵培养基，pH自然，灭菌。
(4)发酵条件优化
将实施例2（2）中扩培后的酿酒酵母S.cerevisiae L5267接入到培养基进行发酵，发酵条件：装液量为58mL，接种量为7.0%，培养温度为29℃，转速为140r/min，培养时间 45h，培养完成后即为发酵液待用。
(5)反胶团萃取分离纯化
利用7mmol/L Aliquat 366溶于有机溶剂正庚醇制成反胶束对谷胱甘肽进行反胶团萃取，萃取条件：发酵液pH=2.5，反胶束与发酵液的体积比为2:1，K+浓度0.09mol/L，萃取时间14min，得到萃取液；利用NaCl溶液对谷胱甘肽进行反萃取，反萃取条件：采用1.1 mol/L的NaCl水相进行反萃取，控制温度为 20℃，调节pH值为5.7，得到反萃取液，利用纳滤设备将反萃取液中的盐离子脱去；再进行真空冷冻干燥，制得谷胱甘肽成品，谷胱甘肽含量为11.765mg/g。
实施例3
(1)酿酒酵母菌种的选取
选取谷胱甘肽高产新型菌株酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽。
(2)种子培养基扩培条件优化
对酿酒酵母S.cerevisiae L5267分别进行进行扩培，扩培条件：摇床温度32℃、转速120r/min，pH自然，振荡培养46h，培养完毕后进行平板计数，酿酒酵母S.cerevisiae L5267扩培后数目为8.59×108cfu/ml。
(3)培养基优化
酵培养基由以下原料制成：玉米胚粕和玉米淀粉黄浆糖化液100g(DE值为92)，加入蛋白胨2.7g、酵母粉2.5g、L-cys0.6g、MgSO4 0.135 g、肌醇0.045g、KCl 1.86g、蒸馏水250ml制成发酵培养基，pH自然，灭菌。
(4)发酵条件优化
将实施例3（2）中扩培后的酿酒酵母接入到培养基进行发酵，发酵条件：装液量为60mL，接种量为8.0%，培养温度为30℃，转速为150 r/min，培养时间48h，培养完成后即为发酵液待用。
(5)反胶团萃取分离纯化
利用7mmol/L Aliquat 366溶于有机溶剂正庚醇制成反胶束对谷胱甘肽进行反胶团萃取，萃取条件：发酵液pH=2.5，反胶束与发酵液的体积比为2:1，K+浓度0.1mol/L，萃取时间15min，得到萃取液；利用NaCl溶液对谷胱甘肽进行反萃取，反萃取条件：采用1.3 mol/L的NaCl水相进行反萃取，控制温度为20℃，调节pH值为5.9，得到反萃取液，利用纳滤设备将反萃取液中的盐离子脱去；再进行真空冷冻干燥，制得谷胱甘肽成品，谷胱甘肽含量为9.892mg/g。

Claims (3)

1.一种利用酿酒酵母S.cerevisiae L5267发酵生产谷胱甘肽的方法。步骤如下：
(1)使用接种针从斜面培养基中挑取酿酒酵母S.cerevisiae L5267转于种子培养基中。(2)对酿酒酵母S.cerevisiae L5267进行扩培，扩培条件：摇床温度28～32℃、转速120r/min，pH自然，振荡培养38～46h，培养完毕后进行平板计数，调整酿酒酵母S.cerevisiae L5267数量级为5×108～8×108cfu/ml。(3)发酵过程:将步骤(2）中扩培后的酿酒酵母接入到培养基进行发酵，发酵条件：装液量为55～60mL，接种量为5.0～8.0%，培养温度为27～30℃，转速为130～150 r/min，培养时间 42～48h，培养完成后即为发酵液待用。(4)将步骤（3）所制得的发酵液旋蒸浓缩，采用微珠涡流法进行细胞破碎，选用微珠直径为0.4～0.5mm，涡流震动频率为3000r/min，在破胞管中进行细胞破碎,得处理后的发酵液。(5) 反胶团萃取处理后的发酵液，纳滤脱盐，真空冷冻干燥，谷胱甘肽产品。
2.根据权利要求书1（3）所述的培养基由以下原料制成：玉米胚粕和玉米淀粉黄浆糖化液100g(DE值大于90)，加入蛋白胨2.5~2.7g、酵母粉2.2~2.5g、L-cys0.4~0.6 g、MgSO4 0.125~0.135 g、肌醇0.0375~0.045g、KCl 1.74~1.86g、蒸馏水250ml，制成培养基，pH自然，灭菌。
3.如权利要求1(5)所述反胶团萃取其特征为：利用7mmol/L Aliquat 366溶于有机溶剂正庚醇制成反胶束对谷胱甘肽进行反胶团萃取，萃取条件：发酵液pH=2.5，反胶束与发酵液体积比为2:1，K+浓度0.08～0.1mol/L，萃取时间12～15min得到萃取液；利用NaCl溶液对谷胱甘肽进行反萃取，反萃取条件：采用1.0-1.2 mol/L的NaCl水相进行反萃取，控制温度为20℃，调节pH值为5.6~5.9得到反萃取液，利用纳滤设备将反萃取液中的盐离子脱去，再进行真空冷冻干燥，制得谷胱甘肽成品。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350731A (zh) * 2021-12-15 2022-04-15 华南理工大学 一种谷胱甘肽的制备方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113912671B (zh) * 2021-11-26 2024-04-19 江西诚志生物工程有限公司 谷胱甘肽分离纯化工艺

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101319244A (zh) * 2008-07-11 2008-12-10 重庆大学 谷胱甘肽冻干粉的制备方法
WO2011061713A1 (en) * 2009-11-21 2011-05-26 Silvia Bradamante Method for the production of extracellular glutathione with high yields
CN107043797A (zh) * 2016-12-26 2017-08-15 泰州学院 一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101319244A (zh) * 2008-07-11 2008-12-10 重庆大学 谷胱甘肽冻干粉的制备方法
WO2011061713A1 (en) * 2009-11-21 2011-05-26 Silvia Bradamante Method for the production of extracellular glutathione with high yields
CN107043797A (zh) * 2016-12-26 2017-08-15 泰州学院 一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QING-LONG CHANG等: "Effect of the cosolvent type on the extraction of a-amylase with reversed micelles: Circular dichroism study", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114350731A (zh) * 2021-12-15 2022-04-15 华南理工大学 一种谷胱甘肽的制备方法

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