CN106220541B - 以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料制备β‑胡萝卜素的方法 - Google Patents
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Abstract
以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料制备β‑胡萝卜素的方法，包括提取和重结晶工艺段，所述的重结晶工艺段采用两步重结晶法，包括下述步骤：B1.将总提取液浓缩至β‑胡萝卜素浓度为5500～6500mg/L，于‑5～10℃保温静置，然后过滤；B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β‑胡萝卜素浓度为5500～6500mg/L，在0～15℃保温静置，然后过滤。本发明的方法无需进行菌丝体干燥直接利用湿菌丝体进行提取，工艺简单节约能耗，全过程仅使用单一有机溶剂，生产过程易于控制，成本低廉，并且可同时保证产品的高纯度和高收率，适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于食品、医药及生化工程领域。更具体涉及一种从三孢布拉氏霉菌菌丝体中提取纯化β-胡萝卜素的方法。
背景技术
类胡萝卜素是一类天然色素的总称，普遍存在于高等植物、藻类及真菌中。尽管，目前已经分离出600多种天然的类胡萝卜素，但是实现工业化生产并广泛应用于食品，药品、饲料等领域的类胡萝卜素产品主要有十种，包括β-胡萝卜素，叶黄素(叶黄素酯)、虾青素、番茄红素、玉米黄质、辣椒红素、胭脂树红、角黄素、β-胡萝卜素醛及其酯。
β-胡萝卜素作为维生素A的前体已经被联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定为A类全营养食品强化剂。目前世界上已有52个国家和地区批准可以使用β-胡萝卜素为产品。β-胡萝卜素具有非常强的抗氧化能力，在保健品、医药、化妆品、食品添加剂等方面具有广阔的应用前景。
天然β-胡萝卜素主要来源于植物，但植物中β-胡萝卜素的含量非常的低，难以满足日益增长的市场需求。微生物具有生长繁殖快、营养需求少、β-胡萝卜素含量高等优点，因此，利用微生物发酵生产β-胡萝卜素是一种理想的方法。而三孢布拉氏霉菌是目前研究最广泛的生产β-胡萝卜素的重要菌株。
目前，从三孢布拉氏霉菌中提取纯化β-胡萝卜素的主要工艺一般包括：菌丝体干燥、细胞破碎、有机溶剂萃取及浓缩等步骤。粗提物一般通过结晶工艺和进一步的分离纯化得到高纯度的β-胡萝卜素晶体产品。
专利WO2011/145113A2将酸化醇预处理后的菌丝体采用溶剂萃取，萃取液经过一定程度的浓缩后低温结晶，晶体过滤后干燥，母液进一步浓缩，该方法得到的β-胡萝卜素晶体产品含量高达99％以上，但破壁效率较低，产品收率低，并且溶剂用量大。
专利CN200910135676.0公开了一种以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料的β-胡萝卜素提取工艺，该方法首先采用真空干燥对菌丝体进行脱水处理，然后采用二氯甲烷进行提取，整个过程仅采用二氯甲烷一种溶剂。但真空干燥能耗较大，且干燥过程中容易造成β-胡萝卜素的降解，加之二氯甲烷有剧毒，溶剂残留不易脱除，必然导致产品不符合国标GB/T28310—2012中对该产品溶剂残留的要求，有较大的食品安全风险。
专利WO2002/0025548A1、CN1472183A、CN101417917A公布了一种从菌丝体中制备含量大于90％的β-胡萝卜素晶体的方法。该方法采用溶剂萃取，萃取液经过水洗后，浓缩结晶获得粗晶体，在经过多次不同溶剂的洗涤得到高含量的晶体。但该方法工艺繁琐，提取过程损失大，收率仅有30～40％。
专利CN1472183A、CN101417917A、CN101870668A等采用低温结晶的方法，虽然得到的β-胡萝卜素晶体纯度可以达到95％以上，但过程中均采用多种溶剂，过程收率也较低。
添加反溶剂促结晶的方法是菌丝体中类胡萝卜素提取常用的一种方法。专利WO01/12832A1(CN1370241A)、WO03/056028A1(CN1617934A)US2005106657A1、AU2011253728A1、US2004067550A1将干燥菌丝体破壁后进行溶剂萃取，萃取液经过浓缩后添加反溶剂结晶，最终获得95％以上含量的类胡萝卜素晶体。但添加反溶剂促结晶的工艺复杂，形成的大量混合溶剂不利于溶剂回收再利用，收率也较低。
以三孢布拉氏霉菌菌丝体做原料制备高纯度β-胡萝卜素晶体的过程目前主要存在工艺复杂、溶剂用量大、收率低、晶体纯度和质量难以保证、形成溶剂交叉使溶剂回收困难等问题，无论从效率还是成本方面均不利于工业化生产。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种高效低成本的、适用于工业化生产的以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料制备β-胡萝卜素晶体的方法。
本发明的以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料制备β-胡萝卜素的方法包括提取和重结晶工艺段，其中所述的重结晶工艺段采用两步重结晶法，包括下述步骤：
B1.将总提取液浓缩至β-胡萝卜素浓度为5500～6500mg/L，于-5～10℃保温静置，然后过滤；
B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β-胡萝卜素浓度为5500～6500mg/L，在0～15℃保温静置，然后过滤。
上述方法的重结晶工艺段中，两次结晶的母液浓度及结晶温度选择是重要的发明点。母液浓度严格不超过6500mg/L，并且为了保证产品的纯度，需设定第二次结晶的温度在一次结晶温度的基础上略有升高。
优选的实施方式中，上述本发明的方法的步骤B1和B2，保温静置的温度分别为0～7℃和10～15℃。
在对结晶母液浓度及结晶温度进行严格控制的前提下，保温静置的时间，即结晶时间并不需要严格限制，本领域的技术人员根据经验及结晶体系的状态能够判断结晶所需的时间。结合考虑工艺过程的时间及结晶效果，在本发明的条件下，所述的步骤B1和B2中，保温静置的时间分别优选2～6小时和1～4小时。
进一步具体的实施方式中，上诉本发明的制备β-胡萝卜素晶体的方法中所述的重结晶工艺段包括下述步骤：
B1.将总提取液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，于0～7℃保温静置2～6小时，然后过滤；
B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，在10～15℃保温静置1～4小时，然后过滤；
B3.合并步骤B1和B2过滤所得的固形物，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。
上述本发明所述的β-胡萝卜素晶体的制备方法中，总提取液通过提取工艺段制备，所述方法中的提取工艺段包括如下步骤：
A1.过滤三孢布拉氏霉菌发酵液，得湿菌丝体，并以乙酸乙酯清洗湿菌丝体；
A2.加入干菌丝体质量10～15倍的乙酸乙酯，机械剪切破壁，然后在30～60℃下保温浸提，过滤得提取液i和滤渣；
A3.分两次向步骤A2所得滤渣中加入质量总计为干菌丝体质量15～20倍的乙酸乙酯，在30～60℃下保温浸提，过滤得提取液ii和提取液iii；
A4.合并提取液i、ii和iii得总提取液。
其中所述步骤A1中的乙酸乙酯用量优选为干菌丝体质量的3～5倍。如无特殊说明，本发明中干菌丝体质量按照下述方法换算：取一定量湿菌丝体在105度下烘干至恒重并计算含水量，再通过含水量折算试验取用的湿菌丝体中干菌丝体的质量。
本发明较为完整的实施方案中，所述β-胡萝卜素的制备方法包括如下步骤：
A1.过滤三孢布拉氏霉菌发酵液，得湿菌丝体，并以干菌丝体质量3～5倍的乙酸乙酯清洗湿菌丝体；
A2.加入干菌丝体质量10～15倍的乙酸乙酯，机械剪切破壁，然后在30～60℃下保温浸提，过滤得提取液i和滤渣；
A3.分两次向所得滤渣中加入质量总计为干菌丝体质量15～20倍的乙酸乙酯，在30～60℃下保温浸提，过滤得提取液ii和提取液iii；
A4.合并提取液i、ii和iii得总提取液；
B1.将总提取液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，于0～7℃保温静置2～6小时，然后过滤；
B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，在10～15℃保温静置1～4小时，然后过滤；
B3.合并步骤B1和B2过滤所得的固形物，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。
其中，所述步骤A2中对菌丝体进行机械剪切破壁的时间为0.1～2小时。优选0.2～1小时。所述步骤A2和A3中每次保温浸提是在45～55℃条件下提取0.5～2小时。所述步骤B3中对过滤所得的固形物的真空干燥是在35～45℃条件下真空干燥8～24小时。
目前，从三孢布拉氏霉菌菌丝体中提取β-胡萝卜素的工艺中，第一步一般需要将菌丝体进行干燥处理，但菌体干燥的能耗较大，并且在菌丝体干燥的过程中，菌丝体中β-胡萝卜素的含量一般会有比较明显的下降，色素含量的下降对整个提取过程的经济性也会产生较大影响，在此技术方案中，提取工艺直接以湿菌丝体作为原料，避免了干燥过程中色素的损失。
本发明的整个优选工艺均在55℃以下的温度条件下进行，并且结晶采用低温结晶的方式，能够有效防止β-胡萝卜素在高温条件下发生降解或者异构化，最大程度上保证了产品的稳定性。
本发明的整个工艺过程只采用乙酸乙酯一种有机溶剂，因此避免了提取过程中采用多种溶剂时会出现的溶剂交叉现象，更加利于有机溶剂的回收及重复利用。
β-胡萝卜素大多存在于菌丝体的内部，导致提取过程中提取率很低，本发明采用在有机溶剂中进行机械破壁的方法，提高了菌丝体中β-胡萝卜素的溶出率，并且细胞破壁和色素提取在该步骤中同时进行，在提高了提取效率的同时，简化了提取工艺，有利于工业化生产。
在现有的β-胡萝卜素晶体制备工艺中，高纯度晶体的获得往往需要通过重结晶或者粗晶体多次洗涤。重结晶通常得到的晶体纯度较高，但这种方法采用的溶剂量大，需要反复结晶，步骤复杂且晶体收率很低；粗晶体洗涤通常需要对于一次结晶得到的粗晶体进行反复的溶剂洗涤以去除晶体表面或内部的杂质，洗涤用溶剂往往和提取溶剂不同，不但步骤繁琐，还会产生溶剂交叉，不利于溶剂回收利用，晶体收率同样难以保证。本发明采用两步结晶的晶体制备工艺，每次制备获得晶体无需进行重结晶或洗涤就能达到较高的纯度，同时两次结晶均在提取液蒸发浓缩至一定β-胡萝卜素浓度时再进行，晶体收率高，两次结晶步骤中，根据提取液浓缩后的杂质含量采用不同的结晶温度，保证了晶体的纯度。
本发明的有益效果是：
(1)可直接采用湿菌丝体作为出发原料，无需经过菌体干燥步骤，节约能耗同时避免了色素含量在菌体干燥过程中的下降；
(2)在有机溶剂中进行破壁；破壁的同时进行提取，菌丝体破壁效果好，提取率高达95％以上，工艺简化，有利于工业化生产；
(3)整个过程仅使用乙酸乙酯一种有机溶剂，无多种溶剂交叉使用情况，溶剂回收方便，产品溶剂残留低，符合国标GB/T 28310-2012要求；
(4)采用本发明的β-胡萝卜素晶体制备方法，可同时保证产品的高纯度和高收率；
(5)本发明的制备方法，相对于现有技术工艺简单、流程短、损失少、成本低，易于实现工业化生产。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的试验方法均为常规方法。
实施例1：
取48g湿菌丝体(折合干菌丝体20g，折干β-胡萝卜素含量为2.41％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得41g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约7000mg/L后，在2℃保温3小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过40℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体0.383g，产品含量93.1％，产品折纯收率73.9％。所得残渣10g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.059％，提取率达到98.78％。
实施例2：
取48g湿菌丝体(折合干菌丝体20g，折干β-胡萝卜素含量为2.41％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤20分钟，过滤得39g湿菌丝体，再加入260g(相当于13倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁20分钟，在45℃下浸提40分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入340g(第一次200g，第二次140g)乙酸乙酯，每次均在45℃下浸提40分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约5400mg/L后，在5℃保温3.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过40℃真空干燥24小时得到β-胡萝卜素晶体0.398g，产品含量90.6％，产品折纯收率74.8％。所得残渣10.8g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.072％，提取率达到98.4％。
实施例3：
取49g湿菌丝体(折合干菌丝体20g，折干β-胡萝卜素含量为2.37％)作为起始原料，加入70g乙酸乙酯常温搅拌洗涤40分钟，过滤得40g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6000mg/L后，在5℃保温3小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过40℃真空干燥18小时得到β-胡萝卜素晶体0.406g，产品含量97％，产品折纯收率83.1％。所得残渣10.8g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.095％，提取率达到97.84％。
实施例4：
取48g湿菌丝体(折合干菌丝体20g，折干β-胡萝卜素含量为2.37％)作为起始原料，加入80g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得38g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在55℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在55℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约10800mg/L后，在5℃保温3小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过40℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体0.327g，产品含量75.8％，产品折纯收率52.3％。所得残渣11.4g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.088％，提取率达到97.9％。
实施例5：
取51g湿菌丝体(折合干菌丝体20.8g，折干β-胡萝卜素含量为2.39％)作为起始原料，加入80g乙酸乙酯常温搅拌洗涤20分钟，过滤得37g湿菌丝体，再加入200g(相当于10倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在55℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入400g(第一次200g，第二次200g)乙酸乙酯，每次均在55℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6200mg/L后，在8℃保温4.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过40℃真空干燥18小时得到β-胡萝卜素晶体0.336g，产品含量97.9％，产品折纯收率66.2％。所得残渣10.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.116％，提取率达到97.6％。
实施例6：
取49g湿菌丝体(折合干菌丝体20.4g，折干β-胡萝卜素含量为2.39％)作为起始原料，加入70g乙酸乙酯常温搅拌洗涤20分钟，过滤得36g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在45℃下浸提40分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在45℃下浸提40分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约5700mg/L后，在零下2℃保温2.5小时，过滤得到β-胡萝卜素晶体，再经过40℃真空干燥12小时得到β-胡萝卜素晶体0.437g，产品含量90.0％，产品折纯收率80.7％。所得残渣12.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.076％，提取率达到98.1％。
实施例7：
取48g湿菌丝体(折合干菌丝体20g，折干β-胡萝卜素含量为2.37％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得38g湿菌丝体，再加入260g(相当于13倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在55℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入340g(第一次200g，第二次140g)乙酸乙酯，每次均在55℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6200mg/L后，在5℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约6200mg/L后，在5℃保温2小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥14小时得到β-胡萝卜素晶体0.479g，产品含量88.6％，产品折纯收率89.5％。所得残渣11.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.105％，提取率达到97.5％。
实施例8：
取51g湿菌丝体(折合干菌丝体20.6g，折干β-胡萝卜素含量为2.37％)作为起始原料，加入80g乙酸乙酯常温搅拌洗涤20分钟，过滤得40g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6000mg/L后，在5℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约6000mg/L后，在13℃保温2小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥12小时得到β-胡萝卜素晶体0.471g，产品含量96.5％，产品折纯收率93.1％。所得残渣10.9g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.095％，提取率达到97.9％。
实施例9：
取47g湿菌丝体(折合干菌丝体20.2g，折干β-胡萝卜素含量为2.43％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得38g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6400mg/L后，在4℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约4800mg/L后，在11℃保温2.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体0.443g，产品含量96.1％，产品折纯收率86.7％。所得残渣12.4g，β-胡萝卜素含量仅为0.065％，提取率达到98.4％。
实施例10：
取48g湿菌丝体(折合干菌丝体20.6g，折干β-胡萝卜素含量为2.35％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得37g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6000mg/L后，在6℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约6000mg/L后，在15℃保温3.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于45℃真空干燥10小时得到β-胡萝卜素晶体0.463g，产品含量94.8％，产品折纯收率90.6％。所得残渣12.8g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.086％，提取率达到97.7％。
实施例11：
取50g湿菌丝体(折合干菌丝体20.2g，折干β-胡萝卜素含量为2.27％)作为起始原料，加入70g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得38g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁17分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约5700mg/L后，在4℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约5700mg/L后，在13℃保温2.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体0.441g，产品含量95.2％，产品折纯收率91.6％。所得残渣11.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.115％，提取率达到97.2％。
实施例12：
取49g湿菌丝体(折合干菌丝体20.8g，折干β-胡萝卜素含量为2.29％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得39g湿菌丝体，再加入260g(相当于13倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁18分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入340g(第一次200g，第二次140g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约5200mg/L后，在5℃保温3.5小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约5200mg/L后，在15℃保温2.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥12小时得到β-胡萝卜素晶体0.422g，产品含量91.2％，产品折纯收率80.8％。所得残渣13.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.066％，提取率达到98.2％。
实施例13：
取52g湿菌丝体(折合干菌丝体21.2g，折干β-胡萝卜素含量为2.33％)作为起始原料，加入80g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得42g湿菌丝体，再加入320g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁17分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入280g(第一次180g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6300mg/L后，在6℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约6300mg/L后，在13℃保温2小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体0.474g，产品含量95.8％，产品折纯收率91.9％。所得残渣12.6g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.088％，提取率达到97.8％。
实施例14：
取51g湿菌丝体(折合干菌丝体20.4g，折干β-胡萝卜素含量为2.35％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得39g湿菌丝体，再加入260g(相当于13倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁18分钟，在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入340g(第一次200g，第二次140g)乙酸乙酯，每次均在50℃下浸提30分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约6800mg/L后，在3℃保温3.5小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约6800mg/L后，在13℃保温2.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥14小时得到β-胡萝卜素晶体0.448g，产品含量88.4％，产品折纯收率82.6％。所得残渣13.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.066％，提取率达到98.2％。
实施例15：
取50g湿菌丝体(折合干菌丝体20.6g，折干β-胡萝卜素含量为2.31％)作为起始原料，加入60g乙酸乙酯常温搅拌洗涤30分钟，过滤得40g湿菌丝体，再加入300g(相当于15倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁15分钟，在55℃下浸提20分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入300g(第一次200g，第二次100g)乙酸乙酯，每次均在55℃下浸提20分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约4800mg/L后，在2℃保温3小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约5800mg/L后，在11℃保温2.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥12小时得到β-胡萝卜素晶体0.400g，产品含量89.2％，产品折纯收率74.9％。所得残渣11.4g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.108％，提取率达到97.4％。
实施例16：
取51g湿菌丝体(折合干菌丝体21.0g，折干β-胡萝卜素含量为2.35％)作为起始原料，加入70g乙酸乙酯常温搅拌洗涤20分钟，过滤得41g湿菌丝体，再加入280g(相当于14倍干菌丝体重量)乙酸乙酯并循环剪切破壁18分钟，在45℃下浸提40分钟，过滤得滤液及残渣，然后分两次向残渣中加入320g(第一次200g，第二次120g)乙酸乙酯，每次均在45℃下浸提40分钟，过滤得滤液及残渣，合并两次滤液并浓缩至β-胡萝卜素浓度约7400mg/L后，在6℃保温3.5小时，过滤得到一次结晶的β-胡萝卜素晶体，滤液进一步浓缩至β-胡萝卜素浓度约6200mg/L后，在8℃保温2.5小时，过滤得到二次结晶的β-胡萝卜素晶体，将两次晶体合并并于40℃真空干燥16小时得到β-胡萝卜素晶体0.466g，产品含量83.2％，产品折纯收率78.6％。所得残渣12.2g，残渣β-胡萝卜素含量仅为0.097％，提取率达到97.6％。
Claims (8)
1.以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料制备β-胡萝卜素的方法，包括提取和重结晶工艺段，其特征在于，所述的重结晶工艺段采用两步重结晶法，包括下述步骤：
B1.将总提取液浓缩至β-胡萝卜素浓度为5500～6500mg/L，于0～7℃保温静置，然后过滤；
B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β-胡萝卜素浓度为5500～6500mg/L，在10～15℃保温静置，然后过滤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤B1和B2中，保温静置的时间分别是2～6小时和1～4小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重结晶工艺段包括下述步骤：
B1.将总提取液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，于0～7℃保温静置2～6小时，然后过滤；
B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，在10～15℃保温静置1～4小时，然后过滤；
B3.合并步骤B1和B2过滤所得的固形物，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的提取工艺段包括如下步骤：
A1.过滤三孢布拉氏霉菌发酵液，得湿菌丝体，并以乙酸乙酯清洗湿菌丝体；
A2.加入干菌丝体质量10～15倍的乙酸乙酯，机械剪切破壁，然后在30～60℃保温浸提，过滤得提取液i和滤渣；
A3.分两次向步骤A2所得滤渣中加入质量总计为干菌丝体质量15～20倍的乙酸乙酯，在30～60℃保温浸提，过滤得提取液ii和提取液iii；
A4.合并提取液i、ii和iii得总提取液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A1.过滤三孢布拉氏霉菌发酵液，得湿菌丝体，并以干菌丝体质量3～5倍的乙酸乙酯清洗湿菌丝体；
A2.加入干菌丝体质量10～15倍的乙酸乙酯，机械剪切破壁，然后在30～60℃保温浸提，过滤得提取液i和滤渣；
A3.分两次向所得滤渣中加入质量总计为干菌丝体质量15～20倍的乙酸乙酯，在30～60℃保温浸提，过滤得提取液ii和提取液iii；
A4.合并提取液i、ii和iii得总提取液；
B1.将总提取液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，于0～7℃保温静置2～6小时，然后过滤；
B2.将步骤B1所得滤液浓缩至β-胡萝卜素浓度5500～6500mg/L，在10～15℃保温静置1～4小时，然后过滤；
B3.合并步骤B1和B2过滤所得的固形物，真空干燥得到β-胡萝卜素晶体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中对菌丝体进行机械剪切破壁的时间为0.1～2小时。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤A2和A3中每次保温浸提是在45～55℃条件下提取0.5～2小时。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤B3中所述的真空干燥是在35～45℃条件下真空干燥8～24小时。
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