CN110407659A - 一种类胡萝卜素提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种类胡萝卜素提取方法，包括：采用高压均质对干菌体进行破壁，再向破壁后的干菌体中加入萃取剂，采用短时高温形成过饱和溶液的方法进行萃取。本发明提取的类胡萝卜素氧化损失小、纯度高、收率高且溶剂残留量极低。

Description

一种类胡萝卜素提取方法

技术领域

本发明涉及生物分离领域。更具体地说，本发明涉及一种类胡萝卜素提取方法。利用该方法可以高效的从发酵液中提取类胡萝卜素。

背景技术

类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素的总称,普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类的黄色、橙红色或红色的色素之中。代表性的类胡萝卜素有β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素。

β-胡萝卜素作为维生素A的前体被人熟知，番茄红素又称ψ-胡萝卜素，属于异戊二烯类化合物，是类胡萝卜素的一种。由于最早从番茄中分离制得，故称番茄红素。过去人们一直认为，只有那些具备β-紫罗酮环并能转化为维生素A的类胡萝卜素，如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素等才与人类的营养和健康有关，而番茄红素因缺乏此结构，不具有维生素A的生理活性，故对此研究很少；然而，番茄红素具有优越的生理功能，它不仅具有抗癌抑癌的功效，而且对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统以及延缓衰老等都具有重要意义，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。天然虾青素(天然虾红素)世界上最强的天然抗氧化剂之一，有效清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力，维持机体平衡和减少衰老细胞的堆积，由内而外保护细胞和DNA健康，从而保护皮肤健康，促进毛发生长，抗衰老、缓解运动疲劳、增强活力。

发酵法生产类胡萝卜素难点在于生产类胡萝卜素的微生物主要为真菌如霉菌或酵母菌，这类真菌的细胞壁结构给破壁带来了较大困难，使得类胡萝卜素由于细胞壁的阻碍较难提取出来。现有技术公开了一种连续提取番茄红素的方法，主要方法是将三孢布拉霉发酵液用乙醇脱水后，再进行干燥得到干菌体，再用正己烷、丙酮、乙酸乙酯或石油醚混合溶剂提取，提取时间为2～4小时。此方法所用化学试剂较多，产生的废水较多，较难处理，处理费用高；另外用正己烷、丙酮、乙酸乙酯或石油醚混合溶剂提取后，溶剂较难重复利用，较难回收。并且其前处理未对菌体破壁，后期有机溶剂提取时间长，比较耗时耗能。现有技术还公开了一种以三孢布拉氏霉菌菌丝体为原料的β-胡萝卜素提取工艺，该方法首先采用真空干燥对菌丝体进行脱水处理，然后采用二氯甲烷进行提取，整个过程仅采用二氯甲烷一种溶剂，但真空干燥能耗较大，且干燥过程中容易造成β-胡萝卜素的降解，加之二氯甲烷有剧毒，溶剂残留不易脱除，必然导致产品不符合国标GB/T 28310—2012中对该产品溶剂残留的要求，有较大的食品安全风险。

由此可见，现有的提取方法主要在于溶剂难处理及产品的纯度和收率难以让人满意，而究其根本主要是受制于提取时菌体的破壁完全度和萃取所采用的方法。破壁不完全会增加萃取工艺的难度，由于类胡萝卜素为还原性的物质，极易氧化，长时间暴露在不稳定环境中会增加其氧化风险。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯度高、收率高的类胡萝卜素提取方法。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种类胡萝卜素提取方法，包括：

将固含量为5～15％的发酵液采用高压均质破壁，压力为50～100MPa，高压均质循环1～3次。生产类胡萝卜素的微生物目前主要是三孢布拉霉菌、红发夫酵母和工程化酿酒酵母，其中三孢布拉霉能够生产β-胡萝卜素和番茄红素，红发夫酵母能够生产虾青素，工程化的酿酒酵母生产番茄红素。

霉菌和酵母尤其是工程化的酵母细胞壁都比较厚，使得破壁非常困难，继而使得产物萃取时受到阻碍，影响后续萃取的萃取率及类胡萝卜素最后的收率。本发明采用高压均质破壁的方法，有效破碎霉菌及酵母菌的细胞壁，使得后续萃取步骤能够顺利进行。

优选的是，将发酵液pH调至8～10，进行高压均质。

优选为，pH调节为10，压力100Mpa，循环1次。

优选的，破壁前，发酵液采用酶预处理0.5～2h，所用的酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、蜗牛酶、葡聚糖酶和磷脂酶的一种或至少两种以上的配伍使用，酶添加量为0.01～0.1％。

优选的，所用的酶为中性蛋白酶、纤维素酶和磷脂酶，配伍比例为(1～3):(5～8)；(1～2)。

优选的，所用的酶为葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，配伍比为(6～8):(1～2):(1～2)。

优选的，酶反应的反应温度为30-55℃。

优选的，根据需要，加入酶前可根据所用酶的组合适当调节pH至6-7.

向破壁后的干菌体中加入萃取剂进行萃取；所述萃取时间为3-12min，萃取温度为60～90℃，得到萃取液。

优选的是，萃取温度为70～90℃；

优选的是，萃取的次数为1～3次。

优选的是，干菌体与萃取剂的用量比为1g:10～50L，且所述干菌体中类胡萝卜素的含量为3％～8％。

实际上，以上破壁步骤和萃取方法已经能够使得萃取剂的选择不再受到限制，但是出于食品安全及工艺安全性考虑，所述萃取剂优选自乙酸乙酯、乙酸丁酯或乙酸异丁酯。

由于类胡萝卜素容易被氧化，通常认为应该在一个较低的温度下或保护气体下进行萃取来保护其含量不受影响，然而较低的温度意味着更长的时间及更大量的溶剂用量，长时间的溶剂接触并无法杜绝氧化或者异构现象；保护性气体意味着更高的成本，并不适用于上规模型的生产。申请人在实际研究中发现，基于前述的破壁方法，采用合适的溶剂在高温下短时快速萃取，结合后续进行的冷冻结晶，实际上，类胡萝卜素氧化的损失很少，依然能够得到令人满意的效果，且提高了其萃取效率。

优选的是，将萃取液进行冷冻结晶或梯度结晶。

优选为萃取液在冷冻结晶前采用孔径为0.25～1μm的过滤器过滤。

优选的是，冷冻结晶的温度为-5～4℃，时间为4～24小时，搅拌转速为50～200rpm/min；或，

梯度结晶时，以10℃为一个梯度，每个梯度时间为2小时，终点温度为0℃。

优选的是，干菌体来自三孢布拉霉、红发夫酵母或酿酒酵母菌，其中酿酒酵母的保藏号为CGMCC NO.13013；三孢布拉霉菌株BT7251(+)CCTCC M 2014378、BT7603(-)CCTCC M2014379。

优选的是，萃取液进行结晶后，晶体采用短链醇洗涤，温度为20～50℃，搅拌转速为50～200rpm/min。短链醇可以使用乙醇，异丙醇和乙二醇等。洗涤条件：洗涤倍数为晶体质量的3-5倍，洗涤次数2-4次，洗涤温度20-50℃。当类胡萝卜素晶体纯度达到90％以上时，由于微生物提取得到的类胡萝卜素的杂质多为脂溶性成分和蛋白，附着在晶体上，很难去除，采用短链醇洗涤可进一步提高类胡萝卜素晶体的纯度。

优选的是，采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度50～70℃，搅拌50～200rpm/min，时间4～8小时。

优选的是，发酵液破壁后萃取前，将发酵液浓缩至固含量为30％～50％，之后真空干燥至水分含量在5％以下。优选为干燥后的干菌体粉碎至80-100目。

本发明至少包括以下有益效果：

1.采用高压均质破壁前对发酵液进行预处理，提高破壁率，有效缩短后续提取时间，提取效率高，操作简单。

2.预处理时采用特定组合酶能够有效减少均质次数，达到更优的破壁效果。

3.采用高温短时的策略进行萃取，有效减少番茄红素萃取步骤的氧化损失。

4.步骤中溶剂可均为单一溶剂，可重复循环使用，安全无毒。

5.菌渣中类胡萝卜素残留含量在0.5％以下，萃取率在96％以上。

6.得到的晶体收率高，纯度高。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本实施例提供了一种番茄红素提取方法，包括以下步骤：

S1.将三孢布拉霉菌发酵，获得含有番茄红素的发酵液，三孢布拉霉发酵液固含量为15％，pH为10，将三孢布拉霉发酵液通过高压均质破壁机破壁，高压均质破壁机破壁的压力为100Mpa，循环次数为1次。

S2.收集破壁后的菌液通过膜过滤浓缩到固含量为50％，真空干燥控制含水量在5％以下、粉碎至80目。

S3.将粉碎后番茄红素含量为5％的干菌体用溶剂萃取，所述溶剂为乙酸丁酯，萃取温度为90℃，萃取1次实现快速萃取，萃取时间为3min，三孢布拉霉干菌体与萃取剂的质量体积比为1:30。

S4.采用过滤器进行过滤，所述过滤器的孔径在0.25μm，将收集的萃取液采用冷冻结晶，温度为-5℃，冷冻结晶4小时。萃取液中的溶剂可直接利用于下一批萃取步骤，无需额外回收步骤。

S5.将晶体在转速为6000rpm/min下离心，之后采用乙醇洗涤晶体，洗涤倍数为10倍，洗涤次数为2次，温度为50℃，搅拌转速为200rpm/min。

S6.纯化后的晶体在转速为6000rpm/min下离心，离心完成后采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度70℃，搅拌100rpm/min，时间4小时，

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1％，萃取率为96.8％，菌渣中番茄红素为0.16％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为82.6％，纯度为98.1％，溶剂残留为0.2％。

实施例2

本实施例提供了一种番茄红素提取方法，包括以下步骤：

S1.将三孢布拉霉菌发酵，获得含有番茄红素的发酵液，三孢布拉霉发酵液固含量为5％，pH为8，将三孢布拉霉发酵液通过高压均质破壁机破壁，高压均质破壁机破壁的压力为50Mpa，循环次数为3次。

S2.收集破壁后的菌液通过蒸发工艺浓缩到固含量为30％，在真空度-0.08以下，温度70℃干燥，之后采用带筛网的粉碎机粉碎，干菌体控制在100目。

S3.将粉碎后的番茄红素含量为8％的干菌体用溶剂乙酸丁酯萃取，萃取温度为80℃，萃取1次，萃取时间为5min，三孢布拉霉干菌体与萃取剂的质量体积比为1:40。

S4.采用过滤器进行过滤，所述过滤器的孔径在1μm，将收集的萃取液采用梯度结晶的方式结晶，以10℃一个梯度，每个梯度时间2小时，终点温度为0℃。萃取液中的溶剂可直接利用于下一批萃取步骤，无需额外回收步骤。

S5.将晶体在转速为4000rpm/min下离心30min，之后采用异丙醇洗涤晶体，洗涤倍数为5倍，洗涤次数为3次，温度为40℃，搅拌转速为100rpm/min。

S6.纯化后的晶体在转速为4000rpm/min下离心30min，离心完成后采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度50℃，搅拌100rpm/min，时间5小时。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为2％，萃取率为96.2％，菌渣中番茄红素为0.3％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为80.8％，纯度为98.3％，气相检测溶剂残留为0.15％。

实施例3

本实施例提供了一种β-胡萝卜素提取方法，包括以下步骤：

S1.将三孢布拉霉菌发酵，获得含有β-胡萝卜素的发酵液，三孢布拉霉发酵液固含量为10％，pH为9，将三孢布拉霉发酵液通过高压均质破壁机破壁，高压均质破壁机破壁的压力为80Mpa，循环次数为3次。

S2.收集破壁后的菌液通过蒸发工艺浓缩到固含量为40％，采用真空干燥控制水分含量在5％以下，之后粉碎干菌体至80目。

S3.将粉碎后的β-胡萝卜素含量为6％的干菌体用乙酸异丁酯溶剂萃取，萃取温度为60℃，萃取2次，每次萃取时间为4min，三孢布拉霉干菌体与萃取剂的质量体积比为1:40。

S4.过滤收集萃取液并结晶，采用冷冻结晶，温度为-2℃，冷冻结晶6小时。

S5.将晶体在转速为2000rpm/min下离心50min，之后采用乙二醇洗涤晶体，洗涤倍数为8倍，洗涤次数为2次，温度为30℃，搅拌转速为50rpm/min。

S6.纯化后的晶体在转速为2000rpm/min下离心50min，离心完成后采用真空干燥。

经过步骤S3番茄红素氧化损失率为4％，萃取率为95.8％以上，菌渣中β-胡萝卜素含量为0.25％。经过S1～S5，最终得到的β-胡萝卜素产品收率为78.3％，纯度为98％，溶剂残留约0.3％。

实施例4

本实施例提供了一种番茄红素提取方法，包括以下步骤：

S1.将酿酒酵母CGMCC NO.13013发酵，获得含有番茄红素的发酵液，酿酒酵母发酵液固含量为15％，pH为10，将酿酒酵母发酵液通过高压均质破壁机破壁，高压均质破壁机破壁的压力为100Mpa，循环次数为1次。

S2.收集破壁后的菌液通过膜过滤浓缩到固含量为50％、干燥控制含水量在5％以下、粉碎至80目。

S3.将粉碎后的番茄红素含量为8％的干菌体用乙酸丁酯溶剂萃取，萃取温度为90℃，萃取1次实现快速萃取，每次萃取时间为3min，酿酒酵母CGMCC NO.13013干菌体与萃取剂的质量体积比为1g:30L。

S4.采用过滤器进行过滤，所述过滤器的孔径在0.25μm，将收集的萃取液采用冷冻结晶，温度为-5℃，冷冻结晶4小时。萃取液中的溶剂可直接利用于下一批萃取步骤，无需回收。

S5.将晶体在转速为5000rpm/min下离心，之后采用乙醇洗涤晶体，洗涤倍数为6倍，洗涤次数为2次，温度为45℃，搅拌转速为200rpm/min。

S6.纯化后的晶体在转速为5000rpm/min下离心，离心完成后采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度70℃，搅拌100rpm/min，时间4小时。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1.2％，萃取率96.6％，菌渣中番茄红素为0.27％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为81.3％，纯度为98.2％，溶剂残留约0.3％。

实施例5

本实施例提供了一种番茄红素提取方法，包括以下步骤：

S1.将酿酒酵母CGMCC NO.13013发酵，获得含有番茄红素的发酵液，酿酒酵母发酵液固含量为5％，pH为8，将酿酒酵母发酵液通过高压均质破壁机破壁，高压均质破壁机破壁的压力为50Mpa，循环次数为3次。

S2.收集破壁后的菌液通过蒸发工艺浓缩到固含量为30％，在真空度-0.08以下，温度70℃干燥，之后采用带筛网的粉碎机粉碎，干菌体控制在100目。

S3.将粉碎后的番茄红素含量为7％的干菌体用乙酸异丁酯溶剂萃取，萃取温度为70℃，萃取1次，每次萃取时间为4min，酿酒酵母CGMCC NO.13013干菌体与萃取剂的用量比为1g:45L

S4.采用过滤器进行过滤，所述过滤器的孔径在1μm，将收集的萃取液采用梯度结晶的方式结晶，以10℃一个梯度，每个梯度时间2小时，终点温度为0℃。萃取液中的溶剂可直接利用于下一批萃取步骤，无需回收。

S5.将晶体在转速为4000rpm/min下离心30min，之后采用乙二醇洗涤晶体，洗涤倍数为5倍，洗涤次数为3次，温度为40℃，搅拌转速为100rpm/min。

S6.纯化后的晶体在转速为4000rpm/min下离心30min，离心完成后采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度50℃，搅拌100rpm/min，时间5小时。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1.2％，萃取率为95.7％，菌渣中番茄红素残留量为0.29％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为80％，纯度为98.3％，溶剂残留约0.3％。

实施例6

本实施例提供了一种番茄红素提取方法，包括以下步骤：

S1.将酿酒酵母CGMCC NO.13013发酵，获得含有番茄红素的发酵液，酿酒酵母发酵液固含量为10％，pH为9，将酿酒酵母发酵液通过高压均质破壁机破壁，高压均质破壁机破壁的压力为80Mpa，循环次数为2次。

S2.收集破壁后的菌液通过蒸发工艺浓缩到固含量为40％，采用真空干燥控制水分含量在5％以下，之后粉碎干菌体至80目。

S3.将粉碎后的番茄红素含量为8％的干菌体用乙酸乙酯溶剂萃取，萃取温度为60℃，萃取3次，每次萃取时间为4min，酿酒酵母CGMCC NO.13013干菌体与萃取剂的用量比为1g:40L。

S4.过滤收集萃取液并结晶，采用冷冻结晶，温度为-2℃，冷冻结晶6小时。

S5.将晶体在转速为2000rpm/min下离心50min，之后采用乙二醇洗涤晶体，洗涤倍数为8倍，洗涤次数为2次，温度为30℃，搅拌转速为50rpm/min。

S6.纯化后的晶体在转速为2000rpm/min下离心50min，离心完成后采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度50℃，搅拌100rpm/min，时间5小时。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为3.6％，萃取率为94.9％，菌渣中番茄红素含量为0.40％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为78％，纯度为97.7％，溶剂残留约0.2％。

实施例7

实施例7采用三孢布拉霉发酵液为原料提取番茄红素，其提取步骤除S5均与实施例1相同，实施例7中的S5将晶体在转速为6000rpm/min下离心，之后采用50℃的热水洗涤晶体，洗涤倍数为10倍，洗涤次数为2次，搅拌转速为200rpm/min，纯化后的晶体在转速为6000rpm/min下离心，离心完成后采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度70℃，搅拌100rpm/min，时间4小时，最终得到的番茄红素产品收率为84.2％，纯度为94％，气相检测溶剂残留为0.1％。

实施例8

实施例8采用三孢布拉霉发酵液为原料提取番茄红素，其提取步骤与实施例1的区别之处在于，S1中不调节pH直接进行后续提取破壁操作，pH为6.5。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1％，萃取率为90.5％，菌渣中番茄红素含量为0.47％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为74％，纯度为98.0％，溶剂残留为0.2％。

实施例9

本实施例主要步骤与实施例1相同，不同之处在于，调节pH破壁前在三孢布拉霉发酵液中加入中性蛋白酶和纤维素酶，添加量为发酵液体积的0.01％，反应温度为40℃，反应时间为1.5h，其中蛋白酶与纤维素酶的比例为2:3。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1％，萃取率为98.0％，菌渣中番茄红素为0.1％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为85.3％，纯度为98.3％，溶剂残留为0.2％。

实施例10

本实施例主要步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，调节pH破壁前在三孢布拉霉发酵液中加入中性蛋白酶、纤维素酶和磷脂酶，添加量为发酵液体积的0.01％，反应温度为40℃，反应时间为1.5h，其中蛋白酶、纤维素酶和磷脂酶的比例为3:5:2。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1％，萃取率为98.7％，菌渣中番茄红素为0.065％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为86％，纯度为98.3％，溶剂残留为0.2％。

实施例11

本实施例主要步骤与实施例2基本相同，不同之处在于，调节pH破壁前在三孢布拉霉发酵液中加入中性蛋白酶和纤维素酶，添加量为发酵液体积的0.05％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中蛋白酶与纤维素酶的比例为2:3。高压均质次数为一次。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1.4％，萃取率为97.8％，菌渣中番茄红素为0.17％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为83％，纯度为98.4％，气相检测溶剂残留为0.15％。

实施例12

本实施例主要步骤与实施例2基本相同，不同之处在于，调节pH破壁前在三孢布拉霉发酵液中加入中性蛋白酶、纤维素酶、磷脂酶，添加量为发酵液体积的0.05％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中蛋白酶、纤维素酶和磷脂酶的比例为3:5:2。高压均质次数为一次。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1.5％，萃取率为98.5％，菌渣中番茄红素为0.12％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为84.7％，纯度为98.4％，气相检测溶剂残留为0.15％。

实施例13

本实施例主要与实施例5基本相同，不同之处在于，调节pH破壁前在酿酒酵母发酵液中加入β-葡聚糖酶和纤维素酶，添加量为发酵液体积的0.1％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中β-葡聚糖酶和纤维素的比例为7:3.高压均质次数为一次。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1.2％，萃取率为98.0％，菌渣中番茄红素残留量为0.14％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为86.5％，纯度为98.3％，溶剂残留约0.3％。

实施例14

本实施例主要与实施例5基本相同，不同之处在于，调节pH破壁前在酿酒酵母发酵液中加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，添加量为发酵液体积的0.1％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中β-葡聚糖酶、纤维素和磷脂酶的比例为6:2:2.高压均质次数为一次

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1.2％，萃取率为98.7％，菌渣中番茄红素残留量为0.09％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为87.4％，纯度为98.5％，溶剂残留约0.3％。

实施例15

本实施例主要步骤与实施例6基本相同，不同之处在于，S1调节pH破壁前在酿酒酵母发酵液中加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，添加量为发酵液体积的0.1％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中β-葡聚糖酶、纤维素和磷脂酶的比例为6:2:2.高压均质次数为一次。S3的萃取次数为1次，酿酒酵母CGMCC NO.13013干菌体与萃取剂的用量比为1g:50L，萃取时间为5min。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为0.9％，萃取率为98.2％，菌渣中番茄红素为0.10％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为87.2％，纯度为98.2％，气相检测溶剂残留为0.15％。

实施例16

本实施例主要步骤与实施例6基本相同，不同之处在于，S1调节pH破壁前在酿酒酵母发酵液中加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，添加量为发酵液体积的0.1％，反应温度为45℃，反应时间为1h，其中β-葡聚糖酶、纤维素和磷脂酶的比例为6:2:2.高压均质次数为一次。S3的萃取温度为50℃。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为0.9％，萃取率为90.3％，菌渣中番茄红素为0.77％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为75.8％，纯度为98.3％，气相检测溶剂残留为0.15％。

对比例1

对比例1采用三孢布拉霉发酵液为原料提取番茄红素，其提取步骤除S3均与实施例1相同，对比例1中的S3将粉碎后番茄红素含量为5％的干菌体用溶剂萃取，所述溶剂为乙酸乙酯，萃取温度为60℃，萃取1次，萃取时间为30min，三孢布拉霉干菌体与萃取剂的用量比为1g:50L。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为10.5％，萃取率为87％，菌渣中番茄红素含量为0.65％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为68％，纯度为96.5％，溶剂残留约0.3％。

对比例2

对比例2采用酿酒酵母发酵液为原料提取番茄红素，其提取步骤除S3均与实施例6相同，对比例2中的S3将粉碎后番茄红素含量为8％的干菌体用溶剂萃取，所述溶剂为乙酸异丁酯，萃取温度为60℃，萃取4次，萃取时间为4min，酿酒酵母干菌体与萃取剂的用量比为1g:30L。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为8.3％，萃取率为95.4％，菌渣中番茄红素量为0.37％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为73.7％，纯度为96.6％，溶剂残留约0.3％。

对比例3

对比例3采用三孢布拉霉发酵液为原料提取番茄红素，其提取步骤除S3均与实施例1相同，对比例3中的S3将粉碎后番茄红素含量为5％的干菌体用溶剂萃取，萃取温度为50℃，萃取1次，萃取时间为50min，三孢布拉霉干菌体与萃取剂的用量比为1g:50L。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为7.8％，萃取率为89.5％,菌渣中番茄红素的量为0.52％。经过S1～S5，最终得到的番茄红素产品收率为70.9％，纯度为97.0％，溶剂残留约0.2％。

对比例4

对比例4采用三孢布拉霉菌为原料提取番茄红素，其S1、S2破壁、干燥步骤，采用真空干燥的干菌体菌体进行研磨破壁，S3及其后的提取步骤均与S1相同。

经过步骤S3的番茄红素氧化损失率为1％，萃取率为72.5％，菌渣中番茄红素为1.4％，最终得到的番茄红素产品收率为62.5％，纯度为98.5％，溶剂残留为0.2％。

本申请中涉及三孢布拉霉菌的实施例皆是采用本申请人自有的三孢布拉霉菌株BT7251(+)CCTCC M 2014378、BT7603(-)CCTCC M 2014379进行发酵，实际并不仅限于此菌株。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (10)

1.一种类胡萝卜素提取方法，其特征在于，包括：固含量为5～15％的发酵液采用高压均质破壁，压力为50～100MPa，高压均质循环1～3次。

2.如权利要求1所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，所述发酵液pH调至8～10，进行高压均质；

优选的，所述发酵液pH调节为10，压力100Mpa，循环1次。

3.如权利要求1所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，破壁前，发酵液采用酶进行预处理0.5～2h，所用的酶选自中性蛋白酶、碱性蛋白酶、纤维素酶、蜗牛酶、葡聚糖酶和磷脂酶的一种或至少两种以上的配伍使用，酶添加量为0.01～0.1％。

4.如权利要求3所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，所用的酶为中性蛋白酶、纤维素酶和磷脂酶，配伍比例为(1～3):(5～8):(1～2)；或者，所用的酶为葡聚糖酶、纤维素酶和磷脂酶，配伍比为(6～8):(1～2):(1～2)。

5.如权利要求1～3任一所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，向破壁后的干菌体中加入萃取剂进行萃取；所述萃取时间为3-12min，萃取温度为60～90℃，得到萃取液；

优选的，萃取次数为1～3次。

6.如权利要求5所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，干菌体与萃取剂的用量比为1g:10～50L，且所述干菌体中类胡萝卜素的含量为3％～8％。

7.如权利要求5所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，将萃取液进行冷冻结晶或梯度结晶；

优选的，冷冻结晶的温度为-5～4℃，时间为4～24小时，搅拌转速为50～200rpm/min；或，

梯度结晶时，以10℃为一个梯度，每个梯度时间为2小时，终点温度为0℃。

8.如权利要求7所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，萃取液进行结晶后，晶体采用短链醇洗涤，温度为20～50℃，搅拌转速为50～200rpm/min。

9.如权利要求8所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，采用真空干燥，真空度-0.09以下，温度50～70℃，搅拌50～200rpm/min，时间4～8小时。

10.如权利要求5所述的类胡萝卜素提取方法，其特征在于，发酵液破壁后萃取前，将发酵液浓缩至固含量为30％～50％，之后真空干燥至水分含量在5％以下。